徐躍嶠 齊猛 尚峰 楊昆 洪韜 曲鑫 王寧

神經(jīng)外科手術(shù)后并發(fā)顱內(nèi)感染可使患者病情加重，治療十分棘手，病死率高達(dá)15%～30%［1］，早期診斷、明確病原菌、合理應(yīng)用抗生素，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。然而，目前針對(duì)腦脊液病原菌的檢查方法，如細(xì)菌涂片和細(xì)菌培養(yǎng)不僅陽性檢出率低且時(shí)間較長(zhǎng)，許多患者由于無法獲得明確的病原學(xué)診斷而被迫接受經(jīng)驗(yàn)性大劑量、“廣覆蓋”抗生素治療，導(dǎo)致抗生素過度應(yīng)用，給患者造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)甚至醫(yī)原性損害。除此之外，還有一些疑似顱內(nèi)感染的患者，可出現(xiàn)腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、葡萄糖下降等異常變化，如何及時(shí)與蛛網(wǎng)膜下腔出血、神經(jīng)外科手術(shù)后腦脊液改變或無菌性腦膜炎相鑒別，長(zhǎng)期以來一直是困擾神經(jīng)外科醫(yī)師的難題。目前，基于宏基因組的第二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）已成功用于腫瘤基因檢測(cè)、無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域，在感染性疾病診治中的應(yīng)用也日益受到重視，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，感染性心內(nèi)膜炎的mNGS陽性檢出率高于血培養(yǎng)和微生物病原學(xué)檢測(cè)［2］。因此推測(cè)，針對(duì)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)周期長(zhǎng)和陽性檢出率低的缺陷，mNGS技術(shù)可能具有補(bǔ)充作用，但迄今尚無這方面的文獻(xiàn)報(bào)道。首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科自2019年初開始嘗試將mNGS技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)外科手術(shù)后并發(fā)顱內(nèi)感染的早期診斷，初步探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料與方法

一、臨床資料

1．診斷標(biāo)準(zhǔn)顱內(nèi)感染的診斷參照《中國(guó)神經(jīng)外科重癥患者感染診治專家共識(shí)（2017）》［3］標(biāo)準(zhǔn)，符合以下4項(xiàng)者臨床確診顱內(nèi)感染：（1）臨床表現(xiàn)，意識(shí)及精神狀態(tài)改變，顱內(nèi)壓增高癥狀與體征，腦膜刺激征陽性，同時(shí)伴顱內(nèi)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的局灶性癥狀，全身感染癥狀表現(xiàn)為體溫異常（＞38℃或＜36℃）、白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、心率和呼吸增快等。（2）影像學(xué)表現(xiàn)，頭部CT和（或）MRI可見腦組織炎癥性改變。（3）血清學(xué)檢測(cè)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞10×109/L或中性粒細(xì)胞比例＞0．80。（4）腰椎穿刺腦脊液檢查，顱內(nèi)壓＞200 mm H2O（1 mm H2O=9．81×10-3kPa）；急性期外觀渾濁、黃色或典型膿性，慢性期在炎癥局限性包裹的情況下可清亮透明；白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞（100～1000）×106/L、多核細(xì)胞比例＞0．70。對(duì)于癥狀與體征不典型的病例，入組滿3周時(shí)由3位神經(jīng)外科專家對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧分析，根據(jù)病情進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果綜合判斷并做出診斷。

2．納入與排除標(biāo)準(zhǔn)（1）臨床疑似顱內(nèi)感染：體溫＞38℃且持續(xù)時(shí)間＞48 h；頸項(xiàng)強(qiáng)直；腰椎穿刺腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加（＞100×106/L）、葡萄糖降低（＜2．60 mmol/L）。（2）年齡≥18歲。（3）既往有神經(jīng)外科手術(shù)、腰椎穿刺或腦室引流等有創(chuàng)性治療史。（4）臨床確診顱內(nèi)感染或近6個(gè)月內(nèi)有明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染史患者均非本研究觀察對(duì)象。（5）本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院道德倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)［審批號(hào)：臨研審（2017）072］。（6）所有患者及其家屬對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目知情并簽署知情同意書。

3．一般資料前瞻性納入2019年1-10月在我院神經(jīng)外科住院治療且擬診術(shù)后顱內(nèi)感染患者共15例，男性9例，女性6例；年齡33～80歲，平均（54．21±14．92）歲。原發(fā)病分別為動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（9例）、顱腦創(chuàng)傷后腦積水（1例）、硬脊膜外膿腫合并腦脊液漏（1例）、靜脈竇血栓形成合并腦出血（1例）、腦室出血（1例）、聽神經(jīng)瘤術(shù)后（1例）和面肌痙攣減壓術(shù)后（1例）。

二、研究方法

1．腦脊液檢測(cè)（1）顱內(nèi)感染常規(guī)檢測(cè)：腰椎穿刺抽取腦脊液10 ml，分別行常規(guī)、生化、細(xì)菌涂片和細(xì)菌培養(yǎng)。其中，細(xì)菌培養(yǎng)需腦脊液標(biāo)本4 ml，在無菌操作下注入需氧血培養(yǎng)瓶中，常溫下2 h內(nèi)送檢。（2）基因檢測(cè)：腰椎穿刺抽取腦脊液1．50 ml，置于-20℃無菌離心管保存，24 h內(nèi)送檢（干冰運(yùn)輸），由迪飛醫(yī)學(xué)科技（南京）有限公司進(jìn)行腦脊液mNGS測(cè)序。取腦脊液1 ml，采用混懸液提取基因組DNA，經(jīng)DNA質(zhì)檢后進(jìn)入建庫(kù)流程，文庫(kù)質(zhì)檢后采用Illumina Nextseq 550Dx平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)剔除人源序列，將非人源序列與病原微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，計(jì)算序列數(shù)和相對(duì)豐度。根據(jù)生物信息分析列表，結(jié)合大樣本分析獲得黑名單和白名單，A針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌和嗜肺軍團(tuán)菌，檢出1條特異性序列即為陽性；B針對(duì)其他細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲，檢出3條非重復(fù)特異性序列即為陽性；C的物種檢出序列數(shù)小于其在陰性對(duì)照中的10倍，則剔除該物種。按照上述閾值篩選病原微生物列表和疑似背景微生物列表，并輔以序列數(shù)和結(jié)果注釋。mNGS序列數(shù)＞100為基因檢測(cè)呈陽性。

2．血清學(xué)檢測(cè)采集初次擬診顱內(nèi)感染患者的外周靜脈血共10 ml，分別行血常規(guī)、生化、C-反應(yīng)蛋白（CRP，1～8 mg/L）和降鈣素原（PCT，＜0．05 ng/ml）測(cè)定。

3．治療方法根據(jù)患者病情嚴(yán)重程度采取經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，首選萬古霉素1 g/次（2次/d）和美羅培南2 g/次（3次/d）靜脈滴注，治療3 d后癥狀明顯減輕或消失，連續(xù)檢測(cè)腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)減少、葡萄糖恢復(fù)至正常值范圍，腦脊液細(xì)菌涂片和細(xì)菌培養(yǎng)均呈陰性者，排除顱內(nèi)感染，停用抗生素。對(duì)于腦脊液細(xì)菌涂片、細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS測(cè)序均呈陰性者，若臨床癥狀持續(xù)或加重，腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)不降或持續(xù)增加、葡萄糖水平不升或持續(xù)降低，仍支持顱內(nèi)感染診斷，繼續(xù)原定抗感染方案或聯(lián)合其他抗生素治療；而腦脊液細(xì)菌涂片和細(xì)菌培養(yǎng)均呈陽性患者，需結(jié)合病情嚴(yán)重程度，根據(jù)病原學(xué)檢查結(jié)果合理選擇抗生素治療。

4．統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P≤0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1腦脊液mNGS測(cè)序診斷術(shù)后顱內(nèi)感染的靈敏度和特異度Table 1. Sensitivity and specificity of CSF mNGS sequencing in the diagnosis of intracranial infection after neurosurgery

結(jié) 果

15例患者最終確診顱內(nèi)感染8例，其中4例腦脊液mNGS測(cè)序呈陽性（序列數(shù)分別為212、329、1601和5371），病原菌檢測(cè)分別包括鮑曼不動(dòng)桿菌（2例）、皮特不動(dòng)桿菌（1例）和產(chǎn)氣腸桿菌（1例），與腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一致，同時(shí)伴腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)增加［分別為（1481、9722、3481、131）×106/L］和葡萄糖降低（分別為2．53、0．02、0．91、1．60 mmol/L）。其余4例經(jīng)為期2周隨訪，臨床確診為顱內(nèi)感染，但腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS測(cè)序均呈陰性，其中1例發(fā)熱次日腦脊液細(xì)菌涂片呈陽性（陽性球菌），但細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS測(cè)序呈陰性；3例臨床診斷明確，但腦脊液細(xì)菌涂片、細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS測(cè)序均呈陰性，考慮為采集腦脊液標(biāo)本時(shí)已接受抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療并臨床癥狀好轉(zhuǎn)，與標(biāo)本中細(xì)菌量不足有關(guān)。臨床診斷為無菌性腦膜炎7例，其中3例腦脊液mNGS測(cè)序測(cè)得背景細(xì)菌基因序列，但序列數(shù)均＜100；1例蛛網(wǎng)膜下腔出血伴急性腦積水行腦室外引流術(shù)患者，引流8 d后拔除引流管，管頭細(xì)菌培養(yǎng)為表皮葡萄球菌，但mGNS測(cè)序呈陰性，隨訪2周，無感染癥狀，確診管頭細(xì)菌培養(yǎng)陽性為表皮葡萄球菌污染所致。腦脊液mNGS測(cè)序診斷術(shù)后顱內(nèi)感染靈敏度為4/8、特異度為7/7，準(zhǔn)確率為11/15（表1）。8例臨床確診術(shù)后顱內(nèi)感染患者的臨床資料參見表2。

典型病例

患者女性，39歲。因動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后2個(gè)月，左側(cè)顱骨缺損伴腦積水、右側(cè)硬膜下積液需手術(shù)治療，于2019年1月3日入院，并于1月15日行腰大池引流術(shù)，1月18日再次行顱骨修補(bǔ)術(shù)。引流術(shù)后7天出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高達(dá)39．2℃，呈弛張熱，伴頸項(xiàng)強(qiáng)直，擬診術(shù)后顱內(nèi)感染。遂于1月22日行腰椎穿刺抽取腦脊液10 ml，外觀渾濁，細(xì)胞總數(shù)11 322×106/L、白細(xì)胞計(jì)數(shù)9722×106/L、分葉核中性粒細(xì)胞比例0．86，葡萄糖低至0．02 mmol/L；細(xì)菌涂片可見革蘭陰性球菌和桿菌生長(zhǎng)；mNGS測(cè)序提示病原菌為鮑曼不動(dòng)桿菌，序列數(shù)為1601（圖1）；多次細(xì)菌培養(yǎng)均證實(shí)為鮑曼不動(dòng)桿菌。血清學(xué)檢查：白細(xì)胞計(jì)數(shù)15．34×109/L、中性粒細(xì)胞比例0．887，C-反應(yīng)蛋白27．20 mg/L。臨床確診為術(shù)后顱內(nèi)感染，病原菌為鮑曼不動(dòng)桿菌。遂予以美羅培南2 g/次（3次/d）靜脈滴注，替加環(huán)素50 mg/次（2次/d）靜脈滴注、5 mg腦室內(nèi)注射，連續(xù)3周，以及多粘菌素B 50 mg/次（2次/d）靜脈滴注、5 mg/次（2次/d）鞘內(nèi)注射，連續(xù)治療5天，顱內(nèi)感染癥狀顯著好轉(zhuǎn)。由于存在腦積水，擬進(jìn)一步行腦室-腹腔分流術(shù)。治療3周后復(fù)查腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)呈陰性，mNGS測(cè)序鮑曼不動(dòng)桿菌序列數(shù)為8，結(jié)合腦脊液外觀清亮、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和葡萄糖均于正常值范圍，考慮顱內(nèi)感染治愈，于3月8日行腦室-腹腔分流術(shù)，術(shù)后未再發(fā)生顱內(nèi)感染。

表2 8例臨床確診術(shù)后顱內(nèi)感染患者的臨床資料Table 2.Clinical data of 8 patients with intracranial infection after neurosurgery

討 論

基于神經(jīng)外科開顱手術(shù)對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔和腦組織結(jié)構(gòu)的影響，以及手術(shù)所用人工材料引起的異物反應(yīng)，均可能是術(shù)后誘發(fā)無菌性腦膜炎的原因；臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛或頸項(xiàng)強(qiáng)直等，這些癥狀通常也是術(shù)后細(xì)菌性腦膜炎的表現(xiàn)，僅根據(jù)癥狀與體征難以對(duì)細(xì)菌性腦膜炎與無菌性腦膜炎進(jìn)行早期鑒別，而二者治療方案完全不同。因此，如何對(duì)術(shù)后細(xì)菌性腦膜炎與無菌性腦膜炎做出快速鑒別診斷，是神經(jīng)外科最迫切的需求之一［4］，也是一直以來神經(jīng)外科與臨床微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)［5］。目前腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)菌涂片和細(xì)菌培養(yǎng)均無法滿足這一早期鑒別診斷的需求，已知的檢測(cè)技術(shù)主要有基因芯片［6］、多模態(tài)檢測(cè)［4］等，目前尚未廣泛應(yīng)用于臨床。

本研究對(duì)腦脊液mNGS測(cè)序診斷術(shù)后顱內(nèi)感染的價(jià)值進(jìn)行初步探討，其結(jié)果顯示，腦脊液mNGS測(cè)序與腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)符合率較好。本組15例患者中8例臨床確診為顱內(nèi)感染，其中4例腦脊液mNGS測(cè)序和細(xì)菌培養(yǎng)均呈陽性，其余4例經(jīng)隨訪也臨床確診為顱內(nèi)感染，但腦脊液mNGS測(cè)序和細(xì)菌培養(yǎng)均呈陰性，考慮與留取標(biāo)本時(shí)已應(yīng)用抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療，標(biāo)本中細(xì)菌量不足有關(guān)。提示對(duì)于臨床疑似顱內(nèi)感染的患者應(yīng)盡量在抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療之前采集腦脊液標(biāo)本，或感染早期腦脊液存在細(xì)菌量相對(duì)較多時(shí)留取標(biāo)本。鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者治愈后，其腦脊液mNGS測(cè)序仍能測(cè)出少量序列數(shù)，考慮為細(xì)菌DNA片段殘留，但數(shù)量極少。本組有1例腰大池引流術(shù)+顱骨修補(bǔ)術(shù)后鮑曼不動(dòng)桿菌感染患者，抗生素治療3周后復(fù)查mNGS測(cè)序，鮑曼不動(dòng)桿菌序列數(shù)為8，結(jié)合復(fù)查細(xì)菌培養(yǎng)陰性，以及腦脊液外觀、常規(guī)和生化指標(biāo)均正常，考慮顱內(nèi)感染治愈，進(jìn)一步行腦室-腹腔分流術(shù)，術(shù)后未再發(fā)生顱內(nèi)感染，證實(shí)顱內(nèi)感染治愈，提示mNGS測(cè)序有助于判斷顱內(nèi)感染后腦室-腹腔分流術(shù)的時(shí)機(jī)。

圖1腦脊液mNGS測(cè)序檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌特異性序列數(shù)為1601，基因組覆蓋度為23．02%Figure 1 CSF mNGS showed the specific sequence number of Acinetobacter baumannii was 1601,and the genome coverage was 23．02%．

神經(jīng)外科術(shù)后易導(dǎo)致顱內(nèi)感染的致病菌主要包括表皮葡萄球菌、不動(dòng)桿菌或肺炎克雷伯桿菌等，其中尤以鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯桿菌等引起的嚴(yán)重化膿性腦室炎最為嚴(yán)重且治療困難［7-8］。本組患者腦脊液mNGS測(cè)序和細(xì)菌培養(yǎng)呈陽性的致病菌分別為不動(dòng)桿菌3例（鮑曼不動(dòng)桿菌2例和皮特不動(dòng)桿菌1例）、產(chǎn)氣腸桿菌1例，均為革蘭陰性桿菌，可能與此類細(xì)菌對(duì)抗生素治療不敏感，較易獲得陽性結(jié)果有關(guān)。而陽性菌感染患者，如果早期合理應(yīng)用抗生素，可迅速控制病情并使細(xì)菌量顯著減少，導(dǎo)致腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)和mNGS測(cè)序均呈陰性。

基因檢測(cè)和測(cè)序技術(shù)目前是多個(gè)感染相關(guān)學(xué)科的研究熱點(diǎn)，但用于神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)感染的診斷，目前國(guó)內(nèi)尚未見諸報(bào)道。理論上，無論細(xì)菌存活或死亡均可檢測(cè)到DNA片段，故腦脊液mNGS陽性率理論上應(yīng)該高于細(xì)菌培養(yǎng)陽性率，但就本組患者而言，由于臨床檢驗(yàn)條件的限制，腦脊液基因檢測(cè)需外送標(biāo)本，不能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行mNGS測(cè)序，這可能是mNGS測(cè)序陽性率較低的原因?；驒z測(cè)作為一項(xiàng)新的技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)罕見病原體如病毒或罕見細(xì)菌、真菌方面具有不可替代的作用［9-10］，但是該技術(shù)檢測(cè)成本較高、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)（24～48小時(shí)），對(duì)于發(fā)病急驟、病情進(jìn)展迅速的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者而言，影響其時(shí)效性［11］，因此，該項(xiàng)技術(shù)用于神經(jīng)外科手術(shù)后顱內(nèi)感染的診治尚待進(jìn)一步摸索送檢標(biāo)本方案以提高檢測(cè)速度和陽性率，方能更好地服務(wù)于臨床，優(yōu)化治療方案，改善患者預(yù)后。

利益沖突無