李顯剛　姚拓　舒鍵虹　高巍

摘要：百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15、LC20）與白三葉根際中分離出根瘤菌RW183基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增16S rDNA序列、陽(yáng)性克隆檢測(cè)、質(zhì)粒提取測(cè)序，并與GenBank中已知序列比對(duì)，結(jié)果表明，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列與多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過(guò)99.00%，RW18與勒克氏菌屬中的Leclercia adecarboxylata（HQ242722）核苷酸序列同源性為99.79%，結(jié)合各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步鑒定為Klebsiella sp.，將菌株RW18鑒定為L(zhǎng)eclercia sp.。

關(guān)鍵詞：促生菌;16S rDNA序列;豆科牧草;百脈根;白三葉

中圖分類號(hào)：S541;Q785? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2020）06-0005-03

隨著農(nóng)牧業(yè)和園林綠化（包括草坪業(yè)）的發(fā)展，以新型肥源替代部分化肥的應(yīng)用成為生態(tài)農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì)，百脈根和白三葉得到更多、更廣的應(yīng)用。本研究從生長(zhǎng)在貴州黔南地區(qū)的百脈根根際分離出根瘤菌2株（LC15與LC20），白三葉根際中分離出根瘤菌1株（RW18），均具有溶解多種難溶磷源及分泌植物生長(zhǎng)激素（IAA）的功能，并對(duì)其部分生物學(xué)特征了進(jìn)行了初步研究，采用16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)3菌株的基因序列、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和分類地位進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步提高喀斯特地區(qū)土壤中磷素的循環(huán)利用提供基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)利用百脈根及白三葉根際溶磷微生物資源及其綠色無(wú)公害生產(chǎn)提供促生菌菌種資源。

1? 菌株菌落特征觀察及主要生理生化特征測(cè)定

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[1]對(duì)菌株菌落形態(tài)特征（菌落質(zhì)地、形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀，透明度、生長(zhǎng)速度等）、主要生理生化特征[葡萄糖利用、甘露醇利用、麥芽糖利用、果糖利用、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、二乙酰（V-P）試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、甲基紅（M-R）試驗(yàn)等]進(jìn)行試驗(yàn)和觀察記錄。具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。

1.1? 細(xì)菌總DNA提取

將供試菌株用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)活化并檢查純度后，采用寶生物（大連）公司提供的細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒提取菌株基因組DNA。

1.2? 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

將提取的菌株基因組DNA稀釋至20 ng/μL，并以此濃度的細(xì)菌總DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA。所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

正向引物：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。

PCR擴(kuò)增體系為25 μL，以滅菌的ddH20代替模板DNA作為陰性對(duì)照，反應(yīng)體系組成如下：10×buffer（Mg2+ plus）2.5 μL，dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol/L）1.0 μL，模板1.0 μL（20 ng/μL），Taq DNA Polymeras 0.25 μL，ddH20 17.25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，循環(huán)30次，25 ℃ 2 min。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3? PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，利用OMEGA BIO-TEK公司提供的Get Extraction Kit（50）D-2500-01試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收，回收產(chǎn)物再次經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4? PCR產(chǎn)物的回收連接轉(zhuǎn)化

取1.0 μL PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD 18-T Vector連接，5 μL連接反應(yīng)體系中含有pMD 18-T Vector 0.5 μL、Ligation solution 2.5 μL、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 μL、無(wú)菌ddH20 1.0 μL。充分混勻后離心數(shù)秒，將管壁液滴收到管底，16 ℃水浴16～18 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，待菌液吸干后，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～16 h，隨機(jī)挑取白色單菌落至含有Amp 50 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200～300 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后以1 μL菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件同“1.2”，并取1 mL培養(yǎng)物用于質(zhì)粒抽提，然后進(jìn)行PCR鑒定。

1.5? 16S rDNA序列測(cè)定、分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將菌株質(zhì)粒產(chǎn)物送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，測(cè)序結(jié)果提交GenBank中的Blast數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，經(jīng)Clustal（1.8）軟件進(jìn)行多重序列比較后，結(jié)合菌株的生理生化特征，用Mega2.0軟件中的鄰位相連法（Neighbor-jioning）構(gòu)建菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 菌株的菌落及生理生化特征

試驗(yàn)對(duì)LC15、LC20、RW183菌株進(jìn)行了生理生化特征初步鑒定。3株菌在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3 d后菌落特征為：菌株LC15菌落大、不規(guī)則，菌落顏色為淡白色，不透明，濕潤(rùn)，菌落中間凸起，邊緣光滑;菌株LC20菌落大，不規(guī)則，菌落顏色為乳白色，邊緣不整齊、光滑，半透明，濕潤(rùn)，菌落中間凸起;菌株RW18菌落小，不規(guī)則，菌落邊緣淡白色，中間淡黃色、凸起，菌落濕潤(rùn)、不透明。

3株菌的主要生理生化特征見(jiàn)表1。由表1可知，菌株LC15及LC20的吲哚試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)結(jié)果呈陰性，淀粉水解、檸檬酸鹽利用、過(guò)氧化氫酶產(chǎn)氣、二乙酰（V-P）與硫化氫變色及硝酸鹽還原試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性;菌株RW18不利用檸檬酸鈉、吲哚及苯丙氨酸脫氨酶，試驗(yàn)不變色，且不能使明膠發(fā)生液化，但能使淀粉水解、過(guò)氧化氫酶產(chǎn)氣、硝酸鹽還原，二乙酰（V-P）及硫化氫試驗(yàn)呈陽(yáng)性。

2.2? PCR產(chǎn)物電泳及其產(chǎn)物回收

對(duì)各菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌體進(jìn)行收集，并提取總DNA，將各菌株基因組DNA稀釋到20 ng/μL，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物電泳見(jiàn)圖1。各菌株DNA PCR擴(kuò)增條帶明亮，無(wú)雜帶，片段長(zhǎng)度約為1 500 bp，與16S rDNA序列分析方法片段大小一致。將各菌株DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1，回收產(chǎn)物無(wú)雜帶，明亮。

2.3? DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取

將菌株DNA的PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)性克隆，在每個(gè)菌株的藍(lán)白斑平板上隨機(jī)挑取5個(gè)白色菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)夜，以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)是否成功克隆轉(zhuǎn)化子。各菌株轉(zhuǎn)化子菌落電泳見(jiàn)圖2。由圖2可知，各菌株轉(zhuǎn)化子均擴(kuò)增得到約1 500 bp的條帶，均為陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行重組質(zhì)粒DNA提取，以重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其電泳見(jiàn)圖2。由圖2可知，在約1 500 bp處擴(kuò)增出特異性明亮條帶，初步說(shuō)明各菌株的16S rDNA序列已成功插入pMD18載體上。

2.4? 菌株序列分析

將各菌株的重組質(zhì)粒DNA送交上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，菌株LC15的目的基因長(zhǎng)度為1 441 bp，菌株LC20的目的基因長(zhǎng)度為1 429 bp，菌株RW18為1 430 bp。3菌株的目的基因長(zhǎng)度接近16S rDNA基因片段的長(zhǎng)度，符合試驗(yàn)?zāi)康?。采用BLAST程序?qū)?菌株的16S rDNA序列與GanBank中已登錄細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株LC15與LC20的16S rDNA序列于多株克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）的16S rDNA核苷酸序列的同源性均超過(guò)99.00%，其中菌株LC15、LC20分別與Klebsiella pneumoniae strain 26（HQ259959）、Klebsiella variicola strain7（HQ259961）的同源性高達(dá)99.51%和99.93%;菌株RW18與勒克氏菌屬中Leclercia adecarboxylata（HQ242722）的核苷酸序列同源性為99.79%。菌株LC15與LC20的相似性達(dá)到99.37%。

依據(jù)上述比對(duì)結(jié)果及各菌株的主要生理生化特征，將菌株LC15與LC20初步歸屬為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細(xì)菌;將菌株RW18歸屬為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）。菌株LC15、LC20與RW18的16S rDNA序列同源性系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖3。

3? 討論

促生菌接種于農(nóng)牧作物具有重要作用，例如韓文星[3]、葉喜文等[4，5]、Hariprased等[6]及朱培淼等[7]以溶磷菌為主的PGPR促生菌接種到各試驗(yàn)材料后的結(jié)果表明，作物鮮重、干重、株高、根長(zhǎng)、葉綠素含量、穗長(zhǎng)、有效分蘗數(shù)以及吸收磷量和根際土壤有效磷含量均較對(duì)照或單施N、P、K有不同程度的增加;沈德龍等[8]從水稻中分離的成團(tuán)腸桿菌YA19可分泌4種生長(zhǎng)激素，其中的分裂素包括玉米素核苷、二氫玉米素核苷及異戊烯腺嘌呤;由芽孢桿菌組成的復(fù)合解磷菌劑廣泛用于水稻、豌豆等多種農(nóng)作物及牧草上，對(duì)發(fā)揮解磷功能和提高農(nóng)牧作物產(chǎn)量具有很好的效果[9];王煒等[10]研究復(fù)合菌肥對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響結(jié)果表明，其鮮重、葉綠素a及葉綠素b均隨復(fù)合菌肥用量的增加而升高;牛廷香等[11]將溶磷菌嫁接到柑桔幼苗后，對(duì)改善植株磷素營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)苗木生長(zhǎng)均有明顯作用。此外，胡曉峰等[12]分離到的一株溶磷細(xì)菌，對(duì)辣椒疫霉、大麗輪枝菌、煙草疫霉煙草變種和立枯絲核菌有拮抗作用。因此，鑒定本研究中的3株優(yōu)良菌株意義重大，為后期研究3株菌株對(duì)農(nóng)牧作物的相關(guān)作用奠定基礎(chǔ)。

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對(duì)微觀世界的認(rèn)識(shí)也在不斷深入。特別是現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，使得細(xì)菌的分類與鑒定更為科學(xué)。目前，對(duì)細(xì)菌的鑒定方法較多，如16S rDNA序列分析、PCR技術(shù)、質(zhì)粒圖譜分析法、化學(xué)分類鑒定法及核酸雜交技術(shù)等。本研究采用16S rDNA序列分析法對(duì)3株溶磷菌進(jìn)行了初步鑒定，并初步確定了菌株LC15與LC20為克雷氏菌屬（Klebsiella sp.）細(xì)菌，菌株RW18為勒克氏菌屬（Leclercia sp.）細(xì)菌，由于未對(duì)這3株菌的微觀形態(tài)和革蘭氏染色等進(jìn)行觀察，所用鑒定方法單一，未鑒定到種。

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收稿日期：2020-04-10

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30960265）;貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目[黔科合NY（2009）3067]

作者簡(jiǎn)介：李顯剛（1983-），男，貴州遵義人，畜牧師，碩士，主要從事草原監(jiān)測(cè)監(jiān)管及草地微生物資源與生態(tài)研究方面的工作，（電話）13595404735

（電子信箱）578912809@qq.com;通信作者，姚? 拓（1968-），男，甘肅靖遠(yuǎn)人，教授，博士，主要從事草業(yè)科學(xué)（草地微生物和草地保護(hù)）

教學(xué)及研究工作，（電話）15002623079。