楊妮，劉素純,2*，王繼剛，李幸，劉梟雄

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410128)2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙，410128)

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是廣泛存在于茯磚茶中并使其產(chǎn)生特征風(fēng)味的優(yōu)勢(shì)菌種[1]，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊屬的一種真菌[2]，因其在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生金黃色的閉囊殼,故俗稱(chēng)“金花菌”。因冠突散囊菌具有降脂、抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等生理活性[3-6]，使得人們?cè)絹?lái)越青睞對(duì)冠突散囊菌的研究。冠突散囊菌生長(zhǎng)時(shí)通常會(huì)代謝產(chǎn)生大量的色素物質(zhì)[7]，初期主要色素為黃色素，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)伴隨著黑色素的產(chǎn)生，但其研究鮮見(jiàn)報(bào)道。黑色素廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是所有已知生物色素中存在最多、最廣的一類(lèi)色素[8]，研究表明，黑色素具有獨(dú)特的生理功能[9]，如避免光對(duì)生物體的傷害[10]、強(qiáng)抗氧化性[11-13]、抗癌[14-15]、抗輻射[16]、免疫調(diào)節(jié)[17-19]等作用，因此黑色素具有廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)擬采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探討各因素之間交互作用對(duì)黑色素含量的影響，并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為微生物源天然功能性色素的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)，由湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶中分離獲得。

冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水1 L。

培養(yǎng)條件：裝液量120 mL，轉(zhuǎn)速140～220 r/min，培養(yǎng)溫度24～32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間10 d。

NaOH、Na2SO3、H2O2和濃HCl(化學(xué)純),由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQPL-200全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；XMTD 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海浦東物理光學(xué)儀器廠；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UH5300型分光光度計(jì)，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵液的制備及黑色素的提取

黑色素發(fā)酵液的制備：取活化后的冠突散囊菌菌種接種于裝有120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置28 ℃搖床中，180 r/min，培養(yǎng)10 d，過(guò)濾得冠突散囊菌發(fā)酵液。

黑色素的提取：據(jù)前期試驗(yàn)得出的最優(yōu)提取工藝進(jìn)行提取，準(zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液50 mL，加入70 mL 1 mol/L 的NaOH溶液，在74 ℃水浴中攪拌提取，趁熱過(guò)濾，再酸沉(用6 mol/L HCl調(diào)濾液至pH值為2.5 后置于74 ℃水浴中靜置4 h，使冠突散囊菌胞外黑色素絮凝使其沉淀)，然后離心去除上清液得到黑色沉淀物，用蒸餾水洗至中性，冷凍干燥后得到黑色素粗品，依次采用乙酸乙酯、氯仿和乙醇分別對(duì)黑色素粗品進(jìn)行萃取提純，冷凍干燥后得到冠突散囊菌胞外黑色素。

1.3.2 色素吸收光譜的測(cè)定

取一定量上述黑色素溶于1 mol/L 的NaOH溶液中，并以1 mol/L的NaOH溶液作參比液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～800 nm進(jìn)行光譜掃描[20]，測(cè)定黑色素的最大吸收峰值λmax。再用1 mol/L 的NaOH溶液將黑色素溶液稀釋10、20、30、40、50倍，用分光光度計(jì)在λmax處測(cè)定各稀釋液的吸光度。記錄各稀釋倍數(shù)的吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算其線性相關(guān)性。

1.3.3 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件優(yōu)化

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基(自然pH)，接種冠突散囊菌后分別置于24、26、28、30、32 ℃搖床中轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應(yīng)結(jié)束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。

1.3.3.2 培養(yǎng)基pH對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值為5、6、7、8、9，接種冠突散囊菌后于28 ℃搖床中轉(zhuǎn)速為180 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應(yīng)結(jié)束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。

1.3.3.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

將冠突散囊菌發(fā)酵培養(yǎng)基接種冠突散囊菌后于28 ℃搖床中分別以轉(zhuǎn)速140、160、180、200、220 r/min培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液與等體積的1 mol/L 的NaOH于74 ℃水浴中攪拌提取，反應(yīng)結(jié)束后5 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其在λmax處吸光值，吸光值越高表示黑色素含量越高。每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 響應(yīng)面法對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件的優(yōu)化

以培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH、搖床轉(zhuǎn)速作自變量，冠突散囊菌黑色素吸光值為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，確定冠突散囊菌黑色素的最佳發(fā)酵條件參數(shù)。試驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表1。

1.3.5 冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的研究

1.3.5.1 光照對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

取黑色素溶液分為3份，2份分別于自然光、黑暗環(huán)境中放置3 d，每隔1 d取樣測(cè)定其在λmax處吸光值，另一份置于紫外燈下，每30 min取樣測(cè)定其在λmax處吸光值，觀察光照對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5.2 溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

取黑色素溶液分為4份，1份置于室溫(25 ℃)中避光保存，其余3份分別置于50、70、100 ℃水浴鍋中避光保溫，每30 min取樣，待溶液降溫至室溫后測(cè)定其在λmax處吸光值，觀察溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5.3 氧化劑、還原劑對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

以H2O2為氧化劑、Na2SO3為還原劑，配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的H2O2溶液，0.1%、0.3%、0.5%、1%、1.5%的Na2SO3溶液，分別量取2 mL加入到8 mL黑色素溶液，于室溫中避光放置1 h后測(cè)定其在λmax處吸光值。

1.3.5.4 金屬離子對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

配置0.05 mol/L的MgCl2、NaCl、ZnCl2、CaCl2、FeCl3、CuCl2溶液，分別量取2 mL加入到8 mL黑色素溶液，于室溫中避光放置1 h測(cè)定其在λmax處吸光值，觀察金屬離子對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 10.0.3和SPSS 22.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素吸收光譜的確定

圖1為冠突散囊菌胞外黑色素紫外-可見(jiàn)光譜圖，該種黑色素在紫外可見(jiàn)光區(qū)域里，吸收值隨著波長(zhǎng)的增大而降低，且在298 nm處有最大吸收峰,這一特征與吳世玉等[21]，CHENG等[22]和SELVAKUMAR等[23]的結(jié)果十分相似。色素溶液線性關(guān)系表明不同濃度的色素溶液在298 nm 處與吸光值具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為y=-0.015 9x+1.924，R2=0.991 3，說(shuō)明采用吸光度來(lái)研究色素穩(wěn)定性是合理可行的。

圖1 冠突散囊菌胞外黑色素的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

2.2 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 培養(yǎng)溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，吸光值達(dá)到最大1.107。根據(jù)郭勁霞等[24]的研究發(fā)現(xiàn),溫度對(duì)冠突散囊菌的生長(zhǎng)有雙重效應(yīng)。當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，冠突散囊菌生長(zhǎng)受到抑制，過(guò)高溫度在一定程度上也會(huì)影響微生物代謝的酶系[25]，從而影響黑色素的生成。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.2.2 培養(yǎng)基pH對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

不同培養(yǎng)基pH對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著pH的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為7時(shí)，吸光值達(dá)到最大1.1。在微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中，培養(yǎng)基pH起著重要的作用，陳云蘭[26]研究發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌在偏酸性的條件下生長(zhǎng)較好，偏堿性的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)緩慢，影響黑色素的生成。

圖3 pH對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，冠突散囊菌胞外黑色素的吸光值隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，吸光值達(dá)到最大1.067。適宜的搖床轉(zhuǎn)速能提高溶氧量，有利于冠突散囊菌的生長(zhǎng)及黑色素的生成[27]，過(guò)高的轉(zhuǎn)速可導(dǎo)致真菌菌絲體破碎自溶[28]，不利于黑色素的生成。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken采樣原理，選擇轉(zhuǎn)速、溫度、pH進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 10.0.3軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：吸光值=1.267 6+0.085 25×A+0.105 875×B+0.011 375×C+0.069 25×AB+0.027 25×AC+0.002 5×B-0.162 8×A2-0.129 55×B2-0.120 55×C2

表3 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

響應(yīng)面和等高線圖如圖5所示，等高線圖呈現(xiàn)橢圓狀，交互作用顯著，等高線圖呈現(xiàn)圓狀，交互作用不顯著。根據(jù)Design-Expert 10.0.3 軟件運(yùn)行結(jié)果，最優(yōu)發(fā)酵條件組合為轉(zhuǎn)速 184.096 r/min、溫度 29.145 ℃、pH 6.771，在此條件下模型預(yù)測(cè)的理論吸光值為1.294。

a-溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)吸光值影響的響應(yīng)曲面；b-溫度、轉(zhuǎn)速對(duì)吸光值影響的等高線；c-pH、轉(zhuǎn)速對(duì)吸光值影響的響應(yīng)曲面；d-pH、轉(zhuǎn)速對(duì)吸光值影響的等高線；e-pH、溫度對(duì)吸光值影響的響應(yīng)曲面；f-pH、溫度對(duì)吸光值影響的等高線

考慮到操作的可行性，將最優(yōu)發(fā)酵條件修改為轉(zhuǎn)速 184 r/min、溫度 29 ℃、pH 6.8并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，在該條件下黑色素吸光值為1.273，在該發(fā)酵條件下提取獲得冠突散囊菌胞外黑色素4.27 g/L。

2.4 冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的研究

2.4.1 光照對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表4可知，自然光對(duì)該色素穩(wěn)定性有一定影響，冠突散囊菌胞外黑色素在自然光照條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，色素逐漸降解，吸光度降低，放置3 d后，色素?fù)p失率為14.12%；避光保存對(duì)該色素穩(wěn)定性較好，冠突散囊菌胞外黑色素在黑暗條件下保存3 d，其損失率僅為4.33%；紫外光對(duì)該色素穩(wěn)定性有較大的影響，冠突散囊菌胞外黑色素在紫外燈下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液吸光度降低，3 h后色素?fù)p失率達(dá)到19.69%。試驗(yàn)表明，光照會(huì)對(duì)冠突散囊菌產(chǎn)生不利影響，該種色素應(yīng)避光保存，且不具備良好的抗紫外輻射能力。

表4 不同光處理對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.2 溫度對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表5可知，于室溫中保存的該色素穩(wěn)定性較好，其溶液吸光值并無(wú)明顯變化；隨著溫度上升，該色素穩(wěn)定性下降，冠突散囊菌胞外黑色素處于100 ℃時(shí)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，吸光值降低，90 min時(shí)其損失率為24.64%，但在70 ℃和50 ℃環(huán)境下，其損失率均低于10%，說(shuō)明冠突散囊菌胞外黑色素具有一定的耐熱性，該色素在應(yīng)盡量在低于70 ℃時(shí)使用，避免高溫受熱。

表5 溫度對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.3 氧化劑、還原劑對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表6可知，隨著H2O2溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黑色素吸光值呈下降趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，其損失率達(dá)39.42%，說(shuō)明該種黑色素容易被H2O2氧化褪色，在使用過(guò)程中應(yīng)盡量避免與強(qiáng)氧化劑接觸。當(dāng)加入低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO3時(shí)，黑色素吸光值呈下降趨勢(shì)，當(dāng)Na2SO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí)，其損失率為11.26%，說(shuō)明黑色素發(fā)生了一定程度的降解，但Na2SO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大時(shí)，黑色素溶液吸光值變化不大，說(shuō)明該種黑色素有一定的耐還原性。

表6 氧化劑、還原劑對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

2.4.4 金屬離子對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素穩(wěn)定性的影響

由表7可知， 該種黑色素對(duì)0.05 mol/L的金屬離子有著較好的穩(wěn)定性，但不同金屬離子的影響程度不同，Na+對(duì)溶液無(wú)明顯影響，Mg2+、Zn2+、Fe3+具有增效作用，其中Fe3+作用效果最好，Ca2+、Cu2+具有降效作用，使用過(guò)程中應(yīng)盡量減少與這含2種離子的化合物接觸。

表7 金屬離子對(duì)黑色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了可靠的二次多項(xiàng)模型。通過(guò)方差分析表明，模型的擬合度較好，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速 184 r/min、溫度 29 ℃、pH 6.8，在該發(fā)酵條件下提取獲得冠突散囊菌胞外黑色素4.27 g/L。所得黑色素在70 ℃以下耐熱性強(qiáng)， Mg2+、Zn2+、Fe3+對(duì)其的穩(wěn)定性有增強(qiáng)作用，該黑色素應(yīng)避光保存，在使用過(guò)程中應(yīng)避免與強(qiáng)氧化劑和還原劑接觸。