劉雨萱，黃曉紅，徐曄，牛淑慧，王藝倫，楊壹芳，肖子涵，余沁心，劉書亮，敖曉琳，陳姝娟，劉愛平，何利，楊勇

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，四川 雅安，625014)

N-亞硝胺(nitrosamines, NAs)是由亞硝酰離子與胺類物質(zhì)反應(yīng)生成的一類致癌物質(zhì)，廣泛存在于煙草、化妝品、食品、橡膠制品等環(huán)境中。在食源性污染方面，該物質(zhì)常見于腌肉、烤肉、咸魚等肉類加工食品中。膳食攝入的硝酸鹽、亞硝酸鹽在體內(nèi)都能被轉(zhuǎn)換為N-亞硝胺[1]。越來越多的流行病學(xué)研究證明N-亞硝胺及其前體物質(zhì)的攝入量同直腸癌、胃癌、食管癌等癌癥的發(fā)病風(fēng)險成正相關(guān)[2]，這引起了人們的高度關(guān)注。鑒于N-亞硝胺對人體危害較大，世界衛(wèi)生組織將其列為高危致癌物，故進一步了解N-亞硝胺對保護人體健康、完善食品安全體系，推動食品衛(wèi)生安全的健康發(fā)展具有積極意義。

傳統(tǒng)的N-亞硝胺控制方法分為物理和化學(xué)方法，但這些方法控制效率較低，操作不易且可能帶來不良的風(fēng)味，逐漸不能滿足人們的預(yù)期。近年來，越來越多的學(xué)者將目光投向更為有效的生物控制法。生物控制法是一種利用微生物降低N-亞硝胺含量的方法，通常采用清酒乳桿菌、彎曲乳桿菌、乳球菌等乳酸菌進行發(fā)酵，因其不僅能降低N-亞硝胺含量，還能協(xié)調(diào)肉制品風(fēng)味、延長產(chǎn)品保質(zhì)期、操作易于標準化等優(yōu)點而逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本文將對肉制品中N-亞硝胺的種類、毒性、市售肉制品及水產(chǎn)品中N-亞硝胺含量、形成方式及其控制方法進行綜述，并將重點介紹乳酸菌對肉制品中N-亞硝胺的控制研究現(xiàn)狀，有助于人們充分認識N-亞硝胺對健康的危害，了解市售常見肉制品和水產(chǎn)品中的N-亞硝胺的含量，明確N-亞硝胺形成的基本條件和轉(zhuǎn)化途徑，清楚乳酸菌發(fā)酵對N-亞硝胺的減除效果，同時也可以為進一步利用乳酸菌控制N-亞硝胺的機理研究提供參考。

1 肉類制品N-亞硝胺的闡述

1.1 肉類制品中N-亞硝胺的致癌毒性研究

對迄今已知的300余種N-亞硝胺化合物的研究，發(fā)現(xiàn)90%以上的N-亞硝胺皆具有致癌性、毒性[3]，并且該毒性可通過母嬰血胎屏障，傳遞給胎兒。實驗證明長時間小劑量或者一次性大劑量攝入N-亞硝胺類化合物都會引發(fā)癌癥及肝損傷[4]。N-亞硝胺致癌機制在傳統(tǒng)上被認為包括3個生物學(xué)過程，即:(1)N-亞硝胺在靶器官或靶細胞中活化為烷基化陽離子；(2)DNA烷基化造成遺傳損傷并誘導(dǎo)修復(fù)；(3)DNA修復(fù)無效導(dǎo)致基因突變并引發(fā)癌癥[1, 4]。近年來發(fā)現(xiàn)慢性炎癥對癌癥有關(guān)鍵作用，而N-亞硝胺能夠激活炎癥反應(yīng)的信號通路，所以N-亞硝胺致癌還可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)[5-6]。

雖然食品中天然存在的N-亞硝胺含量很少，但其含有豐富的前體物質(zhì)，在滿足條件的適宜環(huán)境下即可轉(zhuǎn)化為N-亞硝胺類化合物[7]。研究發(fā)現(xiàn)肉制品中N-亞硝胺類化合物含量較高且研究較為深入的是N-二甲基亞硝胺、N-二乙基亞硝胺、N-二丙基亞硝胺、N-吡咯烷亞硝胺、N-呱啶烷亞硝胺[8]等。通過動物學(xué)實驗證明，毒性最強的是N-二甲基亞硝胺，其半數(shù)致死量為58 mg/kg，具有急性和慢性肝毒性和腎毒性[9]。如果青少年一次性服用N-二甲基亞硝胺高于300 mg、成人一次性服用高于1 200 mg，則可導(dǎo)致死亡[10]。除此之外，揮發(fā)性N-亞硝胺中N-二乙基亞硝胺，也是有著較強的致癌活性物質(zhì)之一[11]。

表1 常見N-亞硝胺種類分子式、結(jié)構(gòu)式及半致死量

1.2 市場銷售的肉類制品與水產(chǎn)品中的N-亞硝胺含有量

隨著N-亞硝胺的毒性研究越來越多，各國對肉制品中N-亞硝胺殘留量也越來越重視，國際上陸續(xù)發(fā)布了對N-亞硝胺的含量限定的標準。我國食藥監(jiān)局在GB 2762—2017《食品中污染物限量標準》規(guī)定，肉制品中N-二甲基亞硝胺物質(zhì)限量為3.0 μg/kg，水產(chǎn)品中為4.0 μg/kg；加拿大食藥監(jiān)局規(guī)定N-二甲基亞硝胺的含量不得超過10 μg/kg；美國在食品藥品中對N-亞硝胺限定，該物質(zhì)含量同比不得超過10 μg/kg。

許多學(xué)者[12-18]對市面上的紅腸等常見肉制品中N-亞硝胺含量進行了檢測，結(jié)果如表2所示。

表2 市售原料肉、肉制品及水產(chǎn)品中N-亞硝胺含量 單位：μg/kg

N-亞硝胺含量在不同種類肉制品之間，因其原料肉富含的營養(yǎng)成分與比例的不同而存在著一定差異；同類肉制品中，受地域差異、制作方式、烹飪習(xí)慣等因素影響，也存在較大差異。

根據(jù)表2含量對比得出，同一個地區(qū)，不同種類的肉制品之間存在較大差異。余衛(wèi)軍[18]采用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定了市售咸魚及市售臘腸中N-亞硝胺的含量，對比發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中N-亞硝胺含量通常比禽肉制品中N-亞硝胺含量高，這是因為水產(chǎn)品富含較多的不飽和脂肪酸，其中的假亞硝基衍生物會在加熱時釋放亞硝基化合物N2O3。該化合物易與胺類物質(zhì)反應(yīng)生成N-亞硝胺[19]，造成N-亞硝胺的檢測量升高。

對比王凱麗[12]、余衛(wèi)軍[18]對市售紅腸與市售臘腸的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種類的肉制品中N-亞硝胺的含量因其制作工藝不同，存在一定差異。HERRMANN等[14]對比了丹麥和比利時的Salami香腸、培根、火腿中N-亞硝胺含量得出，同種肉制品受地域差異、飲食習(xí)慣等因素影響，也會存在一定差異。對比YURCHENKO等[15]、楊華等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，同種肉制品中，不同部位的肉與不同的烹飪方式也對N-亞硝胺的含量有著較大的影響。

通過市售原料肉、肉制品及水產(chǎn)品中N-亞硝胺含量與食品衛(wèi)生標準對比得出，目前國內(nèi)外市面上的肉制品都存在部分樣品中N-亞硝胺含量超標的現(xiàn)象。

1.3 肉類制品中N-亞硝胺化合物的轉(zhuǎn)化機制

目前認為，N-亞硝胺主要是由亞硝化試劑中的亞硝酰離子與胺類物質(zhì)發(fā)生取代反應(yīng)所形成[16]。

肉制品中的亞硝酰離子大部分來自于亞硝酸鹽。亞硝酸鹽因其具有良好的防腐、護色等作用常被作為一種食品添加劑運用于肉類加工中，且已被證明其含量與N-亞硝胺含量呈正相關(guān)[15, 20-21]。亞硝酸鹽在酸性條件下轉(zhuǎn)化為亞硝酸。因亞硝酸的不穩(wěn)定性，易分解成為亞硝酐(N2O3)。亞硝酐是一種活性的亞硝化反應(yīng)產(chǎn)生的化合物質(zhì)，可與胺類物質(zhì)亞硝基化反應(yīng)最終形成亞硝胺[22]。除此之外，在肉制品的熏制加工過程，容易產(chǎn)生氣態(tài)氮氧化物。該物質(zhì)是亞硝酰離子的重要來源。肉制品中發(fā)生亞硝化反應(yīng)的胺類往往是二級胺，其一部分來自蛋白質(zhì)的過度氧化，另一部分則來自肉中本身所含的生物胺發(fā)生的環(huán)化反應(yīng)和脫氨基反應(yīng)[23-24]。

N-亞硝化反應(yīng)如下：

NaNO2+H+→HNO2+Na+

HNO2+H+→NO++H2O

2HNO2→N2O3+H2O

N2O3→NO+NO2

R2NH+NO+→R2NH-N=O+H+

2 N-亞硝胺的生物控制技術(shù)的研究進展

由于超量的N-亞硝胺對人體存在強致癌性及遺傳毒性的危害。在食品安全方面，如何控制食品中N-亞硝胺含量，是近年來食品安全領(lǐng)域重點的研究方向之一。目前常用的控制方法根據(jù)其應(yīng)用技術(shù)的原理不同可分為三類：物理方法、化學(xué)方法及生物方法。物理方法常用熱降解、輻照降解及改進包裝方式來進行控制。RYWOTYCKI[25]發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌可減少罐頭中N-亞硝胺的含量。王凱麗[12]發(fā)現(xiàn)超高壓處理的香腸在貯藏過程中N-亞硝胺含量也會降低。輻照處理可以破壞亞硝酸鹽的分子結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生大量自由基，使得N-亞硝胺的含量有一定的降低；輻照還可以直接分解N-亞硝胺[26]。二氧化碳充氣包裝通常比真空包裝抑制N-亞硝胺生成效果好，真空包裝的效果則好于不包裝，這可能是由于氧氣濃度導(dǎo)致的。化學(xué)方法則常采用添加抗氧化劑和亞硝酸鹽替代的方法降低N-亞硝胺含量。多酚[27]、抗壞血酸[28]、中草藥[29]等中的抗氧化成分能夠?qū)⑷庵破分袣埩舻膩喯跛猁}等還原，同時可以清除部分NO+。在亞硝酸鹽替代上常用紅曲色素[30]、番茄紅素[20, 31]、乳酸鏈球素等。

目前的研究表明，生物控制一方面降解或抑制N-亞硝胺前體物質(zhì)的生成，另一方面則轉(zhuǎn)化已生成的N-亞硝胺或直接降解N-亞硝胺。

乳酸菌很早便被運用于肉制品的加工過程中，它能夠改善產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)，促進發(fā)酵肉制品的特殊風(fēng)味形成、改善其色澤、有效提升了肉類制品中的食用可靠性[32-35]。近年來研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以通過降低亞硝酸鹽含量[14, 36-41]、降低生物胺含量[42-44]、阻斷N-亞硝胺的形成[19,45-46]以及直接降解N-亞硝胺[37,43,47-50]等4種途徑，有效降低肉制品中N-亞硝胺含量。

2.1 乳酸菌種類對于食品中亞硝酸鹽的控制技術(shù)

亞硝酸鹽因其優(yōu)良的發(fā)色作用及防腐作用而常常被作為食品添加劑加入到肉制品生產(chǎn)過程中，HERRMANN等[14]發(fā)現(xiàn)添加到香腸中的亞硝酸鹽與N-亞硝胺的殘余量成正相關(guān),故而在食品加工的安全把控環(huán)節(jié)，我們可以通過有效減少食品中的亞硝酸鹽含有量，從而減低N-亞硝胺。

張興吉等[36]的研究表明副干酪乳桿菌、短乳桿菌具有高效、穩(wěn)定的降解亞硝酸鹽的能力。XIAO等[37]在MRS肉湯中評估戊糖片球菌的亞硝酸鹽消耗能力，發(fā)現(xiàn)其能直接降解亞硝酸鹽。SUN等[38]在哈爾濱干香腸中接種戊糖乳桿菌、彎曲乳桿菌、清酒乳桿菌，發(fā)現(xiàn)相較于對照組而言，發(fā)酵9 d后3組中亞硝酸鹽含量均降低了，且降低效果為彎曲乳桿菌>戊糖乳桿菌>清酒乳桿菌，N-亞硝胺含量與此結(jié)果一致。其中彎曲乳桿菌減低的效果最顯著。而戊糖乳桿菌僅對N-二丙基亞硝胺、N-亞硝基二苯胺有顯著降低，清酒乳桿菌降低效果較差。這說明一些乳酸菌具有降低亞硝酸鹽的能力，且其降低能力因菌種的不同而有所差異?？偨Y(jié)常見降低亞硝酸鹽的乳酸菌主要由植物乳桿菌、短乳桿菌、乳球菌和乳球鏈球菌等[39]。探究乳酸菌降低亞硝酸鹽的機理，重點可以細分成酶降解和酸降解2個階段。在發(fā)酵前期即pH值>4.5時，主要是降解產(chǎn)亞硝酸鹽的還原酶和抑制產(chǎn)硝酸鹽還原酶的菌生長，隨著發(fā)酵的進行，產(chǎn)生的乳酸使pH值降低，當pH值降低至4.0以下時變?yōu)樗峤到鉃橹鱗40]。

GE等[41]從金華火腿中分離出植物乳桿菌NJAU-01作為干腌發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑，研究過程中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌可以將肉中的棕色高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)化成為紅色的亞硝基肌紅蛋白，產(chǎn)生與亞硝酸鹽相當?shù)念伾?。這表明部分乳酸菌能取代亞硝酸鹽的發(fā)色功能，為其作為亞硝酸鹽替代劑提供可能。

2.2 乳酸菌對食品中生物胺的控制技術(shù)

生物胺是肉制品中常見的一種胺類化合物，它與亞硝酐共同作用生成N-亞硝胺，是N-亞硝胺的前體物質(zhì)，所以降低N-亞硝胺可以從降低生物胺入手。SUN等[42]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌及木糖鏈霉菌可以有效的抑制哈爾濱干香腸中尸胺、腐胺、色胺、2-苯乙胺、組胺和酪胺含量。許女等[43]的研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumCP3含有能降解生物胺的sufⅠ基因，并且不會包含生物胺生成基因：hdc、tdc、odc等。該物質(zhì)還能夠有效減少食品中腐胺、尸胺、酪胺、組胺及亞精胺含量。充分抑制N-二甲基亞硝胺、N-二乙基亞硝胺及甲基乙基亞硝胺的生成。這說明降低生物胺能夠抑制N-亞硝胺，而一些乳酸菌能夠降低生物胺。當然，并不是所有的N-亞硝胺都與生物胺含量有關(guān)，例如N-亞硝基嗎啡，它是由嗎啡產(chǎn)生[24]，故不能用降低生物胺的乳酸菌進行降解。

2.3 乳酸菌控制N-亞硝胺的轉(zhuǎn)化機制

N-亞硝胺是在酸性條件下形成，魏法山[19]研究表明pH值每降低1個單位，N-亞硝胺形成的速度就會加快10倍。但當pH值過低時，將抑制硝酸鹽還原菌的活性，同時導(dǎo)致胺類物質(zhì)質(zhì)子化。尹立輝等[45]的研究顯示在較低的反應(yīng)區(qū)間內(nèi)，隨著pH值的升高，N-二甲基亞硝胺的含量增大，在pH值為3時最大，但當pH為5時，N-二甲基亞硝胺下降率為96.4%，故乳酸菌產(chǎn)酸能力及最適pH將影響N-亞硝胺的形成。XIAO等[37]發(fā)現(xiàn)接種了戊糖乳桿菌的香腸N-亞硝胺含量降低，他推測這可能是因為戊糖乳桿菌降低了pH值最終降低了亞硝胺。BERARDO等[46]認為在較低的pH條件下能夠減緩蛋白質(zhì)氧化，從而控制N-亞硝胺的生成。

2.4 乳酸菌對N-亞硝胺分解技術(shù)

NOWAK等[47]在乳酸菌胞內(nèi)提取液中檢測到了N-二甲基亞硝胺，推測乳酸菌降低亞硝胺的機理是降解或吸附。但這與肖亞慶[39]的結(jié)果不一致，肖亞慶在全細胞提取液中并未檢測到N-亞硝胺的存在，認為只有降解作用，沒有吸附作用。肖亞慶[39]推測這可能是因為N-亞硝胺首先被乳酸菌細胞吸附，隨后再經(jīng)代謝降解，NOWAK等[47]在測定時，N-二甲基亞硝胺標品濃度選擇較高，為10 μg/mL，這時乳酸菌的降解速度低于吸附速率，所以測定時細胞內(nèi)還存留有N-亞硝胺。故我們這里只討論乳酸菌直接降解N-亞硝胺。

KIM等[48]將明串珠菌、腸膜明串珠菌屬、乳酸桿菌和清酒乳桿菌接種在含有N-二甲基亞硝胺的MRS肉湯中，結(jié)果表明4種細菌皆可降解N-二甲基亞硝胺，且乳酸桿菌、清酒乳桿菌效果更顯著。LIAO等[49]將植物乳桿菌120、釀酒酵母2018和木糖乳桿菌135接種至含有N-二甲基亞硝胺的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)3株菌均可以降解N-二甲基亞硝胺，其中植物乳桿菌120降解率最高。許女等[43]發(fā)現(xiàn)L.plantarumCP3聯(lián)合接種L.sakiM4含有協(xié)作效應(yīng)，能顯著地降解N-亞硝胺。肖亞慶[39]在研究L.pentosusR3時發(fā)現(xiàn)，當接種濃度為107CFU/mL和108CFU/mL 時N-亞硝胺含量有明顯降低，而106CFU/mL則沒有；發(fā)酵溫度超過30 ℃時N-亞硝胺含量呈現(xiàn)顯著性降低；發(fā)酵時間超過20 h時N-亞硝胺含量呈現(xiàn)顯著性降低；在不同氧氣含量的培養(yǎng)條件下降解N-亞硝胺含量能力沒有顯著變化，故乳酸菌直接降解N-亞硝胺的能力受到菌種、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間的影響，與氧氣含量沒有顯著關(guān)系。

肖亞慶[39]還通過比較L.pentosusR3的無細胞上清液與全細胞懸液、全細胞懸液與全細胞提取液、胞內(nèi)提取液與細胞碎片懸液降解N-亞硝胺的能力，確定了降解N-亞硝胺的成分位于細胞碎片懸液中，可能位于細胞壁或細胞膜上，通過胰蛋白酶處理，確定降解亞硝胺的成分大多數(shù)為蛋白質(zhì)。肖亞慶[37]對比了細胞碎片全蛋白和表層蛋白的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測定結(jié)果如圖1所示，二者近乎相似，故推測L.pentosusR3降解N-亞硝胺的蛋白質(zhì)是表層蛋白，他推測表層蛋白可能為吸收、降解N-亞硝胺的酶提供位點，或其本身就是N-亞硝胺的降解酶。表層蛋白并非所有細菌都有，它是一種以非共價鍵附著在細胞壁外的蛋白質(zhì)，在細胞蛋白含量中最高，通常采用嗜潮性試劑(如鹽酸胍)和解離劑(如5 mol/L氯化鋰)解離并溶解成蛋白質(zhì)單體用于SDS-PAGE分析。通過質(zhì)譜儀測定，L.pentosusR3中的表層蛋白，為假定蛋白，即目前沒有發(fā)現(xiàn)其功能的蛋白。

A-細胞碎片前蛋白；B-表層蛋白Mareker-標準蛋白； Ls-清酒乳桿菌；Pp-戊糖片球菌；Lf-發(fā)酵乳桿菌；Sx-木糖葡萄球菌；Lp-戊糖乳桿菌圖1 細胞碎片全蛋白和表層蛋白SDS-PAGE結(jié)果

李秀明等[50]同樣證明了乳酸菌發(fā)酵劑PRO-MIX5能直接降解N-亞硝胺，且實驗證實，菌體碎片是起抑制作用的關(guān)鍵。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于紅腸和培根。實驗測定菌體碎片的加入量為0.05%時降解率最高，分別為41.04%和13.8%。但當提高菌體碎片含量時，抑制效果反而降低，N-亞硝胺含量甚至高于空白組。

這四方面并非單一作用，往往是同時起作用。肖亞慶[37]的研究證明L.pentosusR3降低N-亞硝胺的含量是因其表層蛋白的存在，直接降解了N-亞硝胺，同時L.pentosusR3還會通過降低pH、水分活度，從而抑制亞硝酸鹽、生物胺等前體物質(zhì)形成，減少食品中N-亞硝胺物質(zhì)的含量。

3 總結(jié)與展望

N-亞硝胺作為一種肉制品加工過程中產(chǎn)生的常見有害物質(zhì)，因其強烈的致癌、致畸、致突變等毒性，受到了人們的廣泛關(guān)注。國內(nèi)外大量的研究和調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前市面上仍存在部分產(chǎn)品中N-亞硝胺含量超標的現(xiàn)象，特別是在非工業(yè)化生產(chǎn)的肉制品和水產(chǎn)品中尤為嚴重?，F(xiàn)有研究表明，長期食用此類產(chǎn)品可增加多種癌癥的患病風(fēng)險，故控制N-亞硝胺的含量對于食品質(zhì)量和安全尤為重要。采用生物控制方式降低N-亞硝胺因其成本低、安全性高且能提高產(chǎn)品質(zhì)量而倍受人們關(guān)注，進而也成為近年來食品安全控制領(lǐng)域研究的熱點之一。在生物控制N-亞硝胺的研究中，利用乳酸菌接種發(fā)酵最為廣泛。研究證明，乳酸菌可以通過降低亞硝酸鹽含量、降低生物胺含量、轉(zhuǎn)化N-亞硝胺以及直接分解N-亞硝胺4種途徑，使食品中N-亞硝胺的含量下降。

目前，關(guān)于食品中N-亞硝胺的形成機制已較為清楚，但關(guān)于生物控制方法特別是乳酸菌對N-亞硝胺的降解機理及其降解產(chǎn)物研究仍不夠充分，今后需要進一步采用現(xiàn)代分子生物學(xué)和組學(xué)等技術(shù)，研究降解N-亞硝胺的乳酸菌表層蛋白物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能特性及其具體降解過程。此外，還可以利用微生物代謝組學(xué)技術(shù)分析乳酸菌降解N-亞硝胺的降解中間產(chǎn)物并對其毒理學(xué)特性進行研究。綜上所述，對乳酸菌降解N-亞硝胺進行深入研究，有助于進一步闡明N-亞硝胺在乳酸發(fā)酵過程中實現(xiàn)生物降解的細胞學(xué)和生物學(xué)機制，這不僅為N-亞硝胺的生物控制提供理論依據(jù)，而且對于實際生產(chǎn)中有效控制發(fā)酵食品中N-亞硝胺的含量，保障發(fā)酵肉制品和水產(chǎn)品的食用安全性都具有非常重要的意義。