李繼庭 梁虹宇 蘇立芬

1廣東省第二中醫(yī)院，廣州 510095

2廣州市白云區(qū)人民醫(yī)院，廣州 510500

流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是由流感病毒導(dǎo)致的急性呼吸道疾病，具有傳染性高、傳播速度快、易流行等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[1]。疫苗保護(hù)作用是目前流感預(yù)防的重要舉措之一，然而由于病毒的變異速度較快，且疫苗不能對(duì)所有人群完成有效免疫，疫苗的有效利用率達(dá)不到預(yù)期效果。神術(shù)散來源于《醫(yī)方類聚》，主治傷寒傷風(fēng)，癥見頭疼身痛、發(fā)熱惡寒無汗，功能祛風(fēng)解表止痛[2]。本研究采用加味神術(shù)散霧化劑進(jìn)行體外抗流感病毒實(shí)驗(yàn)，旨在尋找有效且毒副作用小的抗流感病毒藥物，為流感的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)組藥物為自制加味神術(shù)散霧化劑，基本藥物組成及劑量為蒼術(shù)20 g，羌活、白芷、金銀花、野菊花、藿香各10 g，甘草5 g，冰片0.3 g，由上述藥物制成的水提劑，取15劑水煮蒸餾，經(jīng)濃縮后得到黃色精油，通過乙醚將油反復(fù)溶出，加入無水Na2SO4脫水干燥，藥物濃度為1 g/mL。對(duì)照組藥物為利巴韋林注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20033945)。

1.2 試劑和儀器

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(上海江萊生物科技有限公司)5 mg/mL，避光-20 ℃保存?zhèn)溆?；小牛血清培養(yǎng)液(維森特生物技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海博訊，BC-J160S)；倒置熒光電子顯微鏡(Leica，DMI3000B)；酶標(biāo)儀(Thermo，MULTISKAN MK3)；超凈工作臺(tái)(上海博訊，SW-CJ-2FD)。

1.3 病毒株

甲型H1N1流感病毒及狗腎傳代細(xì)胞(MDCK cell)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家流感中心提供，使用前在9日齡雞胚尿囊腔接種傳代，每胚接種0.2 mL，經(jīng)過37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h后收集尿囊液，3000 r/min條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，取尿囊液測(cè)定病毒血凝滴度為1：512且細(xì)菌培養(yǎng)陰性的病毒液進(jìn)行分裝，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 MDCK細(xì)胞的培養(yǎng) 液氮內(nèi)取出MDCK細(xì)胞，37 ℃條件下水浴，離心后棄細(xì)胞上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)液9 mL，分布均勻后加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將長(zhǎng)滿單層的MDCK細(xì)胞以PBS液洗，加入2.5 mL 0.5%胰酶與EDTA；當(dāng)細(xì)胞收縮變圓到將要脫落時(shí)，加入1 mL含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹落細(xì)胞，以離心管收集消化終止液，1500 r/min離心5 min；棄上清液，加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，重新懸浮細(xì)胞后分裝，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后備用。

1.4.2 流感病毒液的制備 將雞胚氣室朝上放置于蛋盤，用75%酒精消毒氣室端，鉆孔，吸取病毒液注射到雞胚尿囊腔。37 ℃培養(yǎng)雞胚，在收獲尿囊液前應(yīng)放置4 ℃過夜。吸取雞胚尿囊液，于3000 r/min條件下離心5 min收集上清液，-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 流感病毒收集液血凝滴度的測(cè)定 血凝板待測(cè)孔內(nèi)每孔加入0.05 mL生理鹽水，吸取等體積含病毒的雞胚尿囊液于第1孔，混勻后依次對(duì)倍稀釋。依次從左至右每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.05 mL。將血凝板置于振蕩器上振蕩，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中放置10 min，出現(xiàn)完全凝集孔內(nèi)病毒的最高稀釋度，即為血凝滴度(HA)。

1.4.4 流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞毒力的測(cè)定 MDCK細(xì)胞貼壁長(zhǎng)成完整的單層后，棄上清液，PBS洗細(xì)胞3次。取病毒生長(zhǎng)液按10倍梯度稀釋為10-1～10-10，以100 μL/孔將不同濃度的病毒液加入MDCK細(xì)胞中，每個(gè)稀釋度平行做3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞作為對(duì)照組，孔內(nèi)不加病毒，只添加細(xì)胞培養(yǎng)液。置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中流感病毒吸附MDCK細(xì)胞1 h后取出，棄上清液，PBS洗滌3次，病毒組每孔加病毒生長(zhǎng)液150 μL，正常細(xì)胞對(duì)照組加150 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞病變(CPE)分級(jí)的判定方法:0%CPE為“-”，1%～25%CPE為“+”，25%～50%CPE為“++”，50%～75%CPE為“+++”，75%～100%CPE為“++++”；當(dāng)最高濃度病毒液孔內(nèi)MDCK細(xì)胞CPE達(dá)到+++～++++時(shí)，取各孔上清液作血凝試驗(yàn)，采用Reed-Muench法計(jì)算流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。

1.4.5 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞毒性的測(cè)定 依照MTT法檢測(cè)藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性。MDCK細(xì)胞長(zhǎng)成完整的單層后，棄上清液，PBS洗3次，更換含不同濃度的含藥細(xì)胞培養(yǎng)液，150 μL/孔。以1000 μg/mL加味神術(shù)散霧化劑作為最大濃度藥物組，用培養(yǎng)液按2倍梯度稀釋藥物，測(cè)定藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性范圍。每個(gè)藥物濃度平行做3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組(不加病毒，只加150 μL細(xì)胞培養(yǎng)液)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察CPE。當(dāng)高濃度藥物組細(xì)胞CPE達(dá)到+++～++++時(shí)，采用MTT法在482 nm處測(cè)定光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞破壞率；通過Probit回歸計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TC50)與藥物最大無毒濃度(TC0)。

1.4.6 藥物對(duì)流感病毒增殖抑制作用的測(cè)定 MDCK細(xì)胞長(zhǎng)成完整的單層后，棄上清液，PBS洗3次，按照100 μL/孔加入10倍TCID50流感病毒液，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，棄上清液，PBS洗3次，設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組及利巴韋林陽性對(duì)照組，每個(gè)藥物濃度平行做3復(fù)孔。選擇TC0作為最高濃度，將病毒生長(zhǎng)液作2倍稀釋，然后按照150 μL/孔加入藥物孔中。正常細(xì)胞對(duì)照組內(nèi)不加病毒，只加細(xì)胞培養(yǎng)液；病毒對(duì)照組加病毒生長(zhǎng)液；利巴韋林陽性對(duì)照組先加入不同濃度的利巴韋林，清洗后加入病毒生長(zhǎng)液。根據(jù)病毒復(fù)制周期，設(shè)計(jì)3種不同加藥方式觀察加味神術(shù)散霧化劑的抗病毒效果：直接抑制組同時(shí)加入病毒生長(zhǎng)液與不同濃度的加味神術(shù)散霧化劑；治療組先加入病毒生長(zhǎng)液，清洗后加入不同濃度的加味神術(shù)散霧化劑；預(yù)防組先加入不同濃度的加味神術(shù)散霧化劑，清洗后加入病毒生長(zhǎng)液。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察CPE。當(dāng)高濃度藥物組細(xì)胞達(dá)到+++～++++時(shí)，采用MTT法在482 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算病毒增殖抑制率，通過Probit回歸計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)和治療指數(shù)(TI)，TI=TC50/IC50。

2 結(jié)果

2.1 病毒毒力測(cè)定

由血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，流感病毒稀釋到10-8時(shí)，開始出現(xiàn)血凝陰性；稀釋至10-10時(shí)，未見血凝發(fā)生。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算甲型H1N1流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50為10-8/0.1 mL。見表1。

表1 流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的毒力

2.2 藥物毒性測(cè)定

通過Probit回歸法計(jì)算加味神術(shù)散霧化劑對(duì)MDCK細(xì)胞的TC50為366.63 μg/mL，TC0為31.25 μg/mL；利巴韋林對(duì)MDCK細(xì)胞的TC50為109.85 μg/mL，TC0為8.02 μg/mL。見表2。

表2 藥物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性

2.3 藥物對(duì)流感病毒增殖的抑制作用

通過Probit回歸法計(jì)算加味神術(shù)散霧化劑直接抑制流感病毒的IC50=9.79 μg/mL，TI=37.45；預(yù)防流感病毒感染的IC50=8.72 μg/mL，TI=42.04；治療流感病毒感染的IC50=17.40 μg/mL，TI=21.07。利巴韋林預(yù)防流感病毒感染的IC50=84.30 μg/mL，TI=1.30。見表3。

表3 藥物對(duì)流感病毒增殖的抑制作用

3 討論

流行性感冒臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咽痛、肌痛、咳嗽等呼吸道癥狀，以及腹瀉、腹痛、惡心等消化道癥狀，少數(shù)患者甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征、急性呼吸窘迫綜合征等，病死率較高，可發(fā)生于任何年齡段，患病不存在性別差異，目前以12歲以下兒童發(fā)病率較高[3]。目前治療流感的常見化學(xué)藥物包括4種類型：M2離子通道抑制劑例如金剛烷胺，可作用于流感病毒膜蛋白以及血凝素蛋白，有效阻止病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞；神經(jīng)氨酸酶抑制劑例如奧司他韋，可抑制神經(jīng)氨酸酶活性，阻止病毒顆粒的釋放，切斷病毒的擴(kuò)散鏈；抑制流感病毒核酸合成藥物例如利巴韋林，可損害病毒RNA和蛋白合成，從而抑制病毒的復(fù)制與傳播；以及非特異性抗病毒藥物例如干擾素，可廣譜抑制病毒的繁殖，通過誘導(dǎo)細(xì)胞合成抗病毒蛋白體而發(fā)揮作用[4]。以上化學(xué)治療藥物雖具有一定的抗病毒作用，但可能導(dǎo)致較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)。

我國(guó)很早就開始研究中藥抗流感作用，加味神術(shù)散主要由蒼術(shù)、白芷、川穹、藁本、羌活、細(xì)辛、炙甘草7味藥物組成，其中蒼術(shù)燥濕健脾、祛風(fēng)散寒，白芷解表散寒、祛風(fēng)止痛，川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，藁本祛風(fēng)散寒、除濕止痛；羌活解表散寒、祛風(fēng)勝濕止痛，細(xì)辛祛風(fēng)通竅、散寒止痛，炙甘草調(diào)和諸藥；諸藥合用，共奏解表散寒、祛風(fēng)除濕之效。本課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，加味神術(shù)散霧化劑可下調(diào)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)柱FM1感染小鼠NLRP3炎性小體及其下游因子IL-1β、IL-18的分泌水平，可能對(duì)其產(chǎn)生免疫保護(hù)機(jī)制。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討加味神術(shù)散霧化劑抗流感病毒的效果，由于利巴韋林對(duì)流感病毒甲型、乙型均有較為明確的抑制作用，因此本研究中選用其作為陽性對(duì)照藥物。

TCID50是指能引起50%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)的待測(cè)病毒量，反映病毒致細(xì)胞病變的能力，是檢測(cè)病毒感染性和毒力的指標(biāo)。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算甲型H1N1流感病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50為10-8/0.1 mL。加味神術(shù)散霧化劑對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒較多，增殖緩慢，形態(tài)改變，部分細(xì)胞破碎脫落。加味神術(shù)散霧化劑對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性作用隨著藥物濃度的升高而升高，細(xì)胞破壞率隨藥物濃度的降低而降低。本研究中加味神術(shù)散霧化劑對(duì)MDCK細(xì)胞的TC50為366.63 μg/mL，TC0為31.25 μg/mL；利巴韋林對(duì)MDCK細(xì)胞的TC50為109.85 μg/mL，TC0為8.02 μg/mL。說明加味神術(shù)散霧化劑對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性低于利巴韋林，達(dá)到相同細(xì)胞破壞率需要更高的藥物濃度。

本研究中利巴韋林預(yù)防流感病毒感染的IC50=84.30 μg/mL，TI=1.30；加味神術(shù)散霧化劑直接抑制流感病毒的IC50=9.79 μg/mL，TI=37.45；預(yù)防流感病毒感染的IC50=8.72 μg/mL，TI=42.04；治療流感病毒感染的IC50=17.40 μg/mL，TI=21.07。TI=TC50/IC50，是反映藥物對(duì)病毒抑制作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。研究結(jié)果顯示，加味神術(shù)散霧化劑預(yù)防組TI達(dá)到42.04，明顯高于利巴韋林組的1.30；表明加味神術(shù)散霧化劑預(yù)防流感病毒感染的作用確切。采用不同加藥方式給予MDCK細(xì)胞加味神術(shù)散霧化劑處理，其抗流感病毒效率存在差異，在相同藥物濃度下，預(yù)防組的病毒破壞率顯著高于直接抑制組和治療組；這可能是由于加味神術(shù)散霧化劑阻斷病毒侵入細(xì)胞的作用較強(qiáng)。在藥物最大無毒濃度下，加味神術(shù)散霧化劑表現(xiàn)出對(duì)流感病毒細(xì)胞內(nèi)增殖有明顯的抑制作用，且病毒增殖抑制率隨著藥物濃度的增加而增加；提示加味神術(shù)散霧化劑與利巴韋林一樣，其抗流感病毒作用效果隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)。

綜上所述，加味神術(shù)散霧化劑可明顯抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK細(xì)胞中的增殖，具有抗甲型H1N1流感病毒作用。