鐘東明，賴星星，張明清，舒 琥

大刺鰍基因克隆及表達分析

鐘東明，賴星星，張明清，舒 琥

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

【】了解大刺鰍() 肌肉生長抑制素(myostatin) 基因的序列及其在生長發(fā)育中的調控功能。利用RACE方法克隆大刺鰍全長cDNA序列，采用熒光定量PCR分析其在不同組織和胚胎發(fā)育階段的表達情況。大刺鰍cDNA序列全長2 690 bp，包含200 bp 5′非編碼區(qū)、1 359 bp 3′非編碼區(qū)和1 131 bp開放閱讀框，編碼376個氨基酸。前22個氨基酸殘基為信號肽，第37 ~ 254位氨基酸殘基為TGF-β前肽域，第282 ~ 376位是TGF-β結構域，具蛋白酶水解位點RARR和C端生物活性區(qū)的9個保守半胱氨酸殘基。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，大刺鰍MSTN氨基酸序列與合鰓目、鱸形目魚類同源性較高，與哺乳動物、鳥類、爬行類、兩棲類同源性較低。實時定量PCR分析表明，大刺鰍基因在各組織中均有表達，肌肉中表達量最高，眼、腦次之，鰓表達量最低；大刺鰍胚胎發(fā)育的各階段基因均有表達，囊胚期表達量最高，其次為多細胞期，出膜期表達量最低。

大刺鰍；；基因；克隆；表達

肌肉生長抑制素 (myostatin, MSTN) 又稱生長/分化因子8 (growth/differentiation factor，GDF-8)，由McPherron等[1]1997年首先從小鼠 () 骨骼肌cDNA文庫中克隆獲得。MSTN具有轉化生長因子-β (transforming growth factor β, TGF-β) 家族共有的結構特點：N端有一段由非親水性氨基酸序列構成的信號肽，C端具保守的蛋白酶水解位點RXXR，C端活性區(qū)含多個保守半胱氨酸（Cys）殘基，靠分子間的二硫鍵形成二聚體發(fā)揮功能[2-3]?；蛟诓溉閯游镏蟹植驾^為保守，主要存在于肌肉中，抑制肌肉細胞增殖和分化，是肌肉生長的負調控因子[4]：敲除的小鼠，肌肉細胞增殖加快，骨骼肌量明顯增加[5]；在過表達的轉基因小鼠中，肌肉量明顯降低[6]；比利時蘭牛() 和皮埃蒙特牛（）由于基因突變，出現(xiàn)“雙臀”表型[7-8]。因為基因在肌肉生長中的負調控作用，近年來廣受關注。目前，魚類基因也被大量克隆，其中包括鯉形目的蘭格湖裸鯉（）[10]、淇河鯽()[11]、縮骨鯽(var.)[12]、草魚()[13]、鳡()[14]，鮭形目的鮭()[15]、虹鱒()[16]，鯡形目的刀鱭()[17]，鱸形目的真鯛()[18]、鱖()[19]，鰈形目的牙鲆()[20]等。Lee等[22]通過轉RNAi和MSTN重組前肽產物可抑制牙鲆基因表達，促進魚類肌肉增長和體質量增加。證實對魚類肌肉生長與發(fā)育的負調控作用。

大刺鰍 () 俗稱納錐、石錐、粗麻割、辣椒魚、刀槍魚，隸屬于合鰓目( Symbranchiformes)、刺鰍科( Mastacembelidae)、刺鰍屬 ()[23]，廣泛分布于東南亞等國家，主要棲息于巴基斯坦、印度、斯里蘭卡、孟加拉和中國等不同的水系[24-25]，我國主要分布于福建、廣東、廣西、貴州、云南和海南等地區(qū)。大刺鰍富含多種氨基酸，營養(yǎng)價值高，具有較高的經(jīng)濟價值。近年來，因過度捕撈，中國各地大刺鰍野生資源急劇減少，已被福建、廣東、湖南等省列為重點保護野生水生動物。對于大刺鰍的研究主要集中在群體遺傳[26-28]、形態(tài)差異[29-30]、生理生化[31-32]、養(yǎng)殖技術[33-34]等方面。在養(yǎng)殖生產過程中大刺鰍生長相對較慢，制約了該產業(yè)的發(fā)展。迄今有關大刺鰍肌肉生長方面的研究很少，筆者克隆大刺鰍全長cDNA序列，并分析大刺鰍基因在不同組織和胚胎發(fā)育時期的表達，為研究大刺鰍肌肉生長和發(fā)育的分子機制以及繁殖育種提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大刺鰍成魚購自廣東廣州增城，體質量（80±5）g。無傷病，體格健壯。胚胎樣本取自廣東佛山大健魚苗水產有限公司。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Tissue Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌()感受態(tài)細胞DH5α購自生工生物工程（上海）有限公司；Taq酶、pMD-I9-T、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SMARTer? RACE 5′/3′ Kit購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。所有引物、測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

用MS-222試劑麻醉大刺鰍成魚，剖取腦、肌肉、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胃、腸、眼、鰓、精巢和卵巢等12種組織，迅速放入液氮中凍存，用RNAprep Pure Tissue Kit提取總RNA。取多細胞期、囊胚期、原腸胚期、肌節(jié)出現(xiàn)期、出膜期的胚胎，出膜后3、7、15、30 d仔魚，成魚肌肉樣品置于液氮中，提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，用分光光度計檢測總RNA濃度及純度。采用TaKaRa公司PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒合成第一鏈。

1.4 mstn全長cDNA的克隆和序列分析

根據(jù)GenBank的黃鱔（）（登錄號：KM103284.1）、尖吻鱸（）（登錄號：XM_018696695.1）等物種基因序列通過同源克隆法設計引物MSTNF1和MSTNR1（表1）進行PCR擴增，得到大刺鰍部分片段。大刺鰍cDNA 5′端和3′端非編碼區(qū)的擴增采用 SMARTer? RACE 5′/3′ Kit擴增試劑盒，按照說明書要求操作，所用特異性引物見表1。將所得PCR產物經(jīng)純化后克隆到pMD-19-T載體上，轉化大腸桿菌（DH5α）后，挑選陽性克隆進行測序。大刺鰍cDNA拼接全長序列應用BLAST工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性比對分析。用ExPASy工具（https://web.expasy.org/ protscale/）推測其開放閱讀框和編碼的氨基酸序列。應用Clustal X軟件（http://www.clustal.org）進行氨基酸序列比對。利用MEGA7.0軟件（https://www. msgasoftware.net）以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)-Poisson Correction 模型構建系統(tǒng)發(fā)生樹，自引導檢驗(Bootstrap) 獲得系統(tǒng)分支的置信度(重復1 000次)。

1.5 大刺鰍mstn基因的組織特異性表達檢測

以實時qPCR法測定基因在大刺鰍成魚各組織、胚胎和胚后發(fā)育各時期的表達量。以(表1) 為內參，依據(jù)已克隆的大刺鰍基因cDNA 全長設計的MSTN-Real-F和MSTN-Real-R 為大刺鰍的特異性引物，反轉錄按HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) 試劑盒要求進行。Real-time qPCR 按ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒要求操作；反應體系20 μL：SYBR 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，DEPC水7.2 μL；每個樣品重復3次。擴增反應在Roche Light Cycler480儀上進行，反應程序：95 ℃30 s；95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。PCR反應后溫度從60 ℃上升到95 ℃，繪制熔解曲線，以判斷擴增產物的正確性。用2–ΔΔct法計算不同組織的相對表達量，用SPSS17.0軟件分析差異顯著性，結果用平均值±標準誤（mean±SE）表示，用Excel 2010作圖。

表1 大刺鰍分子克隆和實時熒光定量PCR引物序列

Table 1 Primers used for cloning and quantitative expression of M. armatus mstn gene

2 結果

2.1 大刺鰍mstn基因cDNA全長和氨基酸序列

所克隆大刺鰍基因cDNA全長2 690 bp。其中5′ 非編碼區(qū)長200 bp，3′ 非編碼區(qū)長1 359 bp，編碼區(qū)長1 331 bp，包含AATAA典型轉錄終止子加A信號，共編碼376個氨基酸（圖1）。有RXXR保守結構和9個保守的半胱氨酸殘基活性區(qū)。GenBank登錄號MN121847。經(jīng)預測，MSTN氨基酸序列前22個氨基酸殘基組成信號肽，切割位點在Ser22與Asp23之間；理化性質分析表明，大刺鰍MSTN蛋白等電點為5.56，相對分子質量為42 605.64。其氨基酸組成中以亮氨酸（Leu）的含量最高（8.0%），絲氨酸（Ser）次之（7.4%），色氨酸（Trp）含量最低（1.6%）。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為61.07，是一種不穩(wěn)定蛋白。此外，蛋白質氨基酸殘基親疏水性總平均值為-0.404，為親水蛋白。MSTN氨基酸序列保守區(qū)域，第37 ~ 354位氨基酸殘基是TGF-β前肽保守域，第282 ~376位氨基酸殘基為TGF-β功能區(qū)。

雙下劃線部分為信號肽序列，方框為蛋白水解位點；單下劃線和波浪下劃線分別為TGF-β前肽域和TGF-β結構域；圓圈字母C為保守的半胱氨酸殘基；*為終止密碼子；陰影部分為加尾信號。

The double-underline and box were the sequences of signal peptide and conservative hydrolytic site;Thesingle underline and wave underline were the conserved domain of TGF-β propeptide and TGF-β; The letters C with circle are conservative cysteine residues; The “*” indicates the stop codon (TGA); The shadow indicates tailing signal.

圖1 大刺鰍基因序列和氨基酸序列

Fig. 1 Nucleotide sequence and putative amino acid sequence ofin

2.2 大刺鰍MSTN氨基酸序列同源性

經(jīng)對比（圖2），大刺鰍MSTN編碼序列與GenBank上其他23種動物（表2）均存在9個保守的半胱氨酸（Cys）殘基，且近C-端區(qū)域內的序列高度保守。大刺鰍MSTN與尖吻鱸、大黃魚（）、斑鱖（）同源度較高，分別為94.68%、93.09%、92.55%；在分子系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）上與同屬于合鰓目的黃鱔聚為一支，親緣關系最近。根據(jù)圖3，魚類與哺乳動物形成獨立進化分子，與形態(tài)學系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合。

“*”表示所有物種的氨基酸殘基相同，“.”表示氨基酸殘基相似。矩形方框為RXRR蛋白水解位點；箭頭表示 9 個保守的半胱氨酸殘基，各種動物MSTN的 GenBank 登錄號見表2。

表2 大刺鰍MSTN氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹所用物種信息

圖3 大刺鰍與其他物種MSTN系統(tǒng)進化樹

2.3 大刺鰍mstn組織表達及不同發(fā)育時期的表達

基因在大刺鰍腦、肌肉等11個不同組織中表達量不同（圖4），在肌肉中表達量最高 (< 0.05)，其次為眼、腦、性腺和心臟，鰓中表達量最低。

字母不同者差異顯著（P < 0.05）；O，卵巢；T，精巢；B，腦；Mu，肌肉；L，肝臟；E，眼；Sp，脾；K，腎臟；I，腸；St，胃；Gi，鰓；H，心臟

大刺鰍胚胎和胚后發(fā)育各階段均檢測到mRNA的表達，囊胚期表達量較高，其次為原腸胚期，肌節(jié)出現(xiàn)期和出膜期表達量較低。胚后發(fā)育呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢，在成魚背部肌肉表達量最高（圖5）。

凡含一個相同字母者則差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；1. 多細胞期；2. 囊胚期；3. 原腸胚期；4. 肌節(jié)出現(xiàn)期；5. 出膜期；6. 出膜后3 d；7. 出膜后7 d；8. 出膜后15 d；9. 出膜后30 d；10. 成魚背部肌肉

3 討論

本研究利用RACE方法首次克隆得到大刺鰍基因全長序列，其編碼的蛋白質N末端具有分泌必需的信號肽序列、蛋白水解位點RXXR和9個保守半胱氨酸殘基，與其他物種MSTN具有相同特征。大刺鰍MSTN信號肽剪切及蛋白水解位點同合鰓目的黃鱔、鱸形目大黃魚等種類相同，切割位點均在Ser22和Asp23之間，類胰蛋白酶作用位點為“RARR”。MSTN與TGF-β超家族其他成員一樣，先合成較長的前體蛋白，切除信號肽后，在RXRR位點水解形成潛在相關肽和成熟肽，隨后形成肌抑素復合物調控肌肉生長[22]。大刺鰍MSTN蛋白序列同合鰓目黃鱔、鱸形目尖吻鱸等魚類MSTN同源性最高，親緣關系最近；而與哺乳類和鳥類同源性較低，親緣關系較遠。魚類中存在-1、-2兩個基因亞型，草魚[13]、斑馬魚（）[35]等魚類中均發(fā)現(xiàn)了兩種形式的。本研究所克隆的大刺鰍MSTN在系統(tǒng)進化樹上與其他魚類MSTN-1聚為一大支，因此推測其可能為大刺鰍-1型。實驗未能擴增出-2型基因序列，大刺鰍是否存在-2還有待進一步研究。

對牛等哺乳動物的相關研究發(fā)現(xiàn)，主要在骨骼肌中高表達。由于魚類存在多個同源基因，不同基因亞型的表達水平和分布均存在差異。-2型通常僅在腦和肌肉中表達[36]，-1型分布較廣泛，除肌肉外，腦、眼、肝臟、脾臟、鰓、腸、腎、卵巢、精巢等多個組織中均有表達。本研究中，大刺鰍在肌肉中高表達，其次是眼、腦，其他組織表達量較低，這與縮骨鯽[12]、鮭[15]等魚中的研究結果相一致。盡管在不同魚類組織間存在表達水平的差異，但在各種魚類的肌肉組織中均檢測到基因不同水平的表達，表明基因在魚類肌肉生長發(fā)育中的重要調控作用?；蛟诓煌~類腦組織中均被證實表達量較高，僅次于或者高于肌肉，表明腦也是的重要表達場所，該基因可能參與成魚神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的發(fā)育[36]。大刺鰍胚胎發(fā)育過程中，在整個發(fā)育階段均有表達，類似的結果在對淇河鯽[11]、斑馬魚[35]、青海湖裸鯉()[37]研究中也有發(fā)現(xiàn)。在不同物種胚胎發(fā)育階段的表達趨勢也存在較大差異，草魚隨著胚胎發(fā)育的進行，表達量逐步升高[38]。青海湖裸鯉表現(xiàn)為先升后降的趨勢[37]。大刺鰍胚胎發(fā)育階段的表達趨勢同淇河鯽、斑馬魚相似，在囊胚期和原腸胚期表達水平較高，神經(jīng)胚期顯著降低，出膜期有所上升，這可能與神經(jīng)胚期肌節(jié)形成具有一定相關性[39]。此外，隨著胚后發(fā)育的進行，表達量逐漸升高，在成魚背部肌肉中表達量最高，這可能與MSTN在個體發(fā)育不同階段所起的調控作用有關。本研究發(fā)現(xiàn)，與大刺鰍胚胎發(fā)育時期存在一定趨勢性表達差異，推測與其參與調控胚胎各時期肌肉形成和發(fā)育的功能相關，但對其調控機制還有待進一步研究。此外，作為調控肌肉形成發(fā)育的相關基因，唐永凱等[40]在吉富羅非魚中發(fā)現(xiàn)其內含子Ⅱ內的1個SNPs表現(xiàn)多態(tài)性，與吉富羅非魚體型（體厚/體長、體高/體長）存在顯著相關（< 0.05）。另外，張世勇等[41]在斑點叉尾鮰（）多態(tài)性研究中發(fā)現(xiàn)SNP位點g.4355 G>C與斑點叉尾鮰的體質量和體長呈顯著性負相關。本研究首次獲得大刺鰍的基因全長，可為其生產表型差異的關聯(lián)性研究以及其遺傳改良等研究提供基礎。

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Molecular Cloning and Expression Profiles of Myostatin Gene in

ZHONG Dong-ming, LAI Xing-xing, ZHANG Ming-qing, SHU-Hu

（,,510006,）

To characterize thecDNA sequence and study its regulatory function in growth and development of.Full-lengthcDNA of ofwas cloned by the RACE techniques, and quantitative real time PCR was used to analyze the expression ofin different embryonic development stages andt tissues.The full length cDNAis 2 690 bp with 200-bp 5′-untranslated region, 1 359-bp 3′-untranslated region, and 1131-bp open reading frame (ORF)encoding 376 amino acids pre-proprotein. The putative mstn contained a 22 amino acid signal peptide, a TGF-β propeptide domain (37 – 254), a TGF-β domain (282 – 376). A conserved proteolytic processing site RIRR and 9 cysteine residues in can be found in conserved locations of the protein. Phylogenetic analysis showed that the MSTN was homologous with that of the synbranchians and perciformes. However, it has low similarity to MSTN of mammals, birds, reptiles and amphibians. Quantitative real-time PCR analysis showed that thegene was expressed in most tissues examined, with the highest expression detected in the muscle, followed by the eye and brain, and the lowest expression was detected in the gill.gene transcript was found in all stages of embryo development with the highest expression in blastocyst stage followed by multi-cell stage, and the lowest expression was detected in hatching stage.

;; gene; cloning; expression

Q78；Q959.482

A

1673-9159（2020）03-0014-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.003

2019-12-28

中國-東盟海上合作基金項目（2018.01—2020.12）；國家公益性行業(yè)(農業(yè))重大專項（201303048）；廣東省海洋漁業(yè)科技攻關與研發(fā)項目（A201601A05；2017A0007）

鐘東明（1994―），男，碩士研究生，研究方向為魚類生理與分子生物學。Email：1558256177@qq.com

舒琥（1965―），男，教授，博士。 E-mail: shuhu001@ 26.com

鐘東明，賴星星，張明清，等. 大刺鰍基因克隆及表達分析[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：14-21.

（責任編輯：劉慶穎）