蔡燕萍，余曉婉，張慶春，何瀟庭，邵天倫，韓眺，劉曄峰，丁玉庭,3，劉建華,3*

1(浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 杭州， 310014)2(國家遠(yuǎn)洋水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心(杭州)，浙江 杭州， 310014)3(海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)4(浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司，浙江 杭州，310024)

生物活性肽是以蛋白質(zhì)為原料，經(jīng)過水解及分離純化后得到的具有特殊生物活性的蛋白水解物。生物活性肽相比于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物氨基酸而言，更容易被人體吸收利用。生物活性肽能夠調(diào)節(jié)機(jī)體生命活動，具有一定的藥用特性和營養(yǎng)特性，在日益關(guān)注健康與飲食的今天，越來越受到人們的重視。但是在親本蛋白序列中，肽是無活性的，必須釋放才能發(fā)揮其作用，目前主要通過直接提取法或酶水解法獲得。

國內(nèi)外研究的活性肽主要來源于陸生動植物，如研究最早也是最深入的陸生動物乳、肉、蛋活性肽，以及植物來源的大豆肽、大米活性肽、玉米活性肽[1]。水產(chǎn)品生長環(huán)境獨(dú)特，是結(jié)構(gòu)多樣的生物活性肽的豐富來源，近年來引起學(xué)者的極大興趣。

1 水產(chǎn)品生物活性肽概述

水產(chǎn)品生物由于其極端的生長環(huán)境，相較于陸生動植物蛋白來源于的蛋白質(zhì)，顯示了出獨(dú)特的優(yōu)勢與特性。譬如，藻類生物為了防止嚴(yán)重的氧化損傷，可以產(chǎn)生抗氧化肽而提供自我保護(hù)[2]；水產(chǎn)品生物毒性較強(qiáng)的多肽類，通常作用于離子通道，具有特定的生理活性，如神經(jīng)保護(hù)肽、鎮(zhèn)痛肽、抗病毒肽等[3]；研究顯示，大多數(shù)水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的蛋白水解產(chǎn)物中Gly、Pro、Val、Tyr和Glu的含量更高[4]。水產(chǎn)品生物活性肽的優(yōu)勢與特性見表1。

表1 水產(chǎn)品生物活性肽的優(yōu)勢與特性

目前，盡管已經(jīng)報道了大量魚類來源的生物活性肽，但是其他水產(chǎn)品生物，例如甲殼類、軟體動物來源的生物活性肽尚未被大量研究。而以水產(chǎn)品魚、蝦、貝、甲殼類為主的抗菌、降血壓、抗癌活性肽也未進(jìn)行過系統(tǒng)的概述。

2 水產(chǎn)品生物活性肽的制備、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定方法

2.1 水產(chǎn)品生物活性肽的制備方法

通常從生物體中獲得生物活性肽主要有以下3種途徑：(1)通過提取直接從生物體內(nèi)分離得到天然活性肽類；(2)通過體外水解蛋白質(zhì)降解獲得具有生理功能的活性肽；(3)人工合成法制備生物活性肽，酶合成、化學(xué)合成或重組DNA技術(shù)。

目前在水產(chǎn)多肽的制備中酶法水解是一個熱門技術(shù)，尤其在食品與藥物中，因?yàn)樵撨^程安全、可控，反應(yīng)條件溫和。同時，蛋白質(zhì)類物質(zhì)在酶的催化下，降解產(chǎn)生的小肽，不會與體內(nèi)氨基酸吸收產(chǎn)生競爭，因此可以用制備得到的多肽模擬人體蛋白的體外降解。

2.2 水產(chǎn)品生物活性肽的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定方法

水解產(chǎn)物本身也可以用作生物活性化合物的商業(yè)來源。但是，從水產(chǎn)生物中提取的多肽，通常含量較低，而經(jīng)分離純化后的肽其生物活性較高。因此，分離純化程度是水產(chǎn)活性肽研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，水產(chǎn)品生物活性肽已通過多種技術(shù)進(jìn)行了研究，包括超濾、凝膠過濾、離子交換色譜和反相高效液相色譜技術(shù)[12]。

純化后的水產(chǎn)品生物活性肽一般需要深入進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的研究。通常采用質(zhì)譜技術(shù)、凝膠過濾色譜、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜分離或蛋白質(zhì)測序闡明其一級結(jié)構(gòu)用于檢測分子質(zhì)量、氨基酸序列或氨基酸組成。

3 水產(chǎn)品生物活性肽的研究進(jìn)展

3.1 抗氧化活性肽

區(qū)別于植物體中通過抑制線粒體損傷或抑制亞麻酸氧化體系的脂質(zhì)過氧化和畜禽體中抑制必需脂肪酸的過氧化而具備的抗氧化功能，水產(chǎn)品中的抗氧化活性是由于疏水性氨基酸或小分子肽的抗氧化作用。目前，具有抗氧化能力的小分子活性肽已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[13]。

3.1.1 源于魚類

魚類資源豐富易捕撈，是制備抗氧化肽最常見的水產(chǎn)資源。目前魚類抗氧化肽的制備多來源于低值魚及其下腳料。SAMPATH等[14]采用連續(xù)色譜分離技術(shù)從竹莢魚和黃花魚的皮膚蛋白水解物中純化出2種具有抗氧化特性的肽。并利用電子噴霧電離雙質(zhì)譜法鑒定其肽序列分別為Asn-His-Arg-Tyr-Asp-Arg和Gly-Asn-Arg-Gly-Phe-Ala-Cys-Arg-His-Ala。結(jié)果表明與天然抗氧化劑α-生育酚相比，這2種肽均顯示出更高的抗多不飽和脂肪酸過氧化活性，可有效地用作食品添加劑和藥物。

3.1.2 源于貝類

貝類蛋白在水產(chǎn)品功能活性肽的研究中占比相對較多，但起步較晚。目前，酶法水解貝類多肽研究較多，主要集中在對扇貝、牡蠣和文蛤等重要貝類資源的利用。WANG等[15]采用凝膠過濾色譜法和反相高效液相色譜技術(shù)分離純化牡蠣水解物的抗氧化活性肽，采用新技術(shù)納米ESI-MS/MS分析氨基酸序列，得到2種新型抗氧化肽，Pro-Val-Met-Gly-Asp和Gln-His-Gly-Val，這2種肽在其序列中分別包含組氨酸和蛋氨酸，與當(dāng)前其他抗氧化肽沒有任何顯著同源性，有助于中國工業(yè)更好地利用廉價的生物活性材料。

3.1.3 源于甲殼類

甲殼類動物不同于其他動物，外殼堅(jiān)硬、體積較大，從蝦蟹殼中制備抗氧化肽，原料數(shù)量大。黃湛媛等[16]為實(shí)現(xiàn)竹節(jié)蝦的高值化利用，采用超聲輔助酶解工藝對其蝦頭副產(chǎn)物進(jìn)行酶解，利用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示相對分子質(zhì)量<3 kDa的組分具有顯著的抗氧化活性，采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對抗氧化肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定為Gly-Asn-Gly-Leu-Pro。

3.1.4 源于藻類

藻類被視為天然的生物反應(yīng)器，是目前已知食品中蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量最高的，是天然抗氧化肽的重要來源[17]。

ZHANG等[18]采用不同蛋白酶從藻類中制備抗氧化肽，結(jié)果顯示α-胰凝乳蛋白酶的水解產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性，通過超濾、凝膠排阻色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行分離、純化后，再通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)鑒定抗氧化肽的序列為Glu-Leu-Trp-Lys-Thr-Phe，結(jié)果證實(shí)，Glu-Leu-Trp-Lys-Thr-Phe可以顯著清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基，自由基清除率為50%時所需樣品的濃度(EC50:concentration for 50% of maximal effect，EC50)為1.514 mg/mL。SHEIH等[19]采用胃蛋白酶酶解從藻類蛋白廢料中獲得抗氧化肽，通過反相高效液相色譜對目標(biāo)肽段進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用質(zhì)譜儀鑒定其氨基酸序列為Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe，半抑制濃度(50% inhibiting concentration， IC50)為(256.4±1.2) μmol/L，研究顯示，廉價的藻類蛋白廢料可能是生產(chǎn)抗氧化肽的新選擇。

3.1.5 源于水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物

中國水產(chǎn)資源豐厚，總魚蝦貝類的捕撈量居全球前列，然而近海岸的水產(chǎn)品加工廢棄物及低值蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)嚴(yán)重，高值化利用低值水產(chǎn)資源越來越成為水產(chǎn)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。HSU[20]，使用定向酶(orientase，OR)和蛋白酶(protease XXIII，PR) 這2種商業(yè)酶對金槍魚黑肌肉副產(chǎn)物進(jìn)行酶解制備抗氧化肽。然后，對蛋白質(zhì)水解物進(jìn)行Sephadex G-25凝膠過濾層析并利用兩步高效液相色譜法進(jìn)一步分離肽級分。結(jié)果表明，使用2種蛋白酶酶解后分子質(zhì)量為390～1 400 Da的肽級分顯示出最高的抗氧化活性，來自O(shè)R和PR水解產(chǎn)物的2種抗氧化肽的氨基酸序列為Leu-Pro-Thr-Ser-Glu-Ala-Ala-Lys-Tyr和Pro-Met-Asp-Tyr-Met-Val-Thr。

抗氧化肽除了來自于水產(chǎn)品的下腳料外，還來自于部分副產(chǎn)物的膠原蛋白中。WU等[21]采用酶法水解鮭魚皮膚膠原蛋白，超濾后，通過尺寸排阻色譜法進(jìn)一步純化，并使用質(zhì)譜鑒定抗氧化肽級分。結(jié)果表明，從超濾級分中鑒定出一種新序列肽Pro-Met-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Tyr-His-Tyr，是一種小分子質(zhì)量的抗氧化肽，通過抗氧化能力指數(shù)(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)分析顯示該肽具有抗氧化活性[(2.51±0.14)mmol TE/g]。同時，研究結(jié)果表明，超濾級分中的較大肽段(> 3 kDa)可被鑒定為潛在的冷凍保護(hù)劑。

3.2 降血壓活性肽

世界各國高血壓平均發(fā)病率為10%～20%，在我國目前，大約有25%的成年人患有此病，預(yù)計到2025 年這一比例將高達(dá)29%[22]。從水產(chǎn)品中分離純化得到的食源性降血壓肽，來源于生物體本身，相對于人工合成的降壓藥而言，具有對人體組織溫和、安全、親和力強(qiáng)，藥效持久，無副作用等優(yōu)點(diǎn)。因此從水產(chǎn)品中分離純化降血壓肽更加符合當(dāng)代人的消費(fèi)理念，具有較好的發(fā)展前景。

酶解水產(chǎn)品制備降血壓肽，最早是從帶魚和沙丁魚開始的，在接下來的數(shù)十年間，越來越傾向于向水產(chǎn)品中開發(fā)探索血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制成分，發(fā)現(xiàn)蝦、螃蟹、藻類、貝類、羅非魚等水產(chǎn)品的酶解物中，都存在此物質(zhì)。

3.2.1 源于魚類

水產(chǎn)生物中的降血壓肽，最早是從魚貝類中提取的，目前更多的是集中于對其降血壓機(jī)理的研究。部分研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制肽的活性與其結(jié)構(gòu)具有一定的關(guān)系，已經(jīng)報道活性肽在N-末端具有脂肪族氨基酸如Val、Met和Ile，以及諸如Pro、Phe的芳香族氨基酸，將具有較強(qiáng)的抑制作用[23]。此外，大多數(shù)抑制ACE的肽至少有1個脯氨酸殘基。吳靖娜等[24]利用復(fù)合蛋白酶酶解制備羅非魚魚皮膠降血壓肽，為測定高ACE抑制率的氨基酸組分，通過超濾膜對不同分子質(zhì)量組分截留純化，從而比較不同組分ACE抑制率。結(jié)果表明，ACE抑制活性最強(qiáng)的組分集中在相對分子質(zhì)量小于2 000 Da以下，對該組分發(fā)揮作用的氨基酸主要是Gly和Pro。

3.2.2 源于貝類

某些海洋貝類肽能夠抑制ACE活性，這些活性多肽通常是加密在親本蛋白的一級結(jié)構(gòu)中，只有當(dāng)其被釋放出來后才表現(xiàn)出來。牡蠣因其高價值高產(chǎn)量等特點(diǎn)，一直是貝類生物活性肽研究的熱點(diǎn)。

WANG等[25]選用胃蛋白酶酶解牡蠣蛋白，從牡蠣蛋白中釋放出ACE抑制肽，并采用 Sephadex LH-20凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜進(jìn)行分離，制備出具有序列Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe的九肽，通過給予動物口服實(shí)驗(yàn)，證明其ACE抑制活性的有效性。LIU等[26]采用酶法從珍珠牡蠣肉蛋白中制備降血壓抑制肽，采用超濾，聚乙二醇甲基醚改性的固定化金屬離子親和介質(zhì)，以及反相高效液相色譜對其水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到2種新型的ACE抑制肽(His-Leu-His-Thr和Gly-Trp-Ala)。結(jié)果表明，2種肽均具有較高ACE抑制活性值，分別為(458.1±3.2) 和(109.3±1.5) μmol/L，可通過降低大鼠血壓來證明其降壓活性。

3.2.3 源于甲殼類

甲殼類降血壓肽具有分子質(zhì)量小、易吸收等特點(diǎn)。李銳等[27]采用體外模擬腸胃消化的方法對克氏原螯蝦蝦頭進(jìn)行酶解，并通過超濾、凝膠色譜、離子色譜、反向高效液相色譜相結(jié)合的方法對其降血壓肽進(jìn)行分離純化，得到一種新型ACE降血壓肽，分子質(zhì)量為225 u，肽序列為Pro-Val。朱國萍[28]采用自溶法從其蝦頭副產(chǎn)物中獲得降血壓肽。結(jié)果顯示，3 000 Da超濾膜產(chǎn)物的ACE抑制活性和肽含量的活性較高，通過Sephadex G-25、反相高效液相色譜(Reverse phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)對該組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，經(jīng)電噴霧離子源質(zhì)譜鑒定，推測為2種二肽為Tyr-Pro和Leu- Pro與Ile -Pro。

3.2.4 源于藻類

藻類植物中具有降血壓活性的物質(zhì)有多肽、胡蘿卜、多糖等，目前從藻類中提取降血壓肽研究較多。KO等[29]對海洋小球藻中的降壓肽進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解液具有最高的ACE抑制活性，并對堿性蛋白酶解液分子質(zhì)量進(jìn)行分級，范圍為低于5 kDa，5～10 kDa和高于10 kDa。結(jié)果顯示低于5 kDa的級分顯示出最高的ACE抑制活性，并用于隨后的分離純化；在對其進(jìn)行進(jìn)一步分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定時，發(fā)現(xiàn)一個降血壓四肽Val-Glu-Gly-Tyr(IC50128.4 μmol/L)。姚興存等[30]采用木瓜蛋白酶酶解條斑紫菜制備活性寡肽，并對其酶解液進(jìn)行層析分析，測得相對分子質(zhì)量小于2 000 Da活性肽具有降血壓活性，在最優(yōu)條件下測定ACE抑制肽的半抑制濃度IC50值為4.5 mg/mL。除此之外，國外不少研究人員也對藻類生物中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽進(jìn)行分離純化，鑒定其蛋白水解產(chǎn)物的降壓作用并通過了解它們的細(xì)胞作用機(jī)制，建立結(jié)構(gòu)-抑制關(guān)系來評估它們在臨床前和臨床試驗(yàn)中有效性[31]。

3.2.5 源于其他水產(chǎn)原料

除了對幾種常見種類生物的降血壓肽有研究外，軟體動物、腸腔動物中的降血肽也有研究。BALTI等[32]將烏賊肌肉蛋白質(zhì)進(jìn)行水解制備降血壓肽，通過各種類型的色譜分離純化活性肽，利用電噴霧質(zhì)譜和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定其分子質(zhì)量和氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)9種新的ACE抑制肽，其中最有效的肽的結(jié)構(gòu)被鑒定為Val-Glu-Leu-Tyr-Pro，Ala-Phe-Val-Gly-Tyr-Val-Leu-Pro和Glu-Lys-Ser-Tyr-Glu-Leu-Pro。結(jié)果表明，最高活性的ACE抑制肽Val-Glu-Leu-Tyr-Pro作為ACE的非競爭性抑制劑，將成為營養(yǎng)保健品和藥物對抗高血壓及其相關(guān)疾病的有益成分。

3.3 抗菌性活性肽

與市面上流通的抗生素相比，抗菌肽不僅能夠高效殺死細(xì)菌，對部分真菌、原蟲、病毒、腫瘤細(xì)胞也具有很強(qiáng)的抑殺能力。并且大多數(shù)抗菌肽具有較好的水溶性以及穩(wěn)定性，對真核細(xì)胞具有低毒甚至無毒性，不容易產(chǎn)生耐藥性，僅含有十肽或者更短肽的氨基酸的寡肽序列，生產(chǎn)成本低[33]。

3.3.1 源于魚類

魚類抗菌肽分布范圍較廣，在魚體體表黏膜、皮膚、小腸、鰓等組織均有過分離得到抗菌肽的報道，因此魚類在受到病原入侵或損傷時能夠迅速進(jìn)行防御并殺害有害物質(zhì)。按其生化組織與結(jié)構(gòu)，可將其分為四類。第一類為富含某種氨基酸的線性抗菌肽，不含半胱氨酸。此種類型的抗菌肽由于富含一些堿性氨基酸和α螺旋結(jié)構(gòu)，有利于在細(xì)菌細(xì)胞膜形成穿孔，細(xì)胞膜內(nèi)磷脂分子的極性端與抗菌肽的極性端相對螺旋翻轉(zhuǎn)，破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞的功能喪失，達(dá)到抗菌的目的，因此又可稱為穿孔螺旋模型，如Piscidins、Pleurocidins、Moronecidin，物種來源有鱖魚[34]等。第二類為具有β折疊結(jié)構(gòu)，是由于含多個半胱氨酸折疊而形成，如Hepcidin、Cathelicidins，物種來源有大彈涂魚[35]等。第三類為多存在于魚類的皮膚黏膜中的組蛋白樣抗菌肽，如Parasin，物種來源有鰱魚[36]等。第四類為經(jīng)酰胺化、糖基化修飾的抗菌肽，這類抗菌肽在相關(guān)酶的作用下，通過高爾基體加工時，會脫掉C端一個或多個氨基酸，或再與一些糖基結(jié)合，從而變成具有活性的成熟肽，物種來源有鯉魚[37]等。

3.3.2 源于貝類

在海洋貝類中，貽貝的抗菌肽研究較為透徹，它們多數(shù)是富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽[38]。宋宏霞[39]以紫貽貝為原料，采用復(fù)配酶法制備抗菌肽，利用Cellulose-52離子交換柱對其進(jìn)行分離純化，得到具有廣譜殺菌作用的抗菌肽，且其抗菌效果中革蘭氏陽性菌明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

3.3.3 源于甲殼類

1996年首次從甲殼類生物岸蟹(Carcinusmaenas)體內(nèi)分離出一種小分子的具有殺菌作用的蛋白質(zhì)[40]。不少研究報道顯示有3種類型的抗菌肽，一種是僅對革蘭氏陰性菌具有專一的殺菌作用，一種是僅對革蘭氏陽性菌具有專一的識別抑制作用，還有一種是對2種菌都起到抑制及殺死作用。EVANS等[41]將殺死的革蘭氏陰性桿菌注射到加利福尼亞刺龍蝦中時，在血液淋巴中出現(xiàn)誘導(dǎo)的殺菌素。

抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，抗菌肽ALF)，是一種小的堿性蛋白質(zhì)，已被證明對革蘭氏陰性菌及陽性菌均具有抑制或殺死功能[42]。ENRIQUE等[43]從海洋蝦南美白對蝦中克隆了ALF，并檢測了它在細(xì)菌、真菌和病毒感染的先天免疫反應(yīng)中的作用，這是通過使用體內(nèi)RNA干擾方法(RNA interference，RNAi)分析ALF產(chǎn)生的表型來完成的。

3.4 其他水產(chǎn)品活性肽

傳統(tǒng)的治療手段對腫瘤細(xì)胞的專一性作用差，副作用大，并且長期服用抗癌藥物，人體會產(chǎn)生耐藥性。相對于傳統(tǒng)的藥物治療，抗腫瘤肽分子質(zhì)量小，易被人體組織吸收利用。與傳統(tǒng)的抗癌藥物相比，其對腫瘤細(xì)胞具有較好的靶向作用，親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而備受研究人員的關(guān)注。CHI等[44]通過超濾分級及凝膠色譜技術(shù)從血蛤肌肉蛋白水解物中分離出的2種肽被鑒定為Trp-Pro-Pro和Gln-Pro，分子質(zhì)量分別為398.4 Da和243.2 Da。結(jié)果表明，Trp-Pro-Pro具有顯著抑制脂質(zhì)過氧化，并且在水解產(chǎn)物分級和純化的肽中表現(xiàn)出最高的自由基清除活性。該發(fā)現(xiàn)表明，Trp-Pro-Pro可用于消除在氧化應(yīng)激條件下產(chǎn)生的過量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并預(yù)防由大量自由基引起的癌癥。此外，Trp-Pro-Pro還可以通過清除自由基和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來用于癌癥治療。王竹君[45]也從螺旋藻粉末中提取到了抗腫瘤肽。

動脈和靜脈血栓形成是心血管發(fā)病和死亡的主要原因，抑制動脈血栓形成的策略主要集中在阻斷血小板功能上，抗凝血肽通過防止纖維細(xì)胞沉積形成血小板聚集來預(yù)防和治療血栓的形成。JUNG等[46]從藍(lán)貽貝的可食用部分分離出有效的抗凝血寡肽，M.edulis 抗凝血肽(MEAP)，約2.5 kDa分子質(zhì)量類似于來自扇貝內(nèi)收肌的鈣調(diào)蛋白的EF-手域的氨基酸序列，能有效地與血液中的凝血活性因子相結(jié)合，延長凝血酶和活化部分促凝血酶原激酶時間，增強(qiáng)機(jī)體抗凝血功能。

4 水產(chǎn)品生物活性肽的結(jié)構(gòu)特征與生物活性關(guān)系

4.1 氨基酸序列與水產(chǎn)品生物活性肽活性關(guān)系

不同蛋白質(zhì)水解物和生物活性肽的氨基酸組成的變化大多數(shù)受原材料、酶源和水解過程中所改變的參數(shù)等因素影響。ACE抑制肽的抑制作用通過氨基酸的N-或C-末端類型而改變，這完全取決于酶的一級結(jié)構(gòu)和選擇[47]。已經(jīng)報道活性肽在N-末端具有脂肪族氨基酸如Val、Met和Ile，以及Pro、Phe的芳香族氨基酸，將具有較強(qiáng)的抑制作用，肽C-末端存在Tyr、Phe、Trp、Ala、Gly和Pro有助于提高ACE抑制活性[48]。并且，大多數(shù)抑制ACE的肽至少有一個Pro殘基或一個Gly殘基?？寡趸钚耘c氨基酸種類，序列和疏水性有關(guān)，疏水性氨基酸中Lys和Met對抗氧化肽的影響最大[49]。迄今為止，大多數(shù)已鑒定的魚蛋白抗氧化肽較短(5～16個氨基酸)，并且在其N端和序列中的Pro、His或Tyr處含有疏水性氨基酸(Val和Leu)。Tyr主要清除自由基，因?yàn)樗鼈兊姆宇悅?cè)鏈充當(dāng)有效的電子給體。因此，可以終止自由基鏈反應(yīng)[50]。Pro和Hyp似乎在抑制脂質(zhì)過氧化中起作用[51]。大多數(shù)水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物膠原蛋白研究涉及抗氧化劑和ACE抑制活性的多肽結(jié)構(gòu)中，重復(fù)了獨(dú)特的Gly-Pro-Hyp序列，因此抗氧化和ACE抑制活性可能與這種獨(dú)特的氨基酸組成有關(guān)[52]。

水產(chǎn)品中的膠原蛋白對黑色素的合成起顯著作用，酪氨酸酶是控制黑色素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶，SCHURINK等[53]研究發(fā)現(xiàn)多肽的氨基酸組成，Leu、Val、Phe、Arg和Ala對抑制酪氨酸酶可能起主要作用，因此這些氨基酸的組成及序列對皮膚修復(fù)能力具有影響。

4.2 分子質(zhì)量與水產(chǎn)品生物活性肽活性關(guān)系

低分子質(zhì)量的肽比高分子質(zhì)量的肽具有更高的生物活性，因?yàn)樗鼈兏菀妆晃改c道吸收[54]。

UMAYAPARVATHI等[55]對從牡蠣蛋白水解物中分離出的生物活性肽進(jìn)行了體外評估。牡蠣水解產(chǎn)物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化潛力，利用Sephadex G-25凝膠色譜和UPLC-MS對其水解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，其中DPPH自由基的清除能力最高的3種肽的分子質(zhì)量均在500～1 500 Da，說明分子質(zhì)量越小抗氧化活性越高，此外分子質(zhì)量為515.29 Da的肽段對人結(jié)腸癌具有抗癌活性。ZHAO等[56]采用酶解法從海參中制備降血壓肽，通過超濾分級法將水解產(chǎn)物分成3個組分(<10 kDa、<5 kDa、<1 kDa)，其中分子質(zhì)量<1 kDa的級分具有很高的血管緊張素-I轉(zhuǎn)換酶抑制活性，IC50值為0.35 mg/mL。KAO等[57]采用2種方法分別對比目魚等7種海水魚在不同分子質(zhì)量大小的抗冷凍效果與來自短棘魚的2種不同大小的抗凍成分(2 900 Da和4 000 Da)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，這2種方法中，抗凍肽活性都與分子質(zhì)量呈正相關(guān)，但是，當(dāng)抗凍肽分子量超過4000 Da，每毫克蛋白的抗凍活性下降。因此，就降低冷凍溫度的能力而言，小分子質(zhì)量的抗凍肽似乎更具優(yōu)勢。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，水產(chǎn)品生物活性肽由于其獨(dú)特的生理活性，已受到國內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。產(chǎn)物的利用形式從起初的水產(chǎn)品蛋白，逐漸轉(zhuǎn)移到對其加工副產(chǎn)物的綜合利用?？寡趸?、降血壓肽的研究開發(fā)起步早已被廣泛報道，但是抗腫瘤肽、抗凝血肽以及高F值寡肽等還有待深入開發(fā)，新型的神經(jīng)保護(hù)肽、抗糖尿病肽、鎮(zhèn)痛肽、抗肥胖肽等也成為研究的熱點(diǎn)。此外，水產(chǎn)生物活性肽的開發(fā)也存在許多共性難題：(1)對生物活性肽的安全性及穩(wěn)定性測試，已經(jīng)在體外或動物模型試驗(yàn)中觀察到生物活性肽大多數(shù)的生物學(xué)效應(yīng)，但仍需進(jìn)一步的進(jìn)行人體和體內(nèi)干預(yù)試驗(yàn)以證明不同生物活性的功效；(2)原料生存環(huán)境惡劣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分離純化技術(shù)較難充分高效地回收功能活性物質(zhì)，且蛋白原料利用率低，制備成本高；(3)開采復(fù)雜，所需設(shè)備投入高，受經(jīng)費(fèi)以及基礎(chǔ)理論研究的不足，有效開發(fā)利用還存在較多困難；(4)蛋白酶酶切位點(diǎn)廣泛，難以靶向酶解制備；(5)加工過程中存在不愉快的風(fēng)味，如苦澀味、腥味等；(6)目標(biāo)肽含量低，功效不顯著；(7)產(chǎn)品在研發(fā)階段與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中的差異；(8)原料來源廣泛以及提取方式未標(biāo)準(zhǔn)化，使得多肽得率難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化與規(guī)模化。同時，對于作為功能性食品成分的水產(chǎn)品生物活性肽而言，需要考慮與不同食品基質(zhì)的相容性、胃腸道穩(wěn)定性、生物利用度以及長期穩(wěn)定性等諸多因素。水產(chǎn)品生物活性肽具有廣闊的應(yīng)用前景,尚有大量的研究工作需要去開展。