劉亞月，梁健文，薛欣怡，梁金月，馬小翔，張 翼

基于OSMAC策略的3株海洋真菌發(fā)酵條件篩選與優(yōu)化

劉亞月，梁健文，薛欣怡，梁金月，馬小翔，張 翼

（廣東海洋大學食品科技學院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋生物制品工程實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心 // 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室 // 廣東海洋大學海洋藥物研究所，廣東 湛江 524088）

【】篩選可促進海洋真菌產(chǎn)生代謝產(chǎn)物更豐富的發(fā)酵條件，進一步挖掘菌株在抗阿爾茨海默癥方面的潛力。基于OSMAC策略，分別選用馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基和葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(GPY) 培養(yǎng)基，并設(shè)置3種鹽度（3、30和100），對sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4 等3株海洋真菌進行小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。通過觀察真菌在培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)變化，并根據(jù)TLC指紋圖譜、乙酰膽堿酯酶 (AChE) 抑制、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除和鹵蟲致死活性篩選模型等技術(shù)手段篩選出代謝產(chǎn)物豐富、毒性小且AChE抑制活性與抗氧化活性產(chǎn)物豐富的發(fā)酵培養(yǎng)條件。菌株001的最優(yōu)發(fā)酵條件是鹽度3的GPY培養(yǎng)基，菌株019的最優(yōu)發(fā)酵條件是鹽度3的PDB培養(yǎng)基，菌株ZN4-5-4的最優(yōu)發(fā)酵條件是鹽度3的PDB培養(yǎng)基。OSMAC策略指導下，改變培養(yǎng)基條件對菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物有顯著影響。

OSMAC；海洋真菌；次生代謝產(chǎn)物；抗乙酰膽堿酯酶；抗氧化

阿爾茨海默病(Alzheimer's Disease, AD) 是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上以記憶障礙、失語、失用、失認、執(zhí)行功能障礙，以及人格和行為改變等為特征，多發(fā)于60歲以上老人[1-2]。2018年全球該病患者高達5 000萬，我國AD患者人數(shù)超過1 000萬，已居世界第一[3-4]。近20年來，研發(fā)的AD藥物臨床失敗率高達99.6%[5]，有效的AD藥物開發(fā)已迫在眉睫。目前，他克林、多奈哌齊、毒扁豆堿、加蘭他敏、石杉堿甲、利斯的明等[6-7]乙酰膽堿酯酶 (AChE) 抑制劑是改善AD的最常用藥物，該類藥物可抑制AChE活性，顯著增加中樞乙酰膽堿含量。自由基清除藥物也可改善AD[8]。而微生物資源是AChE抑制劑和自由基清除藥物的天然來源，相關(guān)研究漸多。由于目前臨床上使用的AChE抑制劑多存在半衰期較短、副作用較大等缺點，不利于患者的長期服用[9]，因此，從微生物中尋找新的選擇性高、毒副作用小的AChE抑制劑廣受關(guān)注。

OSMAC（One Stain-Many Compounds）策略[10-12]，亦稱單菌株多次級代謝產(chǎn)物策略，是通過改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成分、狀態(tài)，添加酶抑制劑，調(diào)控表觀遺傳，混合培養(yǎng)等方法，充分挖掘微生物合成次級代謝產(chǎn)物的能力，從而獲得更多類型的次級代謝產(chǎn)物。還可通過改變C、N源，C/N比，鹽度，金屬離子的種類和含量，培養(yǎng)體系pH值，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間等培養(yǎng)條件來刺激微生物，激活不同的合成基因簇，挖掘其產(chǎn)生不同代謝產(chǎn)物的能力，從而獲得骨架新穎、活性高的新化合物。劉炳新[13]基于OSMAC策略研究一株南海軟珊瑚共附生真菌NG-15-3時，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基可獲得不同的代謝產(chǎn)物；王曉麗[14]采用OSMAC策略從極地海洋真菌sp. D-1發(fā)酵物中成功分離到20個海松烷型二萜類化合物，部分化合物顯示了一定的抗病毒活性和較強烈的細胞毒活性。因此，利用OSMAC策略可有效激活菌株的代謝能力，獲得豐富、結(jié)構(gòu)新穎且有生物活性的代謝產(chǎn)物。

在AD藥物開發(fā)過程中，既要考慮藥物本身對患者的藥效，還要考慮藥物對患者神經(jīng)系統(tǒng)的副作用。因此，在粗提物組分活性篩選時，需要避免有強毒性的先導化合物。筆者基于OSMAC策略，對sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4等3株海洋真菌分別選用4種不同培養(yǎng)基、在3種鹽度下進行小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，并用TLC (Thin Layer Chromatography)指紋圖譜、乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholinesterase, AChE) 抑制、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除和鹵蟲致死活性篩選模型等技術(shù)對菌株次生代謝產(chǎn)物的生物多樣性和化學多樣性，以期挖掘出各菌株代謝產(chǎn)物豐富、毒性小且AChE抑制活性與抗氧化活性產(chǎn)物豐富的發(fā)酵培養(yǎng)條件，為深入研究這三株菌株的代謝潛力，挖掘抗AD相關(guān)活性先導化合物提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 海洋真菌sp. 001和019sp.分離自2016年采于湛江紅樹林自然保護區(qū)的紅樹植物楊葉肖槿（），經(jīng)ITS rDNA全序列分析確定為黃絲曲霉菌（Genbank登錄號：MN826194）和青霉菌（Genbank登錄號：MN826202）；海洋真菌ZN4-5-4則是分離自2017年采集于瓊州海峽的沉積泥，經(jīng)ITS rDNA全序列分析確定為曲霉菌（Genbank登錄號：MN826203）。3株菌株均保存于廣東海洋大學海洋藥物研究所。

1.1.2 主要儀器與試劑 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Epoch2酶標儀，美國BioTek公司；R-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BüChi公司；多功能紫外透射儀WFH-201B，上海精科實業(yè)有限公司；HP Plus 50D超高壓液相色譜儀，蘇州利穗有限公司。

乙酰膽堿酯酶（C3389）、碘代硫代乙酰膽堿 (Acetylthiocholine iodide, ATCI，DA0048）、牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA，A1933)、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH，D9132)，均購自Sigma-Aldrich；5, 5’-二硫代二硝基苯甲酸 (Dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB，D8130)，購自Ruibio公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。GF254硅膠高效薄層層析板購自德國默克公司。鹽水蝦幼蟲卵購自中國愛家水族館。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖水（Potato-dextrose Broth,PDB）培養(yǎng)基：蔗糖20 g，蛋白胨5 g，海鹽適量（鹽度3時添加量為3 g，鹽度30時添加為30 g，鹽度100時添加量為100 g），加入純水至1 L，于121 ℃下滅菌30 min。

大米培養(yǎng)基：大米50 g，海鹽適量（鹽度3時添加量為3 g，鹽度30時添加為30 g，鹽度100時添加量為100 g），加純水定容至1 L，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

葡萄糖/蛋白胨/酵母膏(Glucose/Peptone/Yeast, GPY）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，蛋白胨0.6 g，酵母膏1.4 g，K2PO40.2 g，MgSO4?H2O 0.1g，海鹽適量（鹽度3時添加量為3 g，鹽度30時添加為30 g，鹽度100時添加量為100 g），加純水定容至1 L，121 ℃下高壓滅菌30 min。

察氏培養(yǎng)基（鹽度30）：蔗糖30 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，NaNO32 g，海鹽30 g，加純水定容至1 L，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 OSMAC策略下菌株的小規(guī)模培養(yǎng) 將平板培養(yǎng)的長勢狀況良好的菌株001、019、ZN4-5-4分別接種到10種不同的培養(yǎng)基（鹽度3、30、100的PDB培養(yǎng)基，鹽度3、30、100的大米培養(yǎng)基，鹽度3、30、100的GPY培養(yǎng)基，鹽度30的察氏培養(yǎng)基），培養(yǎng)物分別記為A1-A10、B1-B10、C1-C10。每組設(shè)置2個平行組，于28 ℃、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)14 d，觀察菌株在不同培養(yǎng)基中生長狀態(tài)的變化。

1.2.2 菌株次生代謝產(chǎn)物的提取 將培養(yǎng)后的菌株分別用不同方法提取次生代謝產(chǎn)物。對PDB培養(yǎng)基發(fā)酵液、察氏培養(yǎng)基發(fā)酵液和GPY培養(yǎng)基發(fā)酵液分別加入等體積的乙酸乙酯，萃取3次，減壓濃縮，得粗提物；而大米培養(yǎng)基發(fā)酵物則通過加入等體積的甲醇進行浸泡提取，超聲30 min，過濾，將甲醇提取液減壓濃縮，得粗提物。最后干燥、稱量粗提取物質(zhì)量（）。

1.2.3 菌株次生代謝產(chǎn)物的TLC圖像分析 將上述粗提物用甲醇配制成10 mg/mL的濃縮液，采用硅膠薄層層析板對各粗提物的化學多樣性進行分析。選擇氯仿∶甲醇= 7∶1二元溶劑體系作為TLC分析的展開劑，并在波長254 nm和365 nm下觀察代謝產(chǎn)物的分布情況，最后用碘化鉍鉀試劑進行顯色，對次生代謝產(chǎn)物中含氮類次生代謝產(chǎn)物進行追蹤分析。

1.2.4 菌株次生代謝產(chǎn)物的AChE抑制活性測定通過優(yōu)化的Ellman比色法[15]測定粗提物對AChE體外抑制活性。

初篩：將各粗浸膏溶解于二甲基亞砜（DMSO）并配成1 mg/mL的濃縮液，在96孔板每孔中加1 μL的樣品，再依次加入49 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）、10 μL 0.2 U/mL AChE和20 μL DTNB，將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱保溫10 min。然后每孔加入20 μL ATCI，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min后，通過酶標儀測定405 nm處的光密度值，以鹽酸化多奈哌齊作為陽性對照。通過下述公式計算化合物對AChE的抑制率，其中s,0為加入樣品和BSA但不加入AChE的光密度，s為加入樣品和AChE的光密度，c為加入AChE但不加入樣品的光密度，0為加入BSA但不加入樣品和AChE的光密度。

抑制率=[(c－0)－(s－s,0)]/(c－0)。

復(fù)篩：經(jīng)初篩后，選擇AChE抑制率大于50%的樣品進行活性復(fù)篩。采用倍半梯度稀釋法對樣品進行稀釋后，按照上述方法測定各粗提物的IC50值（化合物對AChE抑制為50%所對應(yīng)的濃度）。用軟件Origin 8.0對抑制率和濃度對數(shù)（ln）進行三次多項式回歸方程擬合，得濃度對數(shù)曲線，并算得ln（IC50），用Microsoft Excel算得IC50。

1.2.5 菌株次生代謝產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性測定 使用Sharma和Bhat描述的DPPH自由基清除法[16]，在96孔板中測定粗提物的抗氧化能力。

初篩：總反應(yīng)體系為100 μL，樣品為含50 μL 0.16 mmol/L PPH和50 μL 1 mg/mL粗提物(溶解)的DMSO（s）。用50 μL 0.16 mmol/L DPPH和50 μL DMSO作對照（c），50 μL 甲醇和50 μL溶解不同濃度化合物的DMSO作為樣品本底（s,0），50 μL和50 μL DMSO作為空白（0）。將96孔板放置在暗處30 min，通過酶標儀測定517 nm處的光密度。用維生素C為陽性對照。

抑制率=[(c－0)－(s－s,0)]/(c－0)。

復(fù)篩：經(jīng)初篩后，選擇DPPH自由基清除率大于50%的樣品進行活性復(fù)篩。采用倍半梯度稀釋法稀釋樣品，按照1.2.4方法測定各粗提物的EC50值（化合物對DPPH自由基清除率為50%所對應(yīng)的濃度）。將清除率和濃度對數(shù)（ln）導入Origin 8.0軟件。用軟件Origin 8.0對清除率和濃度對數(shù)（ln）進行三次多項式回歸方程擬合，得濃度對數(shù)曲線，并算得ln（EC50），用Microsoft Excel算得EC50。

1.2.6 菌株次生代謝產(chǎn)物的鹵蟲致死活性測定[17]采用96孔板法，用鹽水蝦幼蟲測試化合物的致死能力。每孔加199L含鹵蟲幼體的溶液（每孔約含20只鹵蟲），制成測試培養(yǎng)板。將粗提物用DMSO配制成10 mg/mL的溶液，加入1L DMSO溶液到每個培養(yǎng)板孔中，每個粗提物樣品設(shè)置成500 g/mL終濃度，設(shè)3個平行樣。在28 ℃的培養(yǎng)箱中保持光照培養(yǎng)24 h后，記錄每孔中死亡幼蟲數(shù)量和總數(shù)。同時，用DMSO和CuSO4分別作為空白對照和陽性對照。鹵蟲致死活性采用鹵蟲致死率表示：

鹵蟲致死率 =[（加藥致死率－空白組對照致死率）/ 空白對照組存活率]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株培養(yǎng)的表觀形態(tài)對比

用10種培養(yǎng)基對3株海洋真菌進行小規(guī)模培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示。

A, 菌株001; B, 菌株019; C, 菌株ZN4-5-4。1-3：鹽度3、30、100的PDB培養(yǎng)基；4-6：鹽度3、30、100的大米培養(yǎng)基；7-9：鹽度3、30、100的GPY培養(yǎng)基；10：鹽度30的察式培養(yǎng)基。

對同一菌株而言（以菌株001為例），隨著培養(yǎng)基條件的變化，菌株的生長形態(tài)發(fā)生較明顯的變化（A1-A10）。在PDB培養(yǎng)基中，菌株001為白色的菌絲體，菌液為淡黃色，隨著鹽度的增加，菌液顏色也逐漸加深（A1-A3）；在大米培養(yǎng)基中，菌株001為青色的菌絲體，隨著鹽度的增加，菌絲體的生長越來越旺盛（A4-A6）；在GPY培養(yǎng)基中，菌株001也為白色菌絲體，菌液則為紅褐色，菌液顏色隨著鹽度的增大也逐漸加深（A7-A9）；在鹽度30的察式培養(yǎng)基中，菌株001也為白色菌絲體，菌液則為白色（A10）。同理，也可在菌株019（B1-B10）和ZN4-5-4（C1-C10）中觀察到生長形態(tài)的變化。由此推測，菌株在不同培養(yǎng)基條件下代謝產(chǎn)物可能不同。

2.2 菌株次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量分析

用不同溶劑提取的小規(guī)模培養(yǎng)后菌株次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量見圖2。結(jié)果表明，對3株海洋真菌而言，大米培養(yǎng)基條件下各菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量均最高（均大于2.4 g），且隨著鹽度的增加，產(chǎn)量總體呈上升趨勢。此外，菌株001在鹽度3的PDB培養(yǎng)基（= 0.25 g）和察氏培養(yǎng)基（= 0.38 g）條件下的產(chǎn)量相對較高；菌株019在鹽度3的PDB培養(yǎng)基（= 0.26 g）和鹽度10的GPY培養(yǎng)基（= 1.58 g）條件下的產(chǎn)量較高；菌株ZN4-5-4在鹽度3和30的PDB培養(yǎng)基（分別為0.39、0.41 g）和鹽度30的察式培養(yǎng)基（= 0.63 g）條件下產(chǎn)量較高。

圖2 各菌株在不同培養(yǎng)基條件下的提取物質(zhì)量

2.3 菌株次生代謝產(chǎn)物的TLC圖像分析

各菌株代謝產(chǎn)物化學多樣性分析結(jié)果見圖3。圖3可知，PDB培養(yǎng)基（鹽度3、30和100）和GPY培養(yǎng)基（鹽度3）條件下，3株海洋真菌的代謝產(chǎn)物種類均比大米培養(yǎng)基豐富。進一步分析圖3（a1、a2）可知，在鹽度30的GPY培養(yǎng)基條件下，菌株001的代謝產(chǎn)物種類相對豐富。而在鹽度30的察氏培養(yǎng)基條件下，菌株019的代謝產(chǎn)物種類也較為豐富（圖3：b1-b2）。同理，鹽度100的GPY培養(yǎng)基條件下菌株ZN4-5-4代謝產(chǎn)物種類豐富度也較大。菌株001會產(chǎn)生含氮類的次生代謝產(chǎn)物（圖3：a3）；菌株019則只在鹽度3的大米培養(yǎng)基中產(chǎn)生含氮類次生代謝產(chǎn)物（圖3：b3）；菌株ZN4-5-4在各種培養(yǎng)基條件下不產(chǎn)生含氮類次生代謝產(chǎn)物（圖3：c3）。

2.4 菌株次生代謝產(chǎn)物的生物活性測定

各菌株粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性見表1。表1可見，不同培養(yǎng)條件下的菌株001粗提物AChE抑制活性弱或者無，但卻顯示較好的抗氧化活性，在鹽度30、100的PDB培養(yǎng)基，鹽度3的大米培養(yǎng)基，鹽度3的GPY培養(yǎng)基，鹽度30的察式培養(yǎng)基條件下，其粗提物的DPPH自由基清除率均大于50%。對菌株019而言，在鹽度3的PDB培養(yǎng)基條件下獲得的次生代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的AChE抑制活性（抑制率為81.8%）；而在PDB（鹽度3、30和100）培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基（鹽度3、30）和察式培養(yǎng)基的條件下的次生代謝產(chǎn)物則顯示明顯的抗氧化活性（清除率均大于50%），尤其是在鹽度30的PDB培養(yǎng)基條件下獲得的次生代謝產(chǎn)物的清除率為92.1%。菌株ZN4-5-4在鹽度3和30的PDB培養(yǎng)基條件下的次生代謝產(chǎn)物則同時具有顯著的AChE抑制活性和抗氧化活性（自由基清除率為89.1%）；同時在鹽度3的GPY培養(yǎng)基條件下的次生代謝產(chǎn)物具有顯著的AChE抑制活性（抑制率為89.5%）；在鹽度100的PDB培養(yǎng)基條件下的次生代謝產(chǎn)物則具有顯著的抗氧化活性。

a、b、c分別代表菌株001、019、ZN4-5-4；1、2、3分別為各粗提物的254 nm紫外圖像、365 nm熒光圖像和碘化鉍鉀顯色圖像

表1 粗提物的AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性

對各粗提物的鹵蟲致死活性進行分析可知，菌株001在鹽度100的大米培養(yǎng)基和不同鹽度的GPY培養(yǎng)基條件下的次生代謝產(chǎn)物鹵蟲致死率低于50%，因此，大米培養(yǎng)基（鹽度100）、GPY培養(yǎng)基（鹽度3、30、100）是菌株001產(chǎn)物毒性較低的條件。同理可知，大米培養(yǎng)基（鹽度100）、察氏培養(yǎng)基（鹽度30）、GPY培養(yǎng)基（鹽度30和100）是菌株019產(chǎn)物毒性較低的條件。而大米培養(yǎng)基（鹽度3）、察氏培養(yǎng)基（鹽度30）、GPY培養(yǎng)基（鹽度3、30和100）是菌株ZN4-5-4產(chǎn)物毒性較低的條件。

經(jīng)初篩后，抑制率或者清除率大于50%的樣品活性復(fù)篩結(jié)果（表2和表3）表明，菌株ZN4-5-4在鹽度3、30、100的PDB培養(yǎng)基條件下的次生代謝產(chǎn)物具有顯著的DPPH自由基清除活性，EC50值分別為35.5、23.6、48.6 μg/mL。而其他粗提物均顯示弱的清除活性（EC50> 100 μg/mL）。同時，該菌株在鹽度3的GPY培養(yǎng)基條件下的代謝產(chǎn)物還顯示較強的AChE抑制活性，其IC50值為82.4 μg/mL。

表2 部分樣品的AChE的抑制活性

說明Note：1) 陽性對照positive control。

表3 部分樣品的DPPH自由基清除活性

說明Note：1）陽性對照positive control。

3 討論

高鹽、高壓、低溫和低營養(yǎng)的海洋生態(tài)環(huán)境，使生長在其中的海洋微生物具有獨特的代謝機制，可產(chǎn)生骨架新穎、活性顯著的活性物質(zhì)[18]。但傳統(tǒng)單一的培養(yǎng)模式下，大多數(shù)微生物的合成基因簇不表達或以極低水平表達，處于沉默狀態(tài)。因此，如何利用現(xiàn)有的研究成果和技術(shù)手段激活這些沉默基因以獲取新型微生物天然產(chǎn)物已成為當務(wù)之急[19]。一些學者利用OSMAC策略對海洋真菌進行培養(yǎng)，證明通過改變菌株的培養(yǎng)條件可達到發(fā)掘菌株潛能、激活沉默基因表達的目的。如Numata等[20-21]以2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母浸膏和人工海水（pH 7.0）為培養(yǎng)基培養(yǎng)海藻的附著真菌sp.OUPS-79，從中分離到12個吲哚生物堿類化合物，而將其中的酵母浸膏改為麥芽浸膏（其他成分不變）時，則獲得11個完全不同的次生代謝產(chǎn)物。如Liu等[22]對海洋真菌AS-53的研究中，發(fā)現(xiàn)當采用液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)時，得到雙硫二酮哌嗪生物堿類化合物；而使用大米培養(yǎng)基進行發(fā)酵時，則可獲得倍半萜類化合物。本研究中，分別采用PDB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基和GPY培養(yǎng)基，并設(shè)立3種鹽度（3，30和100）對三株海洋真菌進行培養(yǎng)時，相對于固體培養(yǎng)基（大米培養(yǎng)基），液體培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基、GPY培養(yǎng)基和察式培養(yǎng)基）產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類更豐富，但是產(chǎn)量較低。而液體培養(yǎng)基中，PDB培養(yǎng)基普遍顯示較好的AChE抑制和抗氧化活性，GPY培養(yǎng)基則顯示較弱的毒性。推測可能是由固、液培養(yǎng)基中的碳源差異所致。有研究[23]表明，碳源是培養(yǎng)基中重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，它為菌體生長與代謝提供了物質(zhì)基礎(chǔ)與能量。碳源不同，菌體對碳源種類的利用程度不同，從而造成菌體產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類和產(chǎn)量不同。大米培養(yǎng)基以淀粉作為碳源，而液體培養(yǎng)基均則以葡萄糖或者蔗糖為碳源。可見，相比淀粉，3株海洋真菌對葡萄糖和蔗糖的利用效果更佳。

另外發(fā)現(xiàn)，僅大米培養(yǎng)基對于含氮類次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有一定激活作用，而液體培養(yǎng)基對含氮類次生代謝的產(chǎn)生激活效果不顯著，這可能與培養(yǎng)基的成分、發(fā)酵規(guī)模、發(fā)酵時間等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

對sp. 001、sp. 019和ZN4-5-4等3株海洋來源真菌，本研究采用OSMAC策略研究不同培養(yǎng)基和鹽度條件下對真菌次生代謝產(chǎn)物的影響。綜合菌株次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、種類、AChE抑制活性、DPPH自由基清除活性和鹵蟲致死活性分析，確定了菌株001的最佳發(fā)酵條件是鹽度3的GPY培養(yǎng)基，菌株019的最佳發(fā)酵條件是鹽度3的PDB培養(yǎng)基，菌株ZN4-5-4的最佳發(fā)酵條件是鹽度3的PDB培養(yǎng)基，表明OSMAC策略對菌株的次生代謝產(chǎn)物有顯著影響。3株菌株的具體化學成分研究正在深入進行，有待后續(xù)報道。

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Screening and Optimization of Fermentation Conditions on Three Marine Fungi Based on the OSMAC Strategy

LIUYa-yue，LIANGJian-wen，XUEXin-ying，LIANGJin-yue，MAXiao-xiang，ZHANG Yi

（//////////,524088,）

To obtain the optimal fermentation culture conditions for more abundant metabolites, and exploite the potential of strains in drugs targeting Alzheimer’s disease.Based on the OSMAC strategy, three marine-derived fungisp. 001,sp. 019 andZN4-5-4 were cultured by potato-dextrose broth (PDB) medium, Czapek’s medium, rice medium and glucose / peptone / yeast extract (GPY) medium with three different salinities (i.e. 0.3%, 3%, and 10%). The morphological variations of the mycelia were observed. Then, based on the thin layer chromatography (TLC) fingerprints, acetylcholinesterase (AChE) inhibitory, 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical scavenging, and artemia lethality activities screening models, the fermentation conditions with rich metabolites, low toxicity and rich anti-acetylcholinesterase and antioxidant products were initially screened.The optimal fermentation condition for strain 001 is with PDB medium in salinity 0.3%; the optimal fermentation condition for strain 019 is with PDB medium in salinity 0.3%; the optimal fermentation conditions for srain ZN4-5-4 is with PDB medium in salinity 0.3%.Under the OSMAC strategy, the conditions of the medium exert significant effect on the production of secondary metabolites of the strain.

OSMAC; marine fungus; secondary metabolites; anti-acetylcholinesterase; antioxidant

R282.71；Q949.325

A

1673-9159（2020）03-0065-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.009

2019-12-19

國家自然科學基金（21807015）；廣東海洋大學博士啟動項目（R18008）；廣東省揚帆計劃引進緊缺拔尖人才項目（201433009）；廣東省自然科學基金（2018A030307046）；深圳市科創(chuàng)委基礎(chǔ)研究自由探索項目（JCYJ20170306165013264）；廣東省應(yīng)用科技研發(fā)重大專項（2016B020235001）；廣東省促進經(jīng)濟發(fā)展專項資金(海洋經(jīng)濟發(fā)展用途)項目(粵自然資源合[2019] 015號)；深圳市大鵬新區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展資金(KY20180203及PT201901-05)；湛江市海洋漁業(yè)局項目（A18018）

劉亞月（1989―），女，講師，研究方向為海洋天然產(chǎn)物。Email：yayue_liu@163.com

張翼，男，教授，研究方向為海洋天然產(chǎn)物。Email：hubeizhangyi@163.com

劉亞月，梁健文，薛欣怡，等. 基于OSMAC策略的3株海洋真菌發(fā)酵條件篩選與優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：65-72.

（責任編輯：劉慶穎）