張瀟元 潘 悅 朱鴻維 王中江 江連洲 謝鳳英 趙玉瑩 張曉南，2*

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030 2 黑龍江省學(xué)勤科技有限公司 哈爾濱150030）

目前， 納米技術(shù)被廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與藥物運(yùn)送，具有智能化、靶向性的納米級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)送系統(tǒng)， 使芯材的生物利用率得到極大地提高。ABBAS 等[1]和YUAN 等[2]分別通過(guò)超聲及高壓均質(zhì)法制備得到穩(wěn)定性較好的納米乳液， 盡管該納米乳液在生物利用率和穩(wěn)定性等方面與普通乳液相比具有極為顯著的優(yōu)勢(shì)，然而，由大豆分離蛋白（SPI）等天然表面活性劑制備的納米乳液在長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存后其有關(guān)物質(zhì)含量偏離納米乳液的合格標(biāo)準(zhǔn)。 隨著人們生活節(jié)奏的加快及對(duì)健康營(yíng)養(yǎng)飲食的追求，在最大化載量、強(qiáng)穩(wěn)定性基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)方便及易儲(chǔ)藏的納米乳液成為研究熱點(diǎn)。 將納米乳液做成凍干固體制劑是一種可行的選擇， 在提高其穩(wěn)定性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期保存。

凍干納米乳液的制作采用新型的納米級(jí)真空冷凍干燥技術(shù)。 該技術(shù)將冷凍技術(shù)同真空技術(shù)有機(jī)的聯(lián)系起來(lái)，是一種新型干燥技術(shù)[3]。 與其它干燥工藝相比， 真空冷凍干燥技術(shù)能夠最好地留存食品原有的色澤、香味以及營(yíng)養(yǎng)成分，并可最佳地保持食品原有形態(tài)， 兼具優(yōu)異的速溶性和水復(fù)溶性，進(jìn)而提高某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的穩(wěn)定性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍[4]。

本試驗(yàn)中， 聯(lián)合真空冷凍干燥技術(shù)與高壓均質(zhì)技術(shù)制備一種水包油型（O/W）維生素E 納米乳液粉末復(fù)原乳液， 為提高維生素E 的穩(wěn)定性和生物利用率提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 原料與主要試劑 大豆分離蛋白（蛋白含量89.21%），山東高唐藍(lán)山集團(tuán)；葵花籽油，中糧集團(tuán)福臨門；無(wú)水乙醇、乙醚、氫氧化鈉、維生素E、磷酸二氫鈉（以上試劑全部為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 主要設(shè)備、儀器 高壓均質(zhì)機(jī)，英國(guó)安盛聯(lián)合科技有限公司；ALPHA 1-4 LSC 型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM 公司；Gemini HR Nano 流變儀，英國(guó)Malvern 儀器有限公司； Zetasizer Nano-ZS90 粒度分析儀，德國(guó)Christ 公司； Hitachi S-3400 掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司英國(guó)馬爾文公司；MAGNA-IR560 傅里葉紅外光譜儀， 美國(guó)尼高麗公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 納米乳液粉末的制備 將參考Sungje 等[5]的方法得到的維生素E 納米乳液， 真空冷凍干燥得維生素E 納米粉末。 冷凍條件：-50 ℃， 凍干12 h。

將真空冷凍干燥維生素E 納米粉末按照原始乳液的配方， 加入pH 7.0 的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液復(fù)溶。

1.2.2 維生素E 復(fù)原納米乳液?jiǎn)我蛩卦囼?yàn) 以大豆分離蛋白（SPI）質(zhì)量濃度、葵花籽油質(zhì)量濃度、高壓均質(zhì)壓力、 高壓均質(zhì)次數(shù)為觀測(cè)因子做單因素試驗(yàn)。 分別測(cè)定不同條件下制備的維生素E 復(fù)原納米乳液樣品的平均粒徑、 多分散性指數(shù)、ζ 電位、包埋率。

1）大豆分離蛋白質(zhì)量濃度的選擇 分別配制質(zhì)量濃度為5，10，15，20，25 mg/mL 的SPI 溶液，室溫持續(xù)攪拌120 min，逐漸添加質(zhì)量濃度45 mg/mL 的葵花籽油，均質(zhì)后完成粗乳液制備。設(shè)置均質(zhì)參數(shù)：100 MPa，4 次。

2）葵花籽油質(zhì)量濃度的選擇 配制15 mg/mL （質(zhì)量濃度）的SPI 溶液， 室溫連續(xù)攪拌120 min， 分別添加質(zhì)量濃度35，40，45，50，55 mg/mL的葵花籽油，均質(zhì)后完成粗乳液制備。設(shè)置均質(zhì)參數(shù)：100 MPa，4 次。

3）均質(zhì)壓力 配制質(zhì)量濃度15 mg/mL 的SPI 溶液，逐漸添加45 mg/mL 的葵花籽油，制備粗乳液。 設(shè)置均質(zhì)壓力分別為60，80，100，120，140 MPa，次數(shù)4 次。

4）均質(zhì)次數(shù) 配制15 mg/mL 的SPI 溶液，逐漸添加45 mg/mL 的葵花籽油，制備粗乳液。 設(shè)置均質(zhì)參數(shù)：壓力100 MPa，2，3，4，5，6 次。

5）復(fù)原納米乳液響應(yīng)面優(yōu)化 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。 選取大豆分離蛋白質(zhì)量濃度A（mg/mL）、葵花籽油質(zhì)量濃度B（mg/mL）、高壓均質(zhì)壓力C（MPa）及高壓均質(zhì)次數(shù)D（次）作為自變量，將復(fù)原納米乳液的平均粒徑Y(jié)1（nm）和包埋率Y2（%）作為響應(yīng)值，做四因素三水平試驗(yàn)。

1.2.3 復(fù)原納米乳液的平均粒徑、ζ 電位測(cè)定 采用粒度分析儀對(duì)上述復(fù)原維生素E 納米乳液樣品的油滴平均粒徑及ζ 電位進(jìn)行檢測(cè)。 設(shè)置粒度分析儀折射率參數(shù)：水相為1.33，葵花籽油油滴為1.45。 在測(cè)定平均粒徑及ζ 電位前，先將納米乳液樣品用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）稀釋，稀釋梯度分別為1 000 倍和50 倍。

一天，佛陀問(wèn)他的弟子：未受過(guò)佛法教化的人，每天吃飯、勞作、睡覺(jué)，經(jīng)歷生老病死以及種種煩惱；受過(guò)佛法教化的人，一樣每天吃飯、勞作、睡覺(jué)，一樣經(jīng)歷生老病死和種種煩惱。那么，受過(guò)佛法教化的人和未受過(guò)佛法教化的人，又有什么區(qū)別呢？他的弟子一時(shí)不知如何回答。

1.2.4 復(fù)原納米乳液包埋率的測(cè)定 采用紫外分光光度法測(cè)定復(fù)原乳液包埋效果，1.0 g 產(chǎn)品中加入20 mL 乙醚，在25 ℃條件下劇烈振搖1 min，將溶劑過(guò)濾到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)， 以提取出未被包埋的VE，即表面VE。 在1.0 g 復(fù)原乳液中加入20 mL 無(wú)水乙醇，25 ℃條件下劇烈振搖10 min，將溶劑過(guò)濾到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以提取出復(fù)原納米乳液中的VE，即總VE。以無(wú)水乙醇為溶劑，將前兩者分別稀釋至合適濃度，置紫外分光光度計(jì)中，測(cè)定波長(zhǎng)285 nm 處吸光值，得表面VE 含量和總VE 含量。 包埋率計(jì)算公式：

1.2.5 真空冷凍干燥納米乳液粉末的微觀形態(tài)觀察 將獲得的真空冷凍干燥粉末進(jìn)行氮?dú)馓畛洳⒚芊?，置遮光處存?chǔ)。在微觀形態(tài)觀察前先用導(dǎo)電雙面膠把粉末樣品固定于金屬臺(tái)上， 緩緩吹除多余粉末，于真空條件下鍍金，最后把樣品粉末放在掃描電子顯微鏡（15 kV）下觀察其微觀形態(tài)。

1.2.6 維生素E 原始乳液及復(fù)原納米乳液的流變學(xué)特性測(cè)定 用流變儀分析維生素E 溶液的流變學(xué)性質(zhì)，用直徑60 mm 的錐形板，設(shè)置板間距50 μm。取1 mL 原始維生素E 乳液、復(fù)原納米乳液和大豆蛋白溶液置于平板上， 在溫度25 ℃條件下剪切，流變儀剪切速率為0.01～1 000 s-1。

1.2.7 真空冷凍干燥納米乳液粉末的紅外光譜測(cè)定 參考QIN 等[6]的方法。 稱取1 mg 凍干干燥的維生素E 納米乳液粉末，向其中加入100 mg 溴化鉀與之充分混合， 再將上述混合物進(jìn)行壓片便可接受FT-IR 檢測(cè)。為保證有效降低由水蒸汽IR 吸收給測(cè)量帶來(lái)的干擾， 向測(cè)量室內(nèi)通入干燥的N2持續(xù)淋洗。 設(shè)置FT-IR 測(cè)定參數(shù)： 波數(shù)精度0.01 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描64 次，波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。 使用Peakfit Version 4.12 擬合FT-IR 檢測(cè)所得波譜圖， 按照所得積分面積分析各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 以上所有試驗(yàn)至少重復(fù)3 次， 數(shù)據(jù)ANOVA 差異顯著性分析采用軟件SPSS Statistics 22，其中P＜0.05 為顯著性差異。 數(shù)據(jù)的分析， 圖表結(jié)果處理及檢測(cè)圖譜分析處理采用Origin9.1 軟件及PeakFit 4.12 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 壁材濃度對(duì)復(fù)原納米乳液粒徑、電位的影響

由圖1 可知， 復(fù)原納米乳液的粒徑和PDI 呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)， 均隨壁材濃度的增加先減小后增加。 壁材質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)，其結(jié)構(gòu)松散，乳化能力低[7]，復(fù)原后液滴易聚結(jié)，體系粒徑較大而不穩(wěn)定。 當(dāng)壁材質(zhì)量濃度15 mg/mL 時(shí)，壁材中高分子空間結(jié)構(gòu)最緊密，能夠大量滯納芯材[8]，凍干后粉末包埋率增加，復(fù)原納米乳液平均粒徑最小，體系最穩(wěn)定。壁材的濃度過(guò)大時(shí)，極大地阻礙芯材的擴(kuò)散和運(yùn)動(dòng)， 并嚴(yán)重阻礙壁材網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成[9]，其包封率出現(xiàn)降低趨勢(shì)。根據(jù)陳巖等[10]的研究，SPI具有一定的黏性，使粉末間發(fā)生粘連，因而降低了復(fù)原納米乳液的包埋率，增大了乳液粒徑，導(dǎo)致體系不穩(wěn)定。 這與BURGESS 等[11]的研究結(jié)果一致。大豆分離蛋白在體系pH7.0 時(shí)帶負(fù)電， 由圖1 可知，當(dāng)SPI 質(zhì)量濃度為15 mg/mL 時(shí)，電位達(dá)到最大值。這是由于隨著壁材濃度的增加，納米乳液液滴表面的蛋白吸附逐漸飽和， 體系電位達(dá)到最大值，凍干粉末顆粒間的排斥力達(dá)到最大[12]，復(fù)原后液滴不易聚集，體系穩(wěn)定。 若ζ 電位低，則納米凍干粉末之間吸引力超過(guò)排斥力[13]，復(fù)原后液滴更易于聚集，體系不穩(wěn)定。

圖1 SPI 質(zhì)量濃度對(duì)維生素E 復(fù)原納米乳液理化穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of SPI concentration on the physicochemical stability of vitamin E reconstituted nanoemulsion

2.2 芯材濃度對(duì)復(fù)原納米乳液粒徑、電位影響

由圖2 可知，復(fù)原納米乳液的粒徑、PDI 隨芯材濃度的增加先減小后增加。 原因可能是芯材的載入降低原有壁材的流動(dòng)性[7]，凍干粉末包埋率增加，復(fù)原后液滴平均粒徑降低；隨著芯材含量的增加，達(dá)45 mg/mL 時(shí)，芯材與壁材間的一些次級(jí)相互作用使壁材具有相對(duì)剛性的結(jié)構(gòu)， 包埋率達(dá)到最大， 此時(shí)復(fù)原納米乳液體系平均粒徑、PDI 最小，體系最穩(wěn)定；然而芯材添加量過(guò)多，降低了壁材比重，芯材不能被全部乳化包埋，包埋率降低，使乳液體系不穩(wěn)定。 根據(jù)路HINRICHS 等[14]的研究，當(dāng)芯材用量增加時(shí)，乳狀液滴的密度增加，彼此之間更傾向于互相碰撞以及聚積成不規(guī)則狀態(tài)。以上因素均導(dǎo)致復(fù)原納米乳液粒徑增大，液滴分布不均勻，體系不穩(wěn)定。 由圖2 可知，芯材質(zhì)量濃度為45 mg/mL 時(shí)，電位達(dá)到最大值，這是因?yàn)楸诓臐舛壬撸?復(fù)原納米乳液液滴周圍吸附更多的負(fù)離子，包埋率達(dá)到最大值，乳液體系穩(wěn)定。

2.3 均質(zhì)壓力對(duì)粒徑、電位的影響

圖2 葵花籽油濃度對(duì)維生素E 復(fù)原納米乳液理化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of sunflower oil concentration on the physicochemical stability of vitamin E reconstituted nanoemulsion

由圖3 可知，當(dāng)均質(zhì)壓力增加時(shí)，復(fù)原納米乳液的粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)， 當(dāng)壓力增到100 MPa時(shí)，粒徑最小，此時(shí)復(fù)原乳液穩(wěn)定性最高。 當(dāng)均質(zhì)壓力繼續(xù)增加時(shí)，粒徑逐漸增大。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能在于壓力逐漸增加， 有利于芯材均勻分散于壁材體系中[15]，凍干后粉末的包埋率提高，復(fù)原乳液滴平均粒徑減小。 施加過(guò)高的均質(zhì)壓力會(huì)形成較小粒徑的液滴， 此時(shí)具有較大的表面積及較高的表面能[16]，使得液滴間出現(xiàn)聚結(jié)現(xiàn)象，導(dǎo)致凍干后粉末的包埋率降低，平均粒徑增加，復(fù)原乳穩(wěn)定性降低。由圖3 可知，均質(zhì)壓力對(duì)復(fù)原乳液的ζ 電位影響顯著， 隨著均質(zhì)壓力的增大，ζ 電位先增加后下降， 當(dāng)均質(zhì)壓力為100 MPa 下時(shí)ζ 電位絕對(duì)值最高?？赡苁怯捎陔S著均質(zhì)壓力的增加，維生素E 納米乳液凍干粉末體積變小，大小更均勻，形成復(fù)原乳后液滴之間的靜電排斥力增大， 乳化體系的穩(wěn)定性提高。 然而，均質(zhì)壓力過(guò)高，形成的凍干粉末粒徑過(guò)小，表面能過(guò)高，且ζ 電位的絕對(duì)值在復(fù)原后減小，穩(wěn)定性降低[17]。

圖3 均質(zhì)壓力對(duì)維生素E 復(fù)原納米乳液理化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of homogeneous pressure on the physicochemical stability of vitamin E reconstituted nanoemulsion

2.4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑、電位的影響

由圖4 可知，隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，復(fù)原乳液粒徑減小，當(dāng)均質(zhì)循環(huán)次數(shù)超過(guò)4 次時(shí)，復(fù)原乳平均粒徑開(kāi)始增加，包埋率增大。其原因可能是均質(zhì)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)剪切、撞擊和空穴效應(yīng)等作用，均質(zhì)次數(shù)越多該作用越強(qiáng)，制得的顆粒粒徑便越小[18]。 隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，凍干粉末的粒徑?jīng)]有持續(xù)減小。均質(zhì)次數(shù)過(guò)多，破壞壁材體系的包埋，復(fù)原后液滴易聚合，使粒徑增加。 由圖4 還可知，復(fù)原乳的ζ電位隨均質(zhì)次數(shù)的增加先增加后減小， 均質(zhì)4 次時(shí)ζ 電位最高； 均質(zhì)次數(shù)的增加使SPI 的分散性最高，更好地吸附在油水界面[19]，增加油相的包埋效果，此時(shí)乳液體系最穩(wěn)定。當(dāng)高壓均質(zhì)次數(shù)過(guò)多時(shí)，過(guò)處理效應(yīng)促使乳液液滴聚合，導(dǎo)致納米乳液的ζ 電位和乳化產(chǎn)率下降[20]。

圖4 均質(zhì)次數(shù)對(duì)維生素E 復(fù)原納米乳液理化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of homogenization times on the physicochemical stability of vitamin E reconstituted nanoemulsion

2.5 葵花籽油復(fù)原納米乳液響應(yīng)面試驗(yàn)

借助Design-Expert 對(duì)上述試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)曲面法過(guò)程優(yōu)化。 遵循中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。分別選取大豆分離蛋白質(zhì)量濃度A（mg/mL）、葵花籽油質(zhì)量濃度B（mg/mL）、均質(zhì)壓力C（MPa）、均質(zhì)數(shù)量D（次）為自變量，響應(yīng)值的設(shè)置分別為平均粒徑（R1）和包埋率（R2），具體試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2 所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

表2 試驗(yàn)安排及結(jié)果Table 2 Experiment scheme and results

（續(xù)表2）

利用Design-Expert 對(duì)平均粒徑R1進(jìn)行數(shù)采集和分析，構(gòu)建二次響應(yīng)面回歸模型：

R1= 232.66 - 3.69A - 2.58B - 8.05C - 9.01D+10.27AB+2.45AC+5.70AD+3.67BC+2.60BD+2.87CD+8.28A2+5.97B2+19.97C2+14.28D2

由表3 可知，此模型能有效模擬試驗(yàn)數(shù)據(jù)，擬合方程中因變量和各自變量表現(xiàn)顯著的線性相關(guān)性，且回歸項(xiàng)極顯著（P＜0.0001），而模型擬合方程失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），響應(yīng)面回歸模型擬合度R2=95.58%，R2Adj=91.17%，響應(yīng)值最優(yōu)值可通過(guò)此模型來(lái)推測(cè)。 采用F 檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析得到各變量的貢獻(xiàn)率排序?yàn)镈＞C＞A＞B， 即均質(zhì)次數(shù)＞均質(zhì)壓力＞大豆分離蛋白質(zhì)量濃度＞葵花籽質(zhì)量濃度。通過(guò)響應(yīng)面尋優(yōu)分析獲得最佳工藝參數(shù)為：大豆分離蛋白質(zhì)量濃度15.40 mg/mL，葵花籽油質(zhì)量濃度45.16 mg/mL，均質(zhì)壓力103.47 MPa，均質(zhì)數(shù)量4 次，響應(yīng)值平均粒徑有最優(yōu)值為230.51 nm。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis

利用Design-Expert 對(duì)包埋率R2進(jìn)行數(shù)采集和分析，構(gòu)建二次響應(yīng)面回歸模型，如下所示：

R2=90.82-0.038A+0.24B+0.60C+0.47D -0.085AB - 1.92AC - 1.02AD - 1.24BC - 0.84BD -2.07CD-0.88A2-1.09B2-1.40C2-1.28D

表4 回歸與方差分析結(jié)果Table 4 Results of regression and variance analysis

由表4 可知，此模型能夠模擬試驗(yàn)數(shù)據(jù)，此擬合方程中因變量和各自變量表現(xiàn)出顯著的線性相關(guān)性，且回歸項(xiàng)極顯著（P＜0.0001），而模型擬合方程的失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），響應(yīng)面回歸模型擬合度R2=95.10%，R2Adj=90.20%，響應(yīng)值最優(yōu)值可通過(guò)此模型來(lái)推測(cè)。 采用F 檢驗(yàn)比較得到各變量的貢獻(xiàn)率排序?yàn)镃＞D＞B＞A（均質(zhì)壓力＞均質(zhì)數(shù)量＞葵花籽油質(zhì)量濃度＞大豆分離蛋白質(zhì)量濃度）。 通過(guò)響應(yīng)面尋優(yōu)分析獲得最佳工藝參數(shù)為： 大豆分離蛋白質(zhì)量濃度10 mg/mL， 葵花籽油質(zhì)量濃度43.07 mg/mL，均質(zhì)壓力120 MPa，均質(zhì)4 次，響應(yīng)值乳化產(chǎn)率有最優(yōu)值為91.30%。

采用聯(lián)合求解法確定平均粒徑、 包埋率均優(yōu)的條件為： 大豆分離蛋白質(zhì)量濃度14.52 mg/mL，葵花籽油質(zhì)量濃度45.24 mg/mL，均質(zhì)壓力103.11 MPa，均質(zhì)4 次，此條件下平均粒徑230.88 nm，包埋率為90.89%。 為適應(yīng)生產(chǎn)，將制備條件優(yōu)化為大豆分離蛋白質(zhì)量濃度15 mg/mL，葵花籽油質(zhì)量濃度45 mg/mL，均質(zhì)壓力100 MPa，均質(zhì)4 次，此條件下平均粒徑232.66 nm，包埋率為90.82%。 此結(jié)果表明響應(yīng)值的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測(cè)值之間具有較高的吻合度。

圖5 交互作用對(duì)復(fù)原納米乳液平均粒徑的影響Fig.5 Effect of interaction on the average particle size of reconstituted nanoemulsion

圖6 交互作用對(duì)復(fù)原納米乳液乳化產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of interaction on emulsification yield of reconstituted nanoemulsionQ

2.6 掃描電鏡觀察

圖7a 為大豆分離蛋白粉末的掃描電鏡圖片，圖7b 為純的維生素E 粉， 兩種物質(zhì)形態(tài)不規(guī)則，表面粗糙，且顆粒直徑較大[21]。 圖7c 為維生素E納米乳液凍干粉末，其表面完整光滑，結(jié)構(gòu)致密，平均粒徑變小， 說(shuō)明高壓均質(zhì)可以提高壁材的乳化作用，使其包埋率增加。 該結(jié)果支持了江連洲等[22]的研究結(jié)果。 冷凍干燥粉末表面有凹陷、無(wú)收縮， 粉末表面的孔洞是小冰晶由固態(tài)到氣態(tài)升華所致， 該結(jié)構(gòu)對(duì)被包封的物質(zhì)具有一定保護(hù)作用[23]。 通過(guò)比較3 個(gè)圖的粒徑，發(fā)現(xiàn)圖7c 粒徑最小，說(shuō)明此時(shí)維生素E 納米乳液已形成，體系最穩(wěn)定。

圖7 掃描電鏡圖像Fig.7 Microscope images by scanning electron microscopy

2.7 納米乳液及凍干粉末復(fù)原流變學(xué)特性

由圖8 可知， 制備的納米乳液為牛頓型納米流體，在0.1～400 s-1范圍內(nèi)表觀黏度降低，呈現(xiàn)剪切稀化特征，這是因?yàn)殡S著剪切速率的増大，最初雜亂排布的納米粒子沿流線方向呈有序排列，納米粒子間的摩擦逐漸減小，流動(dòng)阻力隨之減小，其黏度呈逐漸下降的趨勢(shì)，最終達(dá)到穩(wěn)定[24-26]。 而在大于400 s-1范圍，黏度基本保持不變，由于高壓均質(zhì)的剪切稀化作用降低了乳液的黏度， 不易被測(cè)出。 這時(shí)高壓均質(zhì)乳液和復(fù)原乳液均表現(xiàn)出牛頓流體特性，說(shuō)明納米復(fù)原乳液特性沒(méi)有改變。

2.8 納米乳液及冷凍干燥粉末復(fù)原乳液的紅外光譜

紅外光譜是依據(jù)分子在不同波長(zhǎng)下的振動(dòng)，而吸收相應(yīng)紅外輻射所形成的吸收譜圖， 可以檢測(cè)分子中含有的化學(xué)基團(tuán)及化學(xué)鍵[27]。 圖9 為大豆分離蛋白粉末和真空冷凍干燥維生素E 納米乳液粉末的紅外光譜圖， 其顯示大豆分離蛋白分子中的氨基基團(tuán)，包括蛋白質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)中的C-C 振動(dòng)，C-O-O 糖苷鍵振動(dòng)波段信息，酰胺I 帶（由HO-H 彎曲振動(dòng)和C=O 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生）、 酰胺Ⅱ帶（由N-H 彎曲產(chǎn)生）及酰胺Ⅲ帶（由C-O 和C-OC 振動(dòng)產(chǎn)生）[28]。 由圖9 可知，在3 270 cm-1處真空冷凍干燥維生素E 納米粉末的-OH 伸縮振動(dòng)峰峰形較窄且強(qiáng)度變強(qiáng)。 真空冷凍干燥維生素E 納米粉末在1 744 cm-1處的C=O 振動(dòng)吸收峰強(qiáng)度減弱甚至消失，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶從1 631.4 cm-1移動(dòng)到1 637 cm-1， 酰胺Ⅱ帶從1 535.1 cm-1移動(dòng)到1 515 cm-1，以上變化說(shuō)明維生素E 的載入對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響， 蛋白質(zhì)與維生素E 之間存在氫鍵作用。 在1 077 cm-1處是-NH 的伸縮振動(dòng)，由1 097 cm-1移動(dòng)到1 077 cm-1，且吸收峰強(qiáng)度減弱， 說(shuō)明由于維生素E 的載入使大豆分離蛋白的氫鍵發(fā)生變化。

圖8 維生素E 納米乳液、真空冷凍干燥維生素E粉末復(fù)原納米乳液、大豆分離蛋白乳液的流變性Fig.8 Rheological property of Vitamin E nanoemulsion，vacuum freeze drying vitamin E powder reconstituted nanoemulsion， soy protein isolate emulsion

采用FT-IR 法分析大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，F(xiàn)T-IR 酰胺Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）反映維生素E 納米乳液粉末中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 通過(guò)Omnic 9.1 軟件選取特定波段（1 600～1 700 cm-1），利用分析軟件PeakFit 4.12 對(duì)以上述波段進(jìn)一步處理， 包括二階導(dǎo)數(shù)擬合、 基線校正及高斯去卷積。 參考Meng 等[29]研究，可得到每個(gè)子峰波段和凍干粉末， 以及蛋白粉末中大豆分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系， 分別表示為： β-折疊結(jié)構(gòu)1 615～1 637 cm-1和1 682～1 700 cm-1；α-螺旋結(jié)構(gòu)1 646～1 664 cm-1[30]；無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)1 637～1 645 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)1 664～1 681 cm-1[31]。 根據(jù)譜帶指認(rèn)，將擬合的各子峰的峰面積百分含量進(jìn)行加和，得出蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的百分比。 各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類及含量計(jì)算結(jié)果如表5 所示。

由圖10 可知，在維生素E 納米乳液及真空冷凍干燥維生素E 納米粉末酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜中均有8 個(gè)峰。 表5 列出大豆分離蛋白各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，真空冷凍干燥后大豆分離蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角均增加，而β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量減少。 α-螺旋含量增加，β-折疊含量降低，說(shuō)明壓力對(duì)大豆分離蛋白分子間氫鍵影響較大， 此時(shí)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 由初始的緊湊狀態(tài)變?yōu)樗缮?，空間位阻效應(yīng)降低，更容易遷移并吸附到油水界面[32]，形成更厚的界面膜，能有效防止液滴碰撞聚合，使體系更加穩(wěn)定。

圖9 真空冷凍干燥維生素E 納米乳液粉末、大豆分離蛋白粉末的FTIR 光譜圖Fig.9 IR spectrogram of vacuum freeze drying vitamin E nanoemulsion powder，soy protein isolate powder

表5 維生素E 納米乳液、真空冷凍干燥維生素E納米乳液粉末中大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征Table 5 Percentages of protein secondary structure of vitamin E nanoemulsion， vacuum freeze drying vitamin E powder reconstituted nanoemulsion

3 結(jié)論

圖10 維生素E 納米乳液、真空冷凍干燥維生素E 納米乳液粉末去卷積酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜Fig.10 Second-derivative FTIR spectra in the amide I region and Gaussian curve fitting for Vitamin E nanoemulsion，vacuum freeze drying vitamin E powder reconstituted nanoemulsion

聯(lián)合真空冷凍干燥技術(shù)與高壓均質(zhì)技術(shù)制備了一種水包油型（O/W）真空冷凍干燥維生素E 納米粉末復(fù)原乳液， 通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法優(yōu)化，其最佳工藝條件為：大豆分離蛋白質(zhì)量濃度15 mg/mL，葵花籽油質(zhì)量濃度45 mg/mL，均質(zhì)壓力100 MPa， 均質(zhì)4 次。 所得平均粒徑232.66 nm，包埋率為90.82%。 通過(guò)掃描電子鏡、流變儀、紅外光譜等手段對(duì)維生素E 納米乳液、 冷凍干燥粉末以及復(fù)原乳液的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。 掃描電鏡結(jié)果表明， 維生素E 納米乳液凍干粉末具有致密、均勻的結(jié)構(gòu)和光滑平整的表面。流變儀掃描結(jié)果表明， 凍干粉末復(fù)原乳液具有剪切稀釋流變現(xiàn)象，呈現(xiàn)牛頓流體的典型特征。紅外光譜試驗(yàn)結(jié)果表明凍干粉末的蛋白α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)降低。 綜上所述，本研究不僅提高了維生素E 吸收利用率和生物利用率，增加了其穩(wěn)定性，而且拓展了其運(yùn)用范圍，為其在食品工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。