張瑩，程曉東，胡玉皎，王昊，周鐵成，郝曉柯，劉家云(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710032)

目前研究證實，纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是內(nèi)皮細(xì)胞型纖溶酶原激活抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，其主要功能為滅活組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，調(diào)節(jié)機(jī)體纖溶系統(tǒng)活性。PAI-1含量或活性增加可降低纖溶活性，促進(jìn)血栓形成和復(fù)發(fā)[1]。PAI-1(4G/5G)基因啟動子區(qū)單核苷酸插入/缺失基因多態(tài)性與血漿PAI-1活性有關(guān)。對于PAI-1(4G/5G)基因，4G等位基因附近僅有轉(zhuǎn)錄激活物作用位點，而5G等位基因附近不僅有轉(zhuǎn)錄激活物作用位點, 還有轉(zhuǎn)錄抑制物作用位點，4G等位基因的活性要高于5G等位基因，并且4G等位基因和PAI-1基因的表達(dá)水平之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，4G基因攜帶者會增加血栓形成及復(fù)發(fā)的風(fēng)險。研究發(fā)現(xiàn)，由于PAI-1(4G/5G)基因是纖溶酶原激活物抑制劑的效應(yīng)分子，故而其突變與心腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)[2]，亦與深靜脈血栓的形成有關(guān)[3]。本研究使用數(shù)字熒光染色原位雜交技術(shù)檢測PAI-1(4G/5G)基因位點，為攜帶PAI-1(4G/5G)基因4G4G型的人群預(yù)防靜脈血栓、腦卒中等血液高凝狀態(tài)風(fēng)險的發(fā)生提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2017年2月至2019年12月在我院進(jìn)行PAI-1(4G/5G) 基因位點檢測的人群1 494例，男792例，女702例，年齡(41.1±15.0)歲。其中體檢健康者336例，男267例，女69例，年齡(50.8±8.6)歲，剖腹產(chǎn)患者401例，年齡(31.9±5.6)歲，燒傷手術(shù)患者603例，男424例，女179例，年齡(39.5±18.4)歲，心腦血管疾病手術(shù)患者154例，男101例，女53例，年齡(50.2±10.9)歲。

1.2試劑和儀器 TL998A熒光檢測儀(西安天隆科技公司)。10×NH4Cl預(yù)處理液、耀金保(核酸純化試劑)、耀金分(測序反應(yīng)通用試劑盒)、軟件設(shè)定液、陽性對照均購自北京華夏時代基因科技發(fā)展公司。

1.3樣本收集 采集各研究對象就診時(體檢健康者于體檢時采集)的靜脈血標(biāo)本2～3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存，保存時間不超過24 h。

1.4標(biāo)本前處理 在1.5 mL離心管中加入1.0 mL 1×NH4Cl預(yù)處理液，吸取200 μL混勻的全血標(biāo)本，室溫靜置5 min，待紅細(xì)胞完全破裂后，(1 000～1 200)×g離心5 min。將上層透明紅色液體吸棄，向管底富集的白細(xì)胞團(tuán)塊中加入30 μL耀金保使白細(xì)胞的胞膜破裂。充分混勻，室溫靜置30～60 min，用于后續(xù)實驗。

1.5方法

1.5.1樣本檢測 吸取1.5 μL處理后的白細(xì)胞樣本加入至含有PAI-1(4G/5G)試劑的子彈頭中，然后將子彈頭裝載到TL998A熒光檢測儀上運(yùn)行試驗，儀器運(yùn)行50個裂解循環(huán)后，根據(jù)達(dá)到設(shè)定的熒光信號閾值時的循環(huán)次數(shù)判讀結(jié)果。

1.5.2陽性對照檢測 吸取1.5 μL的陽性質(zhì)控品，加入至對應(yīng)的試劑中上機(jī)檢測，陽性對照用以監(jiān)測實驗?zāi)芊裾z出陽性標(biāo)本，檢出結(jié)果應(yīng)為陽性質(zhì)控品的基因型。

1.5.3陰性對照檢測 吸取1.5 μL耀金保保存液，加入至試劑中上機(jī)檢測，陰性對照用以監(jiān)測實驗室和前處理過程中是否存在污染，檢出結(jié)果應(yīng)為“重測”。

1.6血栓評估方法 追蹤200例病情相近的燒傷手術(shù)患者，術(shù)后2個月的治療期內(nèi)定期檢測深靜脈超聲的影像結(jié)果，通過管腔內(nèi)是否有異物或者血流是否正常充盈等指標(biāo)判斷患者從患病開始至患病后2個月內(nèi)深靜脈血栓事件的發(fā)生情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)值變量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，分類變量資料組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PAI-1(4G/5G)基因的分布情況PAI-1(4G/5G)基因多態(tài)性在體檢健康者、剖腹產(chǎn)患者、燒傷患者、心腦血管疾病患者中的分布情況見表1。

表1PAI-1(4G/5G)基因型在不同人群中的分布[n(%)]

2.2PAI-1(4G/5G)基因風(fēng)險比分布情況 對于PAI-1(4G/5G)基因，4G4G和4G5G基因型患者與5G5G基因型患者相比，發(fā)生靜脈血栓的風(fēng)險比OR(95%CI)分別為6.35(2.5～16.1)和4.85(2.0～12.1)。

此外，與體檢健康者(攜帶4G基因率為76.79%)相比，剖腹產(chǎn)患者(85.04%)，燒傷患者(83.42%)，心腦血管疾病患者(86.36%)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為8.180、6.175、6.009，P<0.05)。

2.3手術(shù)后燒傷患者深靜脈血栓事件率 追蹤200例燒傷手術(shù)患者術(shù)后2個月內(nèi)深靜脈血栓事件發(fā)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中139例患者在患病后2個月內(nèi)發(fā)生了深靜脈血栓事件。PAI-1(4G/5G) 4G4G基因型患者74例，發(fā)生深靜脈血栓64例(86.49%)，PAI-1(4G/5G) 4G5G基因型患者80例，發(fā)生深靜脈血栓52例(65.00%)，PAI-1(4G/5G) 5G5G基因型患者46例，發(fā)生深靜脈血栓23例(50.00%)，不同基因型患者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.651，P<0.01)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)PAI-1(4G/5G)基因4G型攜帶者在體檢健康者和手術(shù)患者間的分布頻率存在差異。體檢健康者攜帶4G基因率為76.79%，剖腹產(chǎn)患者攜帶4G基因率為85.04%，燒傷患者攜帶4G基因率為83.42%，心腦血管疾病患者攜帶4G基因率為86.36%。有文獻(xiàn)報道，PAI-1(4G/5G)基因4G/4G 基因型在病例組中的分布頻率為60.0%，在正常對照組中為50.0%；4G等位基因在病例組中的分布頻率為70.9%，在正常對照組中為60.8%[4]。亦有文獻(xiàn)表明，PAI-1(4G/5G)基因4G/4G型、4G/5G型、5G/5G型在靜脈血栓栓塞癥(VTE)組的分布頻率分別為42.50%、35.00%、22.50%,在對照組分布頻率分別為17.50%、43.12%、39.38%[5]。本研究數(shù)據(jù)和上述文獻(xiàn)報道的結(jié)果基本一致，PAI-14G基因型在疾病組較健康人群明顯升高,證實4G基因型與靜脈血栓栓塞發(fā)病具有一定的相關(guān)性,可作為獨(dú)立的危險因素[5]。手術(shù)患者本身因手術(shù)而可能發(fā)生血栓，且各疾病組患者攜帶4G基因型的比率又明顯高于體檢健康組，故而進(jìn)一步增加了手術(shù)患者術(shù)后發(fā)生深靜脈血栓風(fēng)險。

本研究追蹤了200例燒傷手術(shù)患者，在患者術(shù)后2個月內(nèi)定期通過髂總靜脈或下腔靜脈行深靜脈超聲評估，通過探頭加壓管腔是否有明顯變化或者不能完全閉合消失評估深靜脈血栓事件是否發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)200例患者中有139例患者在患病后2個月內(nèi)發(fā)生了深靜脈血栓事件。4G4G基因型發(fā)生血栓事件比例為86.49%，4G5G基因型發(fā)生血栓事件比例為65.00%，5G5G基因型發(fā)生血栓事件比例為50.00%，不同基因型患者間深靜脈血栓發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對于同樣接受手術(shù)治療的患者來說，純合突變型(4G4G)發(fā)生深靜脈血栓事件的風(fēng)險是最高的，其次是雜合突變型(4G5G)。然而，本研究對于手術(shù)患者術(shù)后情況跟蹤的病例數(shù)偏少，僅限于燒傷科且能行深靜脈超聲的術(shù)后患者，后期我們將逐步追蹤并分析不同基因型各種手術(shù)患者術(shù)后深靜脈血栓事件的發(fā)生風(fēng)險。

對于攜帶PAI-1(4G/5G)4G基因型的健康人群來說，需關(guān)注如下肢發(fā)生疼痛，上臂、胸壁皮下靜脈擴(kuò)張，非凹陷性水腫等；定期檢測凝血指標(biāo)等如D-二聚體狀態(tài)，靜脈造影，下肢血管多普勒超聲等；給予低脂、高蛋白、高維生素、易消化的飲食，有心力衰竭者應(yīng)給予低鹽飲食；調(diào)整生活狀態(tài)，戒煙限酒等降低風(fēng)險。對于攜帶4G基因型的患者來說，發(fā)生靜脈血栓可采用藥物預(yù)防如肝素、低分子肝素，Ⅹa因子抑制劑如利伐沙班、阿替沙班、磺達(dá)肝素鈉，維生素K拮抗劑如華法林；應(yīng)防止深度靜脈血栓及肺栓塞發(fā)生。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)通過篩查PAI-1(4G/5G)基因可以為攜帶PAI-1(4G/5G)4G基因型的手術(shù)患者在預(yù)防靜脈血栓、腦卒中等血液高凝狀態(tài)風(fēng)險的發(fā)生提供精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)支持。