安宇，王穎，2，易華西，張東杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶163319；2.國家雜糧工程技術研究中心；3.中國海洋大學食品科學與工程學院）

乳酸鏈球菌素（Nisin）作為乳酸鏈球菌素時經(jīng)核糖體合成機制產(chǎn)生的多肽或前體多肽[1]，憑借其突出的抑菌活性以及易消化降解[2]，使用無蓄積性毒害作用、遺傳穩(wěn)定性良好等[3-5]特點，逐步成為研究者和消費者的關注熱點。近年來，學者對于乳酸菌細菌素的理化性質(zhì)與代謝功能在現(xiàn)階段的研究相對透徹，但由于乳酸菌發(fā)酵液中分離純化細菌素難度較大，效果不理想，使得其因成本昂貴，操作煩瑣等因素在工業(yè)化分離生產(chǎn)中備受限制[6]。

鑒于乳酸菌細菌素的分離純化主要根據(jù)其自身性質(zhì)和實驗條件選擇分離純化方法。而課題組前期從傳統(tǒng)肉腸制品中分離到三株可降解膽固醇的乳酸菌為植物乳桿菌。目前，關于植物乳桿菌素分離純化的研究多選擇離子交換色譜[7]、疏水層析[8-9]、凝膠過濾層析[10]等色譜柱分離方式。Song 等[11]依據(jù)不同種類蛋白質(zhì)疏水性強弱不同的特性選用疏水柱層析分離純化PlantaricinZJ5；Gong 等[12]則根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小差異選擇凝膠過濾層析法分離純化plantaricin MG 植物乳桿菌素。鑒于植物乳桿菌素為帶電荷的小分子肽，因此，實驗選擇陽離子交換層析柱純化植物乳桿菌素M1-UVS300，經(jīng)離子交換層析柱和小肽柱兩步純化，探究其精確分子量和純度，并對樣品氨基酸成分及含量進行，為植物乳桿菌素M1-UVs301 的結構及功能特性研究提供數(shù)據(jù)支持及理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株

植物乳桿菌M1-UVs300，為實驗室前期誘導分離保藏菌種；指示菌：金黃色葡萄球菌、熒光假單胞桿菌，由黑龍江八一農(nóng)墾大學食品微生物實驗室提供。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：MRS 培養(yǎng)基，杭州百思生物技術有限公司；丙烯酰胺、Tris、冰乙酸、無水乙醇、乙腈、甲酸、丙酮（色譜純），天津市大茂化學試劑廠；預染蛋白Marker，Thermo 公司。

主要儀器：DRP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；顯微鏡，上海精密儀器有限公司；BCN-1360 超凈工作臺，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TD5A 臺式多管架離心機，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；氨基酸分析儀，德國Sykam 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵液的制備

將貯藏于實驗室的植物乳桿菌菌株活化后，接種到MRS 培養(yǎng)基中，菌種接種的量為2%。于37 ℃的條件下中培養(yǎng)發(fā)酵16 h 后取出，以8 000 r·min-1的轉速進行離心，離心5 min 以除去菌體。以NaOH（濃度為5 mol·L-1）調(diào)節(jié)上清液的pH 至6.0（去除培養(yǎng)過程中中酸性物質(zhì)對體系的影響），過微孔濾膜濾（0.22 μm）后于冷藏保存（4 ℃）。

1.3.2 陽離子交換層析純化

離子交換層析即根據(jù)不同蛋白質(zhì)帶有的電荷與離子柱之間結合程度不同以達到分離純化的目的。通過抑菌試驗結果可知，熒光假單胞菌處理后的無細胞發(fā)酵液具備一定的抑菌能力。對其進行純化[13]，實驗選用SP sepHarose Fast Flow 陽離子交換層析柱。

1.3.3 收集液濃縮

將收集液裝至1 kDa 的透析袋中，加入透析液（5 mmol·L-1PBS）透析24 h 后取出，采用冷凍干燥方式將其濃縮后，通過雙層牛津杯檢驗法，探究收集液濃縮后的抑菌活性。

表1 陽離子交換層析條件Table 1 The condition of SP SepHerose Fast Flow

1.3.4 Superdex Peptide 10/300 GL 凝膠過濾層析純化

根據(jù)實驗前期結果確定純化的植物乳桿菌素分子量在3～10 kDa 之間，而Superdex Peptide 10/300 GL凝膠過濾層析柱對蛋白質(zhì)的分離范圍在0.1～7 kDa 之間，因此選擇Superdex Peptide 10/300 GL 凝膠過濾層析柱進一步對待測樣品純化，純化條件如表2 所示[14]。

表2 凝膠過濾層析的純化條件Table 2 The condition of Superdex Peptide

1.3.5 純化后效價測定

采用相對抑菌效價法對菌株的抑菌活性進行檢測[15]。相對效價值計算公式為：

x：每孔中待測細菌素的加樣體積；

n：對指示菌出現(xiàn)抑菌圈狀態(tài)的孔數(shù)[16]。

將104IU·mL-1的Nisin 標準液用0.02 mol·L-1HCl 依次稀釋成等差梯度效價的標準溶液。圖1 是細菌素效價標準曲線，R2等于0.994 2，線性較好，可用來計算植物乳桿菌素相對效價值[16]。

圖1 Nisin 效價標準曲線Fig.1 The standard curve of Nisin

1.3.6 分子量的測定

采用雙層瓊脂擴散法，指示菌為金黃色葡萄球菌，對收集的各個組分分別進行抑菌性實驗，凍干濃縮具有抑菌作用的樣品液體，增大植物乳桿菌素樣品液體濃度。凍干粉于適當蒸餾水稀釋后，采用Tricine SDS-PAGE 凝膠電泳測定其分子量[17-19]。

1.3.7 HPLC 檢測植物乳桿菌素的純度

采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）檢測的植物乳桿菌素的純度[20]，色譜條件如表3 所示[21]：

表3 RP-HPLC 的色譜條件Table 3 The condition of RP-HPLC

2 結果與分析

2.1 陽離子交換層析純化植物乳桿菌素M1-UVs301

由圖2 可見，經(jīng)過SP Sepharose Fast Flow 層析柱的進一步純化和分離，圖譜上的蛋白吸收峰比較顯著，說明在250～320 mL 收集的洗脫液活性突出，用牛津杯法處理收集的洗脫液驗證抑菌功能。同時大量制備收集該譜段的活性組分，4 ℃保存，以備后續(xù)的分離純化。

圖2 SP Sepharose Flast Flow 純化植物乳桿菌素M1-UVs301 的層析圖譜Fig.2 The chromatogram of plantaricin purification on SP-Sepharose

2.2 Superdex Peptide 10/300 GL 純化植物乳桿菌素

為提高植物乳桿菌素M1-UVs301 純度，在經(jīng)過初步純化后，利用Superdex Peptide 10/300 GL 柱對其進行更高精度的純化。由初期Tricne SDS-PAGE 結果可初步判定該細菌素的分子量在3.5～8.5 kDa 之間，而該凝膠肽柱可對分子量在0.1～7 kDa 之間的小肽進行純化。由圖3 可知，色譜圖中出現(xiàn)兩個蛋白吸收峰，一處在11～13 mL（較?。?，另一處在18～22 mL（較大），對收集的組分進行抑菌試驗（牛津杯法），結果表明11～13 mL 之間收集的組分具有抑菌活性。將此區(qū)間內(nèi)的蛋白超濾濃縮后，冷藏保存?zhèn)溆茫? ℃）。

圖3 Superdex Peptide 10/300 GL 純化植物乳桿菌素M1-UVs301 色譜圖Fig.3 The chromatogram of plantaricin purification on Superdex Peptide 10/300 GL

2.3 植物乳桿菌素M1-UVs301 純化效價的測定

根據(jù)蛋白濃度曲線y=0.104 9 x+0.1.422 4（R2=0.994 2）可以得到原始樣品和各部分純化結果的蛋白含量，進而推測植物乳桿菌素M1-UVs301 在純化過程中的變化如表4。經(jīng)Superdex Peptide 10/300 GL柱純化后植物乳桿菌素M1-UVs301 的比活力增加趨勢顯著[22]，可高達26 122.4 AU·mg-1，證實了該種純化方法比較適于植物乳桿菌素M1-UVs301 的純化分析檢測。但是純化后的植物乳桿菌素M1-UVs301 產(chǎn)量上不高，下一步研究還需針對發(fā)酵條件參數(shù)的優(yōu)化和影響發(fā)酵過程的條件的重新選擇。

表4 植物乳桿菌素純化表Table 4 Purification table of plantaricin

2.4 Tricine SDS-PAGE 檢測植物乳桿菌素M1-UVs301 的蛋白分子量

采用Tricine SDS-PAGE 實驗驗證，經(jīng)過多次純化后得到的植物乳桿菌素M1-UVs301 的分子量及其純度如圖4，蛋白凝膠上的條帶單一明顯，并且在3.4 kDa 左右表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，表明所得樣品純度較好。

2.5 高效液相色譜檢測植物乳桿菌素M1-UVs301的純度

圖5 為HPLC 色譜結果圖。由圖可知，樣品出現(xiàn)蛋白吸收峰，最高峰出現(xiàn)在保留時間16.152 min 處，但仍可在最高峰附近觀測到少許雜峰，這說明仍需對植物乳桿菌素M1-UVs301 進行更高精度的純化，從而提高其純度。大量研究也表明，純化工藝中提取物純度損失大，提取率低，仍是目前細菌素分離純化的主要瓶頸。

2.6 植物乳桿菌素M1-UVs301 的氨基酸測定分析

氨基酸測定分析結果見表5。結果表明，植物乳桿菌素M1-UVs301 含有13 種氨基酸，其中纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）等疏水性氨基酸占比較高，達到氨基酸總量的61.89%，證明植物乳桿菌素M1-UVs301 的疏水特性顯著，與目前的相關研究結論保持一致。與此同時，疏水特性是維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結構直相關的特殊理化性質(zhì)，還可以對其功能和性質(zhì)產(chǎn)生直接的影響，所以也可推測細菌素的疏水特性和其抑菌機理息息相關。其余親水性氨基酸占比為21.68%，且主要為在溶液中以正離子形式存在的堿性氨基酸，這也證實了植物乳桿菌素M1-UVs301 符合陽離子交換層析柱的純化應用特性。還可看出在其氨基酸組成中還有其他未知種類氨基酸，這些均可對其抗菌特性造成影響。

2.7 植物乳桿菌素M1-UVs301 的二級結構測定分析

通過計算試驗結果結合文獻參考，酰胺I 帶的譜峰指認研究存在程度較小的差異化。采用以下指認范圍：α-螺旋出現(xiàn)于1 660 ～1 650 cm-1范圍內(nèi)；β-折疊出現(xiàn)于1 640～1 600 cm-1和1 670～1 690 cm-1范圍內(nèi)；β-轉角出現(xiàn)于1 700～1 660 cm-1范圍內(nèi)；無序結構出現(xiàn)于1 650～1 640 cm-1范圍內(nèi)。其中去卷積二階導數(shù)譜如圖6 所示。植物乳桿菌素二級結構定量計算如表6 所示，其中β-折疊含量較高，說明分子間有較強的氫鍵作用。

圖6 酰胺Ι 帶二階導數(shù)譜和擬合計算譜Fig.6 Amide Ι with second derivative spectra and spectral fitting calculation

表6 植物乳桿菌素的二級蛋白結構定量計算Table 6 Quantitative calculation of the secondary structure of bacteriocins

3 結論

植物乳桿菌素M1-UVs301 陽離子交換層析柱分離純化后，在250～320 mL 的收集液活性突出，精度純化后在11～13 mL 的收集液具有顯著抑菌活性。純化后植物乳桿菌素M1-UVs301 比活力顯著增加至26 321 AU·mg-1，蛋白凝膠上條帶單一明顯，在3.4 kDa 左右抑菌活性顯著，表明陽離子交換層析柱對植物乳桿菌素的分離純化效果顯著。同時氨基酸及蛋白結構分析的結果表明，該植物乳桿菌素M1-UVs301 為一種疏水肽，二級結構中β-折疊含量較高，為該植物乳桿菌素的結構及功能特性研究提供數(shù)據(jù)支持及理論基礎。