王華

【摘要】固相化學(xué)合成法是合成類多肽原料藥的重要手段之一，目前主要采用Fmoc方法進(jìn)行合成。在工藝研究過程中，氨基酸縮合、樹脂肽裂解、轉(zhuǎn)型、反相制備純化和冷凍干燥等步驟，對原料藥質(zhì)量均有不同程度的影響。本文論述了在制備工藝的不同步驟，對原料藥質(zhì)量的影響因素以及相應(yīng)的控制策略，從而達(dá)到工藝穩(wěn)定可控，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)原料藥。

【關(guān)鍵詞】固相合成法;多肽;原料藥;工藝控制;

【中圖分類號】TQ464.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-7225（2020）04-0013-01

1引言

隨著現(xiàn)代科技的不斷進(jìn)步，醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域取得了很大程度的突破。多肽類藥物作為醫(yī)藥的一個細(xì)分領(lǐng)域，生物活性廣泛。盡管多肽藥物問世時間較短，但是發(fā)展速度很快，近年來越來越多的多肽類新藥獲批上市。固相合成具有合成效率高和純度高的優(yōu)勢，更容易實(shí)現(xiàn)自動化和工業(yè)化，在醫(yī)藥行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。

2固相合成原理

多肽固相合成法由Merrifield 開創(chuàng)，被授予了諾貝爾化學(xué)獎。固相合成法是選用合適的固相載體，將氨基酸逐個連接到載體上，最后將合成的多肽鏈從載體上釋放出來的一種新型合成方法。合成過程通常是從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固體相載體結(jié)合，然后這一氨基酸的氨基與第二個氨基酸羧基反應(yīng)，重復(fù) （縮合→洗滌→去保護(hù)→洗滌→下一氨基酸縮合）步驟，連接成為長肽鏈^[1]。最后將肽鏈從樹脂中分離出來，再經(jīng)過制備純化等工藝，即獲得所需目標(biāo)產(chǎn)物。

3工藝控制

固相合成法克服了液相合成法中，每一步產(chǎn)物都需后處理的困難。在中間體監(jiān)控方面相對較弱。需要研發(fā)人員對生產(chǎn)工藝的深入研究，降低粗肽中雜質(zhì)含量。以下從氨基酸縮合、樹脂肽裂解、轉(zhuǎn)型、制備純化和冷凍干燥步驟進(jìn)行闡述。

3.1氨基酸縮合

在氨基酸縮合過程中，監(jiān)控縮合反應(yīng)為茚三酮顯色法，此法靈敏度較高。此步驟容易產(chǎn)生消旋轉(zhuǎn)化的異構(gòu)體雜質(zhì)，縮合及脫Fmoc不完全形成的缺失肽雜質(zhì)，以及反應(yīng)試劑活性過高或反應(yīng)條件劇烈形式的插入肽雜質(zhì)。

常見易消旋化氨基酸有Cys、His和Phe，通常在縮合試劑中加入HOBT抑制其消旋，也可以降低反應(yīng)溫度、使用高效縮合試劑、提高物料比等措施，進(jìn)一步降低其消旋程度，控制異構(gòu)體雜質(zhì)。

缺失肽類雜質(zhì)引入有三個途徑：①縮合反應(yīng)不完全：可以通過提高物料比、高效縮合試劑和提高溫度等方式進(jìn)行控制;同時需關(guān)注茚三酮顯色的假陽性現(xiàn)象。②脫Fmoc反應(yīng)不完全：可以通過多次反應(yīng)或提高哌啶濃度等方式進(jìn)行控制。③困難位點(diǎn)：肽序列中含有Val，Ile，Tyr，Phe，Trp，Leu，Gln和Thr等氨基酸，相互比鄰或重復(fù)時，肽鏈?zhǔn)嬲剐圆缓?，合成效率下?sup>[2]?？梢愿淖?nèi)軇w系和降低樹脂取代率來改善其縮合效果。

插入肽類雜質(zhì)在易縮合位點(diǎn)更容易產(chǎn)生，可以通過降低反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度，堿性試劑用量（DIC，DIEA等），避免縮合反應(yīng)過程中Fmoc脫落后繼續(xù)反應(yīng)產(chǎn)生插入肽。

3.2樹脂肽裂解

按照肽序列進(jìn)行氨基酸縮合后得到樹脂肽，需要將其與載體樹脂分割得到目標(biāo)肽。一般采用TFA切割，切割過程中加入乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。主要作為碳正離子俘獲試劑，俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，減少其對部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)。

此步驟容易產(chǎn)生氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基脫落不完全（如Pbf、tBu等）、肽鍵斷裂、非天然氨基酸修飾側(cè)鏈的斷裂，含-SH肽的氧化/聚合等雜質(zhì)，此步驟產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，也比較復(fù)雜。通常從裂解配方、反應(yīng)濃度、裂解溫度、裂解時間等方面進(jìn)行研究和控制，降低其后續(xù)制備純化步驟中難以清除的雜質(zhì)。

3.3 轉(zhuǎn)型

多肽原料藥大多為醋酸鹽形式，樹脂肽采用含三氟乙酸配方進(jìn)行裂解，所得粗肽中一般含約15%的三氟乙酸，需要對其進(jìn)行轉(zhuǎn)鹽處理。目前主要方法有反相C18填料轉(zhuǎn)型、離子交換樹脂和化學(xué)方法除酸等，其中C18填料轉(zhuǎn)型的除去效果最好，但此方法操作繁瑣，成本較高。離子交換樹脂和化學(xué)方法可除去粗肽中大部分三氟乙酸，含量降低至1%左右。同時后續(xù)制備純化步驟也具有一定的除酸效果，從而進(jìn)行控制。結(jié)合工藝簡繁程度和成本，目前這兩種方法更受研究者的青睞。

3.4 制備純化

在多肽原料藥工藝中，制備純化步驟是工藝中除雜最為關(guān)鍵的步驟。工藝中產(chǎn)生的相關(guān)雜質(zhì)，均在此步驟中進(jìn)行有效去除，從而達(dá)到原料藥純度要求。多肽序列的性質(zhì)決定了純化條件，一般根據(jù)酸堿性選擇填料類型，根據(jù)溶解性選擇流動相組成，根據(jù)極性大小選擇梯度條件，同時也相互影響。

在純化主要條件確定后，進(jìn)一步考察上樣量、溶樣體系、流動相PH、制備柱清洗等影響因素，結(jié)合純度和收率等指標(biāo)，確定純化工藝。此步驟一般不會引入新雜質(zhì)，仍需關(guān)注純化液在濃縮和貯存條件下的穩(wěn)定性情況，避免在后處理過程中雜質(zhì)含量增加。

3.5冷凍干燥

多肽類原料藥大多采用冷凍干燥方式獲得成品，凍干步驟一般在有關(guān)物質(zhì)方面較為穩(wěn)定，主要與原料藥的一些化檢指標(biāo)（如醋酸含量、水分、溶液澄清度等）相關(guān)。凍干的影響因素有批量差異、凍干液體積、樣品濃度、凍干液面高度和凍干液溶劑組成，以及凍干程序和設(shè)備穩(wěn)定性^[3]。工藝開發(fā)前期確定其關(guān)鍵影響因素，在中試放大階段進(jìn)一步考察確定，從而達(dá)到穩(wěn)定可控的生產(chǎn)工藝。

綜上所述，由于多肽藥物對某些疾病具有獨(dú)特的治療效果，在過去幾十年里，多肽的應(yīng)用在生物化學(xué)家和醫(yī)務(wù)人員手中得到了越來越多的關(guān)注。多肽合成的出現(xiàn)和發(fā)展，促進(jìn)著醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)步。多肽固相合成目前主要用于中短肽鏈的合成，從氨基酸縮合至冷凍干燥的工藝步驟中，每個步驟均有諸多的影響因素，需要進(jìn)行深入全面的工藝研究，從而開發(fā)出穩(wěn)定可控，優(yōu)質(zhì)的原料藥。對于固相合成中氨基酸縮合反應(yīng)監(jiān)測的弱點(diǎn)，需尋找更合適的監(jiān)測手段，促進(jìn)多肽固相合成技術(shù)的發(fā)展。

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