汪伯毅，鄒璟，黃國(guó)付

以椎間盤退變?yōu)槭紕?dòng)因素的腰椎退行性疾病臨床多發(fā)，且易復(fù)發(fā)。退變基礎(chǔ)上，若伴隨有脊柱持續(xù)軸向負(fù)荷，易加速椎間盤老化、纖維環(huán)破裂，繼而出現(xiàn)影像學(xué)改變以及腰腿部不適癥狀。既往臨床醫(yī)生多關(guān)注腰椎間盤退行性疾病的癥狀處理，對(duì)于椎間盤退變機(jī)制的重視不夠，一定程度上影響了椎間盤退行性疾病的有效防治。一直以來(lái)，以針灸為主的中醫(yī)外治手段廣泛應(yīng)用于腰椎退行性疾病的治療中，但針灸治療的機(jī)理尚不十分明確。近年來(lái)，研究者注意到細(xì)胞凋亡異常在椎間盤退變中作用關(guān)鍵[1]，細(xì)胞凋亡增加后椎間盤退變的發(fā)生和發(fā)展明顯加強(qiáng)[2]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中具有核心調(diào)控作用。能否探尋干預(yù)椎間盤細(xì)胞凋亡的手段值得廣大科研工作者研究。本研究擬觀察夾脊電針對(duì)兔退變腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)的影響，試圖從細(xì)胞凋亡角度探討電針防治腰椎退行性疾病的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與器材與試劑 ①動(dòng)物：本次實(shí)驗(yàn)20只骨骼發(fā)育成熟的雄性新西蘭大白兔(月齡5～6個(gè)月，體質(zhì)量3.0～4.0kg)均由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證書編號(hào)42000500005577)。開始實(shí)驗(yàn)前大白兔均給與適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(武漢市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)。將20只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)后分為正常組、假模型組、模型組和電針組4個(gè)組別。每組各5只。②器材：東風(fēng)汽車設(shè)備制造廠提供椎間盤軸向加壓造模器；實(shí)驗(yàn)兔固定器為課題組成員自己制備；采用美國(guó)通用電氣公司生產(chǎn)的Signa HDx 3.0T磁共振器；采用南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的韓氏穴位神經(jīng)刺激儀；針灸針為一次性，由蘇州醫(yī)療用品廠有限公司提供，規(guī)格0.30mm×25mm；切片機(jī)由上海徠卡儀器有限公司生產(chǎn)提供(RM2016)；采用上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供的DGX-9003B型烘箱；采用格蘭仕微波爐電器有限公司提供的P70D20P-TF型微波爐；采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的WD-9405A型脫色搖床；采用重慶光電儀器有限公司提供的XSP-C204型普通光學(xué)顯微鏡；③試劑：PBS溶液(0.01M)；NaH2PO4(0.593g)；Na2HPO4(5.802g)；NaCl(17.0g)；去離子水(ddH2O，定容至2L)；10×EDTA修復(fù)液(谷歌生物，目錄號(hào)：G1010H2O2)；H2O2(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，目錄號(hào)：1001218)；BSA(Roche，北京索萊寶科技有限公司分裝，目錄號(hào)：A8020)；抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(Dako Denmark A/S，REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，貨號(hào)：K5007)；Anti-Caspase-3 Rabbit pAb(GB11009-1)；Anti-Caspase-9 Rabbit pAb(GB11053-1)。

1.2 方法 ①實(shí)驗(yàn)造模：參照研究者Kroeber[3]及黃國(guó)付等[4]的造模方法，先將實(shí)驗(yàn)兔固定于多功能操作臺(tái)上，用10%水合氯醛(1mL/kg)在兔耳緣靜脈注射麻醉。麻醉成功后進(jìn)行備皮，分別在實(shí)驗(yàn)兔L4、L5椎體椎旁約1.5cm定位，稍后做1cm垂直切口，逐層分離肌肉直至椎體暴露，用克氏針(直徑1.5mm)垂直刺入兩椎體間，借助電鉆力輔助克氏針橫穿透椎體及對(duì)側(cè)皮膚，稍后對(duì)切口進(jìn)行縫合。調(diào)整克氏針兩端使之平行，最后將自制軸向加壓造模器安裝于克氏針兩端，調(diào)整造模器為200N的壓力，加壓操作時(shí)間為28d(見圖1A～B)。術(shù)后給予實(shí)驗(yàn)兔肌肉注射青霉素(4×106U，1次/d，連續(xù)5d)預(yù)防傷口感染。造模第28d拆除克氏針上的軸向加壓造模器，拔出克氏針，將實(shí)驗(yàn)兔置于3.0T磁共振器上以評(píng)估造模成功與否。造模不成功的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以剔除后補(bǔ)齊樣本量。②實(shí)驗(yàn)方法:正常組(n=5)給予自然喂養(yǎng)，不予特殊處理；假模型組(n=5)實(shí)驗(yàn)兔在L4、L5椎體間穿入克氏針，不予椎體間加壓，不做治療；模型組(n=5)在L4、L5椎體間穿入克氏針，然后施以軸向加壓造模器加壓，不做治療；電針組(n=5)在成功造模的第1d開始施以電針治療(見圖2)。治療方法：取下加壓造模器及克氏針，將實(shí)驗(yàn)兔固定于多功能操作臺(tái)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]中“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位標(biāo)準(zhǔn)定位”，用28號(hào)1寸長(zhǎng)針灸針捻轉(zhuǎn)刺入兔L4-L5雙側(cè)夾脊穴(深度0.5～0.8cm)，待針下有沉澀感時(shí)連接韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(調(diào)頻波2/15Hz，強(qiáng)度1～2mA)，每天行1次針刺治療(時(shí)間20min)，治療周期(連續(xù)6d為1療程，療程間隔1d，共治療4個(gè)療程)。

圖1A～B 造模

圖2 電針治療

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 在造模后第28天各組5只實(shí)驗(yàn)兔均行L4-5椎間盤MRI平掃，評(píng)估造模效果。我們將各實(shí)驗(yàn)兔腰椎間盤DWI原始數(shù)據(jù)傳輸?shù)教幚砉ぷ髡?，?yīng)用軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，生成ADC偽彩圖。在ADC圖上，選取腰椎的中間層面，于L4-5椎間盤中間即在T2WI上觀察到的椎間盤髓核矢狀位的中央?yún)^(qū)選擇1個(gè)點(diǎn)ROI，并測(cè)量ADC值，每點(diǎn)重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。MRI分級(jí)方案參照Thompson椎間盤退變病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)，NP呈膠凍狀，AF排列整齊，透明軟骨樣CEP厚度均勻，椎體邊緣規(guī)則。Ⅱ級(jí)，NP邊緣出現(xiàn)白色纖維組織，AF纖維層之間出現(xiàn)粘蛋白樣物質(zhì)，CEP厚度不規(guī)則，椎體邊緣有凸出。Ⅲ級(jí)，NP內(nèi)出現(xiàn)固化纖維組織，AF與NP界限不清，AF內(nèi)粘蛋白樣物質(zhì)廣泛沉積，CEP可見灶狀缺損，椎體邊緣散在骨贅。Ⅳ級(jí)，NP內(nèi)出現(xiàn)平行于CEP的水平裂隙，AF出現(xiàn)放射狀或環(huán)狀破裂，CEP的軟骨下出現(xiàn)灶狀硬化，椎體骨贅<2mm。Ⅴ級(jí)，裂隙貫穿AF和NP，CEP廣泛硬化，椎體骨贅>2mm。Ⅰ～Ⅴ級(jí)對(duì)應(yīng)計(jì)1～5分統(tǒng)計(jì)。磁共振掃描之后處死實(shí)驗(yàn)兔，取出椎間盤組織，并通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)其中caspase-3、caspase-9表達(dá)的情況。將石蠟切片置于烘箱(65℃)中烘片2h，脫蠟至水，用PBS進(jìn)行沖洗(時(shí)間5min，共沖洗3次)；將切片置于EDTA緩沖液中，通過(guò)微波進(jìn)行修復(fù)，方式為中火至沸后斷電，間隔10min后再采用低火至沸的方式；自然冷卻后用PBS洗3次，每次洗的時(shí)間為5min；切片需阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10min)；PBS洗3次，每次5min，甩干后5% BSA封閉20min(封閉電荷)；把BSA液去除，每張切片加入一抗(50μl稀釋過(guò))覆蓋組織，在4℃環(huán)境中過(guò)夜；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每張切片加相應(yīng)種屬的二抗50～100μl，在4℃環(huán)境中孵育50min；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，之后每張切片加新鮮DAB溶液50～100μl，通過(guò)顯微鏡來(lái)控制其顯色；顯色完全后，通過(guò)蒸餾水或自來(lái)水進(jìn)行沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化(1s)，自來(lái)水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗；切片經(jīng)過(guò)70%～100%梯度的酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，其中每10min一個(gè)梯度。將切片放在普通顯微鏡下，調(diào)整好位置后觀察、采集圖片，每張切片選擇3個(gè)高倍鏡視野，鏡下棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用Image J圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模情況 部分實(shí)驗(yàn)兔在建立模型一周內(nèi)出現(xiàn)一側(cè)耳廓部分缺失，考慮耳源靜脈注射損傷所致。造模后共10只實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)下肢活動(dòng)欠靈活，4只實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)肢體癱瘓，3只實(shí)驗(yàn)兔在造模后一周內(nèi)死亡，肢體癱瘓及死亡的動(dòng)物均予以剔除后補(bǔ)齊樣本量。各組實(shí)驗(yàn)兔在造模及電針干預(yù)期間食欲正常，反應(yīng)靈活，無(wú)肌肉萎縮，無(wú)蓬亂及感染。

2.2 4組實(shí)驗(yàn)兔第28天椎間盤MRI比較 正常組實(shí)驗(yàn)兔、假模型組實(shí)驗(yàn)兔各椎間盤信號(hào)強(qiáng)度相當(dāng)，均為均勻明亮的高信號(hào)；而模型組實(shí)驗(yàn)兔和電針組實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)過(guò)造模處理后椎間盤信號(hào)強(qiáng)度較相鄰正常椎間盤信號(hào)有所降低，有的椎間盤甚至出現(xiàn)黑色，表明造模成功。見圖3A～H。

圖3A～H 4組椎間盤MRI比較

2.3 4組實(shí)驗(yàn)兔ADC值及MRI分級(jí)比較 與正常組同期比較，假模型組第28天 ADC值及MRI分級(jí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組第28天 ADC值明顯下降(P<0.05)，MRI分級(jí)明顯上升(P<0.05)；與模型組同期比較，電針組第28天 ADC值明顯上升(P<0.05)，MRI分級(jí)明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 4組實(shí)驗(yàn)兔干預(yù)第28天ADC值及MRI分級(jí)比較

2.4 4組caspase-3及caspase-9表達(dá)比較 與正常組同期比較，假模型組第28天 caspase-3及caspase-9表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組第28天 caspase-3及caspase-9表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。與模型組同期比較，電針組第28天 caspase-3及caspase-9表達(dá)下降(P<0.05)。見圖4A～C。

3 討論

正常椎間盤沒有血管組織供應(yīng)其營(yíng)養(yǎng)，主要依靠軟骨終板途徑進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。隨著年齡增長(zhǎng)，椎間盤退變程度有所增加，髓核細(xì)胞數(shù)目會(huì)相應(yīng)減少，含水量下降，合成細(xì)胞外基質(zhì)的質(zhì)量降低[6]。此時(shí)，若長(zhǎng)期過(guò)度壓力施加于椎間盤，會(huì)加速軟骨終板的損傷，影響到椎間盤的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)及代謝廢物的排除，進(jìn)一步加劇椎間盤退變,繼而引發(fā)腰椎間盤突出癥，退行性腰椎病。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者[7-8]注意到細(xì)胞凋亡與腰椎間盤退變密切相關(guān)，隨著細(xì)胞凋亡增加，椎間盤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞外基質(zhì)的生成減少，椎間盤基質(zhì)原本生成與破壞的動(dòng)態(tài)平衡受到?jīng)_擊，加速了椎間盤退變。目前研究[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡受到多種信號(hào)通路調(diào)控，Caspase家族作為細(xì)胞凋亡通路中最重要的調(diào)控因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡啟動(dòng)及執(zhí)行階段起重要作用。Caspase-3是caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的凋亡執(zhí)行因子，而caspase-9作為caspase-3的上游調(diào)控因子，與caspase-3共同在細(xì)胞凋亡中起到關(guān)鍵作用[10]。研究者趙英倫等[11]報(bào)道了腰椎間盤退行性病變患者血清caspase-3，caspase-9濃度明顯高于正常健康者，并且血清caspase-3，caspase-9濃度越高者腰椎間盤突出節(jié)段越多，進(jìn)一步說(shuō)明了凋亡因子caspase-3，caspase-9很可能跟腰椎間盤退變密切相關(guān)。而研究者Chen[12]注意到基因敲除動(dòng)物模型中，抑制caspase-3的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段可顯著阻滯體內(nèi)和體外的細(xì)胞凋亡?；诖?，探尋可以有效減少椎間盤組織中caspase-3，caspase-9表達(dá)的手段，將為抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，繼而延緩椎間盤退變提供可能。

目前臨床上針對(duì)腰椎間盤退行性疾病的干預(yù)手段較多，而諸多開放/微創(chuàng)手術(shù)，理療，藥物治療均不能從根本上阻止LDD的發(fā)生和發(fā)展。電針以其突出的療效一直活躍于LDD的防治中，且得到了國(guó)際社會(huì)的關(guān)注和認(rèn)可[13-14]。夾脊穴位于背腰部，脊柱正中旁開0.5寸，與旁行的足太陽(yáng)膀胱經(jīng)和正中的督脈聯(lián)系密切，可通過(guò)調(diào)控兩經(jīng)而治療腰痛。而現(xiàn)代研究[15]亦從解剖及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)角度證實(shí)了夾脊穴深刺緩解局部肌肉痙攣，平衡脊椎內(nèi)外環(huán)境而治療腰痛。

本課題組前期的研究證實(shí)了電針對(duì)腰椎間盤退變性疾病有良好的治療作用，且能降低LDD引起的免疫反應(yīng)[16-17]。本研究通過(guò)持續(xù)加壓裝置作用于實(shí)驗(yàn)兔腰椎間盤，誘導(dǎo)模型兔發(fā)生椎間盤退變(符合人的自然退變征像)，繼而通過(guò)夾脊電針治療28d，觀察夾脊電針對(duì)兔退變椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)的影響，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模成功后兔腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)較造模前明顯增強(qiáng)，表明椎間盤退變后，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞外基質(zhì)的生成減少，而電針夾脊穴干預(yù)28d后兔退變腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達(dá)明顯降低，表明電針夾脊穴干預(yù)有利于細(xì)胞凋亡因子表達(dá)下調(diào)。由此，我們推測(cè)夾脊電針通過(guò)下調(diào)凋亡促進(jìn)因子caspase-3、caspase-9的表達(dá)來(lái)抑制椎間盤細(xì)胞凋亡，繼而糾正細(xì)胞外基質(zhì)合成與分解的失衡，從而來(lái)達(dá)到延緩椎間盤退變的目的。這將為臨床應(yīng)用針刺防治腰椎退行性疾病提供科學(xué)的理論依據(jù)。但夾脊電針具體通過(guò)哪個(gè)信號(hào)通路介導(dǎo)而抑制細(xì)胞凋亡有待我們進(jìn)一步研究。