李佳瑩，劉暘(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院風濕免疫科，呼和浩特 010050)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性炎癥、持續(xù)性滑膜炎和滑膜關節(jié)破壞為特征的自身免疫病[1-2]。輔助性T 細胞17(T helper cell 17,TH17)及其效應細胞因子是炎癥、自身免疫和變態(tài)反應的關鍵參與者，并與調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory cells, Tregs)的活性密切相關，共同參與了RA的調(diào)節(jié)[3]。目前，RA患者仍然沒有十分有效的治療方法，因此迫切需要闡明RA的分子機制，以尋求RA的潛在治療靶點。

研究表明，RA患者T細胞或外周血單核細胞(PBMC)中miRNA的表達調(diào)控與炎癥和先天免疫有關[4-6]。在原發(fā)性免疫血小板減少癥患者中,miR-99a通過抑制TH17促進因子——哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達，導致患者體內(nèi)TH17/Treg失衡；而血漿或血清中miR-99a的表達水平顯著升高，可能作為卵巢癌等腫瘤疾病的前瞻性生物學標志物[4,7]。miR-99a的表達是否影響RA患者TH17/Treg的調(diào)節(jié)失衡目前尚不清楚。因此，本研究旨在通過檢測miR-99a、TH17/Treg相關的細胞因子、轉錄因子以及炎癥相關因子，分析RA患者miR-99a表達與TH17/Treg失衡之間的相關性，以尋找RA的可能發(fā)展機制。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2014年5月至2019年5月在我院就診的RA患者80例作為病例組，男16例，女64例，年齡(46.5±14.8)歲，均符合美國風濕病協(xié)會(ACR)2010年修訂的RA診斷標準[8]。排除有嚴重肝病、糖尿病、腎病、甲狀腺、心臟、腫瘤疾病者，以及全身性使用高劑量激素患者或有長期吸煙、飲酒史的人群。按照疾病的活動性評分(DAS28)分為活動期RA組[42例，男8例，女34例，年齡(40.3±12.4)歲]，穩(wěn)定期RA組[(38例，男8例，女30例，年齡(44.1±13.7)歲]。收集同期于體檢中心就診的體檢健康者42例作為健康人對照組，男16例，女26例，年齡(43.9±13.3)歲。3組受試者年齡和性別差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準(No.WZ2020008)，所有研究對象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，PT-3502型酶聯(lián)儀(北京普天新橋公司)，ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)，Synegene凝膠成像系統(tǒng)(英國 Syngene 公司)。Ficoll試劑、逆轉錄試劑盒、CD4+T細胞分離試劑盒、胎牛血清、蛋白轉運抑制劑BFA、SYBR實時熒光定量試劑盒、Trizol試劑(北京索萊寶公司)，IL-17、IL-6、TFN-α、IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA檢測試劑盒(上海恒遠生物科技公司)，兔抗人RORγt多克隆抗體、兔抗人FoxP3多克隆抗體和兔抗人β-actin多克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔二抗、FITC標記的小鼠抗人CD4抗體、PE-Cy5標記的小鼠抗人CD25單克隆熒光抗體、PE標記的小鼠抗人CD4抗體、PE標記的兔抗人IL-17抗體、羊抗兔IgG二抗、ECL Plus試劑、蛋白質裂解液(武漢三鷹生物技術公司)。

1.3標本采集及細胞分離 采集各患者就診時和健康人體檢時的空腹靜脈血10 mL，肝素(20 U/mL)抗凝。新鮮血液于2 h內(nèi)2 000×g離心10 min，取上清液，置于-20 ℃保存。其余血液采用密度梯度離心法，按照Ficoll試劑說明書分離PBMC，PBS洗滌3次后備用。

1.4流式細胞術分選TH17和Treg細胞 取1.3中的各組PBMC 5 mL，按照CD4+T細胞分離試劑盒及FACS Calibur流式細胞儀說明書操作檢測CD4+T淋巴細胞亞群。

1.4.1TH17細胞測定 取1.3中分離得到的PBMC，用PBS重懸至1×106/mL，在細胞懸液中加入新鮮配制的細胞活化液。取PBMC懸液至24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育5 h?；罨蟮募毎尤隖ITC標記的小鼠抗人CD4抗體(1∶1 000稀釋)，室溫避光溫育20 min。加入PE標記的兔抗人IL-17抗體(1∶1 000稀釋)。同時設同型管加入等量同型對照抗體(小鼠抗人IgG1)用于確認抗體特異性及調(diào)節(jié)熒光補色，加入PE標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)，采用FACS Calibur流式細胞儀及配套的Cellquest軟件分析結果，每個樣本分析1×106個細胞，以CD4+IL-17+在CD4+T細胞中的百分比表示為TH17細胞比率。

1.4.2Treg細胞測定 取上述PBMC細胞懸液，加入PE標記的小鼠抗人CD4抗體(1∶1 000稀釋)和PE-Cy5標記的小鼠抗人CD25單克隆熒光抗體(1∶1 000稀釋)，室溫避光溫育15 min。加入FITC標記的兔抗人Foxp3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，同時設同型管加入等量同型對照抗體(小鼠抗人IgG1)用于確認抗體特異性及調(diào)節(jié)熒光補色，采用FACS Calibur流式細胞儀及配套的Cellquest軟件分析結果，以CD4+CD25+FoxP3+在CD4+T細胞中的百分比表示為Treg細胞。

1.5ELISA法檢測血清細胞因子 按照IL-17、IL-6、TFN-α、IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書操作，采用PT-3502型酶聯(lián)儀在450 nm處檢測吸光度(A)值，并繪制標準曲線。結果判讀：IL-4：62.50～2 000 pg/mL,IL-6：6.25～200 pg/mL，IL-10：9.4～3 000 pg/mL，IL-17：62.50～4 000 pg/mL，TFN-α：16.80～1 000 pg/mL和IFN-γ：46.80～3 000 pg/mL。

1.6miR-99a及相關轉錄因子檢測 嚴格按照Trizol試劑說明書提取1.3中5 mL PBMC中的總RNA，用 NanoDrop 2000 超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取吸光度 (A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，樣本置-20 ℃保存。根據(jù) Genbank 數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計，并由上海生工公司合成。引物序列見表1。采用 ABI 7500實時熒光定量PCR儀檢測miR-99a的表達，以U6作為內(nèi)參照，PCR總反應體系為20 μL，包括：0.3 mmol/L dNTPs 2.0 μL，1× GC-I buffer 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，模板DNA 1.0 μL，ddH2O補足至20 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。RORγt和FoxP3mRNA檢測以β-actin作為內(nèi)參照，反應體系同上，循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。使用Step OneTM軟件采集熒光信號并進行熔解曲線分析，各基因的相對表達水平用Ct表示，并以2-△△Ct法計算。每組設3個復孔，試驗重復3次。

1.7western blot檢測RORγt和FoxP3蛋白 取各組PBMC 5 mL，經(jīng)蛋白質裂解液充分裂解后，用BCA法測定蛋白質濃度，按50 μg的總蛋白質量進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用160 V電壓)，電泳結束后在350 mA恒流條件下4 h，將蛋白質轉移至PVDF膜上。轉膜結束后將膜置于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉2 h，分別加入兔抗人RORγt多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人FoxP3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)和兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃溫育過夜。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000稀釋)，室溫溫育2h，TBS-T漂洗，按照ECL Plus試劑說明書進行顯色及成像。采用Synegene凝膠成像系統(tǒng)掃描目的條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，試驗重復3次。

2 結果

2.1RA患者TH17和Treg細胞的檢測結果 活動期和穩(wěn)定期RA患者的TH17細胞數(shù)顯著多于健康人對照組，且活動期RA患者的TH17細胞數(shù)顯著多于穩(wěn)定期RA患者(P均<0.01)；Treg細胞數(shù)在活動期和穩(wěn)定期RA患者中的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但與健康人對照組相比，穩(wěn)定期患者和活動期患者的Treg細胞數(shù)均顯著升高，見表2。

表2RA患者和健康人對照組TH17和Treg細胞的檢測結果

2.2RA患者特異性轉錄因子RORγt和FoxP3mRNA及蛋白質的表達情況 活動期和穩(wěn)定期RA患者RORγtmRNA和蛋白質的表達量顯著高于健康人對照組；而活動期RA患者FoxP3mRNA和蛋白質表達量顯著低于穩(wěn)定期RA患者和健康人對照組，但健康人對照組與穩(wěn)定期RA患者間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3RA患者和健康人對照組RORγt和Foxp3 mRNA及蛋白質的表達

2.3RA患者各種細胞因子的表達水平變化 活動期和穩(wěn)定期RA患者血清IL-17、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達水平均顯著高于健康人對照組，且活動期RA患者顯著高于穩(wěn)定期RA患者(P均<0.01)。而活動期和穩(wěn)定期RA患者血清IL-10和IL-4的表達水平均顯著低于健康人對照組，且活動期RA患者顯著低于穩(wěn)定期RA患者(P均<0.01)，見表4。

表4RA患者和健康人對照組各細胞因子水平比較

2.4RA患者TH17及Treg細胞中miR-99a的表達比較 活動期RA患者的TH17細胞中miR-99a表達水平顯著高于穩(wěn)定期RA患者，且二者均顯著高于健康人對照組；活動期RA患者Treg細胞中miR-99a表達水平顯著低于穩(wěn)定期RA患者，且二者顯著低于健康人對照組(P均<0.01)。此外，穩(wěn)定期和活動期RA患者TH17細胞中miR-99a的表達水平顯著高于Treg細胞(P<0.01)，見表5。

表5RA患者和健康人對照組中miR-99a的相對表達水平

2.5TH17和Treg細胞中miR-99a的表達與其轉錄因子的相關性分析 Pearson分析結果表明，TH17細胞中miR-99a表達與RORγtmRNA 呈正相關(r=0.721，P<0.01)，而Treg細胞中miR-99a的表達與FoxP3mRNA亦呈正相關(r=0.815，P<0.01)。

3 討論

大量研究表明，TH17/Treg細胞的失衡可導致包括RA在內(nèi)的炎性自身免疫性疾病，致使滑膜炎、關節(jié)軟骨發(fā)生破壞，但其具體的調(diào)節(jié)機制目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血中TH17細胞數(shù)增加,Treg細胞數(shù)減少，而非活動期RA患者外周血中TH17/Treg細胞比例顯著高于健康人對照組，但明顯低于活動期RA患者。此外，本研究發(fā)現(xiàn)在RA患者中TH17相關細胞因子如IL-17、IL- 6、TNF-α和IFN-γ的表達水平顯著增加，Treg相關細胞因子IL-10的表達水平顯著減少。這種失衡可能是由于淋巴細胞或脂多糖能夠刺激單核細胞或者巨噬細胞分泌大量的炎癥細胞因子，促進TH17細胞的分化，抑制Treg細胞的發(fā)育[4-6]。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)在活動期RA患者中，TH17細胞特異性轉錄因子RORγt的表達量顯著高于健康人對照組，Treg細胞特異性轉錄因子FoxP3的表達量顯著低于健康人對照組。與Klein等[9]發(fā)現(xiàn)在RA患者中TH17細胞增加且與RORγt表達量密切相關的結果較為一致。表明RA患者TH17/Treg失衡與特異性轉錄因子RORγt和FoxP3有著密切的關系，并且證實改變RORγt和FoxP3的表達可能是調(diào)節(jié)TH17/Treg細胞失衡的新機制。

為了進一步探究RA與TH17/Treg細胞失衡的調(diào)節(jié)機制，我們檢測了RA患者和健康人群外周血中miR-99a的表達，并分析了TH17/Treg細胞失衡與miR-99a的相關性，結果顯示，在TH17細胞中，穩(wěn)定期RA患者miR-99a的表達水平顯著高于健康人對照組，而在Treg細胞中，穩(wěn)定期RA患者miR-99a的表達顯著低于健康人對照組。但無論RA患者在活動期還是穩(wěn)定期，TH17細胞中miR-99a的表達水平均顯著高于Treg細胞。Zhu等[10]研究證實，miR-99a是一種抑制基因，可以通過調(diào)控T細胞的活化抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，與本研究結果較為一致。本研究還發(fā)現(xiàn)在RA患者中，miR-99a可能通過影響TH17/Treg細胞的失衡從而加速疾病進程。因此，檢測miR-99a的表達水平可能是一種早期診斷和監(jiān)測RA進展的潛在指標。

Jaiswal等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miR-99a可能參與調(diào)控TNF-α等炎癥因子。本研究檢測了不同人群中炎癥相關因子的表達情況，并分析TH17/Treg細胞失衡的相關性。結果顯示， IL-17、IL-6、TNF-α和IFN-γ等TH17細胞相關因子在RA患者中的表達水平顯著高于健康人對照組，且與miR-99a的表達密切相關。故而推測miR-99a可能通過促進TH17細胞增殖、Treg細胞凋亡，致使TH17/Treg 細胞調(diào)節(jié)失衡，進而影響了機體炎癥相關因子的表達，促進了機體炎癥的發(fā)生，最終加速了RA的進程。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-99a的表達水平與TH17細胞轉錄因子RORγt的表達水平呈正相關，與Treg細胞轉錄因子FoxP3的表達水平亦呈正相關。故而認為miR-99a可能通過調(diào)節(jié)RORγt和FoxP3的表達水平，進而導致TH17/Treg細胞的不平衡。然而，該推論還需進一步的研究驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-99a可能通過調(diào)節(jié)RORγt和FoxP3的表達，影響RA患者TH17和Treg細胞的免疫調(diào)節(jié)機制，對于臨床診斷、篩選靶標分子具有指導意義。然而，本研究尚存在一些局限性。例如多項研究表明，RA患者外周血中miR-99a、miR-132、miR-146和miR-155的表達水平均高于健康人對照組[4-6]。但由于條件限制，本研究未能檢測其他miRNA在RA患者中的表達水平，其與TH17/Treg細胞比例或相關性關系尚有待進一步研究證實。其次，本研究納入的例數(shù)偏少，今后還需要在更大樣本量的基礎上分析miR-99a的功能作用并進一步驗證轉錄因子RORγt和FoxP3的調(diào)節(jié)機制。