李 麗 吳 宇 王海波 葉 金 軒志宏劉洪美 王松雪 張 峰 何建洪

(國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院1，北京 100037) (廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心2， 南寧 530021) (?？苾x器(廈門)有限公司3，廈門 361006)

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT) 是黃曲霉、寄生曲霉等代謝產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的化合物，常見的有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2四種，其中以黃曲霉毒素B1的毒性最大，被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌物。黃曲霉毒素廣泛存在于玉米、稻谷、花生、棉籽及一些堅(jiān)果類食品和飼料中。對(duì)人畜有強(qiáng)烈的致病性、致癌性，是危害最嚴(yán)重的真菌毒素之一，受到世界各國的廣泛關(guān)注[1-3]。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的的危害，我國在2016年頒布的《食品中真菌毒素限量》分別規(guī)定了糧油中黃曲霉素B1的限量值[4]。

黃曲霉毒素的檢測方法有很多種，其中薄層色譜法[5]由于溶劑消耗量大、重現(xiàn)性差等原因使用較少，酶聯(lián)免疫吸附法[6]和膠體金試紙條法[7]多用于黃曲霉毒素的快速篩查，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[8-11]主要用于多種真菌毒素同時(shí)監(jiān)測，但由于儀器昂貴，使用成本較高。免疫親和柱具有有機(jī)溶劑消耗少、基質(zhì)干擾少、特異性強(qiáng)、靈敏度高和適用于各種復(fù)雜基質(zhì)的樣品等特點(diǎn)[12,13]，因此免疫親和層析凈化高效液相色譜法是目前國際上普遍采用的黃曲霉毒素精確定量和確認(rèn)的方法[14-16]。大部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)樣品中黃曲霉毒素檢測前處理時(shí)采用手動(dòng)凈化。而手動(dòng)凈化由于過程繁瑣、耗時(shí)長等因素制約，導(dǎo)致每天處理樣本量少。當(dāng)樣品量較大時(shí)，存在時(shí)效性差、人為因素影響大等問題。S. Jinap等[17,18]建立了免疫親和柱在線凈化高效液相色譜法檢測花生、無花果干、紅辣椒粉等樣品中的黃曲霉毒素，但該方法干擾較多，樣本量大時(shí)，容易堵塞色譜柱,且處理結(jié)果時(shí)需要扣除空白才能定量，處理數(shù)據(jù)方法較為復(fù)雜。

基于上述問題，本研究采用全自動(dòng)固相萃取技術(shù)，結(jié)合免疫親和柱建立了全自動(dòng)免疫親和柱固相萃取超高效液相色譜法高通量檢測糧油中黃曲霉毒素的方法。本方法簡化了前處理過程，提高檢測的自動(dòng)化水平和檢測效率，可以滿足大規(guī)模樣品準(zhǔn)確定量的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Fotector Plus全自動(dòng)固相萃取儀，Waters I-Class超高效液相色譜儀，AutoEVA-60全自動(dòng)濃縮氮吹儀，固相萃取儀同，Evergreen TREA黃曲霉毒素免疫親和柱。

甲醇、乙腈：HPLC級(jí)；PBS鹽包、曲拉通-100：分析純；國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100302甲醇中黃曲霉毒素B1；黃曲霉毒素B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)；自然污染黃曲霉毒素有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控樣品：花生油中黃曲霉毒素B1質(zhì)控樣、大米粉中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣、玉米粉中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100386和玉米全粉空白(DON、ZEN、AFS)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備

配制高、中、低三種濃度黃曲霉毒素玉米、糙米和花生油加標(biāo)樣品。

自然污染真菌毒素有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控樣品直接稱量使用。

1.2.2 儀器條件

WATERS I CLASS 配熒光檢測器(大體積流通池)。

色譜柱：Waters BEH-C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)，柱溫：40 ℃。

流動(dòng)相：A相：乙腈∶甲醇(體積比為1∶1);B相：水，A∶B=35∶65，等梯度洗脫。

流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

激發(fā)波長：365 nm；發(fā)射波長463 nm。

1.2.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取(5±0.01) g樣品，加入20 mL 84/16乙腈/水，振蕩提取30 min或均質(zhì)3 min，7 000 r/min離心5 min或定性濾紙過濾，取4 mL上清液加入46 mL 0.1% PBST緩沖液，取全部稀釋液于全自動(dòng)固相萃取儀80 mL上樣架上，運(yùn)行編輯完成的儀器方法對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)凈化(具體步驟詳見表1)。將洗脫液直接與收集架一起轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)氮吹儀內(nèi)于50 ℃以下氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相溶解殘?jiān)┮合嗌V測定。

表1 全自動(dòng)固相萃取步驟

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫親和柱的性能評(píng)價(jià)

免疫親和柱是糧油食品檢測凈化的關(guān)鍵耗材。但是，由于免疫親和柱生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致各品牌免疫親和柱產(chǎn)品性能和質(zhì)量差異較大。因此，需要對(duì)免疫親和柱性能進(jìn)行評(píng)測，主要考察免疫親和柱的柱本底、柱容量和柱回收等參數(shù)。

本研究選取的親和柱柱本底未檢出、柱容量滿足標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》相關(guān)要求的3個(gè)品牌親和柱開展柱回收評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

基于實(shí)際檢測的要求，考察定量限附近、限量值、標(biāo)準(zhǔn)曲線上限附近三個(gè)濃度水平，按照3水平6平行的原則，每批次隨機(jī)抽取18根進(jìn)行評(píng)測。按照1.2.3的方法處理玉米粉陰性樣本，獲得玉米粉陰性樣本的稀釋液，在稀釋液中添加一定量的黃曲霉毒素綜合評(píng)測免疫親和柱的精確性。結(jié)果如表2所示。

表2 不同品牌黃曲霉毒素免疫親和柱柱回收評(píng)價(jià)結(jié)果

從表2可知，品牌A和品牌C黃曲霉毒素免疫親和柱對(duì)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2四種黃曲霉毒素的回收率均在85%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.6%，滿足實(shí)驗(yàn)需要。但是B品牌的黃曲霉毒素免疫親和柱對(duì)AFG2的吸附率較低，回收率低于50%，不適用于本方法的研究。在本實(shí)驗(yàn)中我們隨機(jī)選取同一批次A品牌的免疫親和柱開展后續(xù)研究。

2.2 稀釋液的優(yōu)化

由于免疫親和柱對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性是有限的，所以樣品經(jīng)提取液提取后，需對(duì)提取液進(jìn)行稀釋才可以過柱。考慮到糧食樣本中玉米基質(zhì)較為復(fù)雜，所以分別用水、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1 %曲拉通-磷酸鹽緩沖液(0.1 %PBST)三種稀釋液稀釋玉米粉提取液，考察稀釋液對(duì)檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同稀釋液的比較(n=6)

通過t檢驗(yàn)，兩兩之間沒有顯著區(qū)別，但在實(shí)際操作過程中，由于糧食基質(zhì)較為復(fù)雜，提取后用水或者PBS稀釋，稀釋液比較渾濁，過濾后也沒有明顯的改善。但是加入0.1% PBST后，稀釋液變得澄清，不容易堵柱，譜圖雜峰干擾少。所以選擇0.1%PBST作為稀釋液。

圖1 上樣流速對(duì)黃曲霉毒素回收率的影響(n=6)

2.3 上樣流速的優(yōu)化

為了縮短上樣時(shí)間，同時(shí)保證待測毒素全部吸附到免疫親和柱上，考察玉米空白基質(zhì)加標(biāo)稀釋液在上樣流速分別為每分鐘2、3、5、7 mL時(shí)的柱回收率，結(jié)果如圖1所示，流速為2～7 mL/min時(shí)，四種黃曲霉毒素的回收率均在95 %以上，均符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求[19]。但是7 mL/min時(shí)，檢測結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較其他上樣流速時(shí)較大，因此綜合考慮，選擇5 mL/min的上樣流速，確保時(shí)效性、回收率及精密度最好。

2.4 與手動(dòng)法檢測結(jié)果的對(duì)比

采用本方法和手動(dòng)法分別對(duì)配制的高、中、低三個(gè)濃度梯度的玉米加標(biāo)樣品進(jìn)行雙實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果見圖2，手動(dòng)法和高通量全自動(dòng)固相萃取法回收率均在78%～105%，RSD值小于7.0%，符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》要求。采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異，td小于臨界值，說明兩者之間無顯著性差異。

圖2 本方法和國標(biāo)方法在玉米樣品中加標(biāo)回收率對(duì)比

分別采用本方法和手動(dòng)法每3 h測定中濃度加標(biāo)樣品一次，連續(xù)測定18次。比較兩種方法的重現(xiàn)重復(fù)性，結(jié)果見表4。本方法的重復(fù)性測定標(biāo)準(zhǔn)差和18次測定極差均優(yōu)于手動(dòng)法測定結(jié)果，穩(wěn)定性良好。此外，與常規(guī)手動(dòng)凈化每人1 d處理20個(gè)樣品相比，本方法1 d可凈化并檢測40個(gè)樣品，顯著提高了檢測效率。

表4 本方法和國標(biāo)法連續(xù)測定18次的加標(biāo)回收率

2.5 方法的精密度與準(zhǔn)確度考察

添加量為20 ng/g(以黃曲霉毒素B1計(jì)，其余3種毒素濃度按B1∶B2∶G1∶G2為4∶1∶4∶1混配)的同一批玉米樣品重復(fù)測7 d，每天測6次，做方法精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。采用本方法對(duì)添加黃曲霉毒素的玉米、糙米和花生油樣品進(jìn)行方法回收率檢測。每個(gè)濃度做6 個(gè)平行樣檢測，結(jié)果見表6。本方法的日內(nèi)精密度為1.8 %～3.0 %，日間精密度為1.8 %～4.7 %，加標(biāo)回收率為75%～104%。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 臺(tái)間差考察

隨機(jī)選擇兩臺(tái)設(shè)備分別對(duì)花生油中黃曲霉毒素B1質(zhì)控樣(Peanut oiL-AFB1-2018)、大米粉中黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮質(zhì)控樣(RICE-ZEN&AFB1-2018)、玉米粉中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100386)進(jìn)行雙實(shí)驗(yàn)檢測，具體操作：質(zhì)控樣品經(jīng)振蕩提取后，提取液分成2份，分別用全自動(dòng)固相萃取儀1和2配合免疫親和柱凈化處理，上機(jī)檢測，結(jié)果見表7。

表7 臺(tái)間差及方法準(zhǔn)確度結(jié)果(n=6)

采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩臺(tái)設(shè)備的檢測結(jié)果是否存在顯著性差異，兩臺(tái)儀器測定玉米粉中黃曲霉毒素B1(GBW(E)100386)結(jié)果統(tǒng)計(jì)td值為-0.347 8，小于臨界值t0.01,5為4.032 1說明兩臺(tái)儀器間沒有臺(tái)間差檢測結(jié)果無顯著性差異。同理，大米粉中AFB1和花生油中AFB1質(zhì)控樣測定結(jié)果也可以得到相同的結(jié)論，滿足LS/T 6402—2017《糧油檢驗(yàn) 設(shè)備和方法標(biāo)準(zhǔn)適用性驗(yàn)證及結(jié)果評(píng)價(jià)一般原則》[20]的要求。同時(shí)，3個(gè)質(zhì)控樣的測定結(jié)果均在給定值不確定度范圍之內(nèi)，說明本方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.7 儀器空白考察

隨著全自動(dòng)固相萃取儀器使用次數(shù)的增加，有可能會(huì)有待測物殘留的情況。因此每次處理樣品前后對(duì)儀器空白的監(jiān)測非常必要。圖3是連續(xù)5次的儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比色譜圖，可以看出儀器無殘留現(xiàn)象。

圖3 儀器空白與標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)比圖

2.8 方法不確定度考察

依據(jù)《化學(xué)分析中的不確定度的評(píng)估指南》[21]、 國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評(píng)定與表示》[22]，對(duì)本研究建立的全自動(dòng)免疫親和固相萃取超高效液相色譜法測定樣品中黃曲霉毒素 B1含量進(jìn)行不確定度分析評(píng)定，提高實(shí)驗(yàn)精度，為正確評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)提供參考。

檢測方法的不確定度分量主要有稱量、移液等引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度、回收率引入的不確定度和儀器穩(wěn)定性引入的不確定度等(見圖4)。

圖4 不確定分量來源圖

2.8.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)已建立的檢測方法，得出樣品中黃曲霉毒素B1的含量計(jì)算公式。

式中：X為試樣中待測毒素的含量/μg/kg；C為試樣中待測毒素按照外標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的濃度/ng/mL；V1為試樣提取液的體積/mL；V2為用于凈化移取的樣品提取液/mL；V3為洗脫后最終定容體積/mL；m為試樣稱樣量/g。

2.8.2 各分量不確定度的評(píng)定

2.8.2.1 B類不確定度uB

實(shí)驗(yàn)過程中，有些不確定度分量是由非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法獲得的，稱之為B類不確定度。B類不確定度主要包括質(zhì)量、體積等。在本研究中B類不確定度見表8。

表8 稱量、移液等引入的不確定度分量

2.8.2.2 實(shí)驗(yàn)過程中黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度uc

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液自身的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度3部分組成。

1)黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度uc-1

黃曲霉毒素B1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW(E)100302濃度m1=1.96 μg/mL，擴(kuò)展不確定為0.09 μg/mL(k=2)，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度是：

2)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的不確定度uc-2

黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為2、5、10、20、50 ng/mL，流動(dòng)相定容。配制過程及引入的不確定度如表9所示。

根據(jù)表9可知，高效液相色譜法配制標(biāo)準(zhǔn)系列工作液時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)不確定度為：

=1.74%

表9 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制引入的不確定度

3)超高效液相色譜法中黃曲霉毒素B1線性擬合引入的不確定度uc-3

采用5個(gè)濃度梯度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用UPLC重復(fù)測定3次，得到相應(yīng)的峰面積，利用數(shù)據(jù)處理軟甲擬合得到線性回歸方程為Yi=a×Xi+b，式中：a為斜率；b為截距。測定結(jié)果及數(shù)據(jù)計(jì)算見表10。

表10 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

糧食樣品中黃曲霉毒素B1重復(fù)測定6次，其測定結(jié)果見表11。

表11 黃曲霉毒素B1平行測定結(jié)果/ng/mL

則由工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度計(jì)算公式如下：

式中：S為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算方法為：

2.8.2.3 方法回收率引入的不確定ure

表12 黃曲霉毒素B1加標(biāo)回收測定結(jié)果

因此，回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.8.2.4 黃曲霉毒素B1重復(fù)測量引入的不確定度urep

樣品中黃曲霉毒素B1含量獨(dú)立重復(fù)測定6次,測定結(jié)果見表11。

3.8.2.5 高效液相色譜儀器穩(wěn)定性引入的不確定度us

2.8.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展uX

將各分量合成，計(jì)算花生油中黃曲霉毒素B1相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

由實(shí)驗(yàn)可知，試樣中黃曲霉毒素B1的含量為15.70 μg/kg，取置信概率=95%,包含因子k=2，則試樣中黃曲霉毒素B1的擴(kuò)展不確定為UX=1.16 μg/kg。

試樣中黃曲霉毒素Bl的測量結(jié)果為：(15.70±1.16) μg/kg，k=2。

2.8.4 主要不確定度來源的相對(duì)貢獻(xiàn)

根據(jù)各來源的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算相應(yīng)的所占百分比，評(píng)定相對(duì)貢獻(xiàn)。由表13可知,標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的不確定度貢獻(xiàn)最大，其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線配制和回收率。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、規(guī)范操作減小移液定容過程中產(chǎn)生的不確定度有助于降低檢測結(jié)果的不確定度。此外，提高實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)技能及使用儀器設(shè)備的熟練操作、檢測儀器的良好維護(hù)也有助于不確定度的減少。

表13 主要不確定度來源的相對(duì)貢獻(xiàn)

3 結(jié)論

免疫親和柱全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜法的加標(biāo)回收率為 85%～104%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～3.0% ，日間精密度為1.8%～4.8%。測定三種基體質(zhì)控物質(zhì)的結(jié)果均在標(biāo)示值范圍內(nèi)，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。通過配對(duì)t檢驗(yàn)，儀器間無顯著臺(tái)間差，多次重復(fù)驗(yàn)證無儀器殘留，方法穩(wěn)定性優(yōu)于手動(dòng)法。利用本方法對(duì)試樣中黃曲霉毒素B1測量不確定度進(jìn)行了分析評(píng)定，不確定度的主要來源是標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、標(biāo)準(zhǔn)曲線配制和回收率，在實(shí)驗(yàn)過程中高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、規(guī)范操作減小移液定容過程中產(chǎn)生的不確定度有助于降低檢測結(jié)果的不確定度。本方法能夠最大限度地減少實(shí)驗(yàn)人員的工作量，提高工作效率，還可避免因人員操作導(dǎo)致的結(jié)果偏差，適用于大量糧油中黃曲霉毒素的精準(zhǔn)測定。