梁燕秋，司徒艷結(jié)，董忠典，許文強(qiáng)，梁杏儀，景占鑫

炔諾酮對(duì)斑馬魚腸道免疫調(diào)節(jié)因子的干擾效應(yīng)

梁燕秋1，司徒艷結(jié)1，董忠典2，許文強(qiáng)1，梁杏儀1，景占鑫1

（1. 廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【】研究孕激素炔諾酮對(duì)斑馬魚 () 腸道免疫調(diào)節(jié)因子的干擾效應(yīng)。將成年斑馬魚分別在含0、7、84和810 ng/L炔諾酮的水環(huán)境中暴露90 d，分析炔諾酮對(duì)斑馬魚腸道組織中核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB），細(xì)胞因子α干擾素（IFN-α）、白細(xì)胞介素1α（IL-1α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等含量的影響。炔諾酮主要在810 ng/L時(shí)顯著提高雌魚腸道組織中IFN-α、IL-1α和TNF-α含量，以及雄魚腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α含量。炔諾酮可激活斑馬魚腸道組織中NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，從而誘導(dǎo)斑馬魚腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)。

斑馬魚；腸道免疫；炔諾酮；孕激素；干擾；細(xì)胞因子；核轉(zhuǎn)錄因子κB

孕激素是一種類固醇激素，廣泛用于人類避孕藥物以及治療激素引起的各項(xiàng)疾病[1-3]，還廣泛用于畜牧業(yè)，以提高動(dòng)物產(chǎn)量和增肥[4-5]。這導(dǎo)致受納環(huán)境存在不同濃度的孕激素[2,6]，其中炔諾酮（Norethindrone，NET）在加拿大和馬來西亞污水處理廠出水中質(zhì)量濃度高達(dá)159和188 ng/L[7-8]，在中國養(yǎng)豬場沖刷水中質(zhì)量濃度達(dá)143 ng/L[9]。美國受廢水排放河流中檢測出高濃度NET (872 ng/L)[10]。水環(huán)境中殘留的NET會(huì)對(duì)生物的生長發(fā)育和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NET可抑制黑頭呆魚（）和日本青鳉（）產(chǎn)卵量[11]，可引起雌魚發(fā)生雄性化[11-12]，還可改變斑馬魚性別比例，導(dǎo)致更多雄魚產(chǎn)生[13]。此外，黑頭呆魚早期發(fā)育階段暴露于NET可抑制其存活和生長[14]。筆者亦報(bào)道，斑馬魚（）長期暴露于NET會(huì)抑制生長，抑制卵巢成熟，誘導(dǎo)精巢發(fā)育，改變與生殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[15]。迄今，關(guān)于孕激素對(duì)生物免疫功能和炎癥反應(yīng)的研究主要集中于對(duì)人類和哺乳動(dòng)物的干擾效應(yīng)[16-18]。然而，關(guān)于孕激素NET對(duì)生物免疫系統(tǒng)干擾效應(yīng)，尤其是對(duì)魚類腸道免疫調(diào)節(jié)因子的干擾效應(yīng)研究未見報(bào)道。

魚類腸道黏膜層不僅是消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的場所，還是機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的免疫組織[19]，通過腸道相關(guān)淋巴組織（Gut-associated lymphoid tissues，GALT）發(fā)揮免疫防御和免疫調(diào)節(jié)作用。GALT含有許多巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞受到一些刺激物誘導(dǎo)后，可分泌調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的小分子可溶性蛋白——細(xì)胞因子[20]。細(xì)胞因子可促進(jìn)細(xì)胞生長分化和免疫系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)機(jī)體免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用。在斑馬魚中，細(xì)胞因子研究主要包括α干擾素（Interferon α，IFN-α）、白細(xì)胞介素1α（Interleukin 1α，IL-1α）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等，可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路調(diào)控這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生[21]。這些免疫調(diào)節(jié)因子是炎癥反應(yīng)的重要組成部分。

筆者研究成年斑馬魚長期暴露于低劑量NET后，腸道NF-κB、IFN-α、IL-1β、IL-1α和TNF-α等5種免疫調(diào)節(jié)因子的變化，探究NET對(duì)斑馬魚腸道細(xì)胞免疫影響，為評(píng)價(jià)孕激素的生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)化合物

NET購于德國TRC公司，純度≥98%，取25 mg的NET溶于二甲基亞砜（DMSO），制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的母液，放置- 20 ℃下待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚類

健康的成年斑馬魚飼養(yǎng)在廣東海洋大學(xué)水生毒理實(shí)驗(yàn)室，水溫（26±1）℃，水的氧飽和度大于70％，pH控制在7 ~ 8，光暗周期14 h:10 h。每天上午和下午投喂新孵化的鹵蟲（）。

1.3 暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取20 L的魚缸作為暴露容器，暴露水體積為12 L，水體中NET未檢出。設(shè)置12缸，每缸隨機(jī)放入雌、雄健康斑馬魚各8尾，雄魚全長（3.67 ± 0.18）cm、體質(zhì)量（0.37 ± 0.06）g，雌魚全長為（3.60 ± 0.13）cm、體質(zhì)量（0.31 ± 0.03）g。根據(jù)文獻(xiàn)[7-10]報(bào)道以及普通河流中的NET濃度[6]，暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)置10、100、1 000 ng/L 3個(gè)質(zhì)量濃度組和一個(gè)溶劑對(duì)照組（體積分?jǐn)?shù)0.001% DMSO），各組設(shè)3個(gè)平行組。所有NET暴露組均含有體積分?jǐn)?shù)0.001% DMSO助溶劑。暴露期間，每48 h換水1次。飼養(yǎng)條件同1.2，并用虹吸管吸走糞便及食物殘?jiān)?。暴露期間，每周測定水體pH值、溶解氧、電導(dǎo)率等參數(shù)，每天統(tǒng)計(jì)斑馬魚死亡數(shù)量。在暴露90 d后，將斑馬魚至于冰上麻醉、解剖，無菌采集腸道組織，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃下保存。

1.4 腸道免疫因子分析

對(duì)每個(gè)平行中收集的所有腸道組織稱取質(zhì)量，加入500 μL生理鹽水，勻漿，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司）說明書方法測定斑馬魚腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1β、IL-1α和TNF-α等免疫調(diào)節(jié)因子的含量。

1.5 暴露溶液中NET的測定

所有處理組水樣在暴露50、86 d的換水后（0）和換水前（48）采集。水樣分析方法參考文獻(xiàn)[9, 15]。從每個(gè)平行中收集1 L水樣，每個(gè)處理組3個(gè)平行，共12個(gè)水樣，使用固相萃取柱（Waters HLB，6 mL，500 mg）富集水樣中NET，用9 mL色譜純的乙酸乙酯對(duì)固相萃取柱進(jìn)行洗脫。將收集的洗脫液放在緩慢吹出的氮?dú)鈿饬髦写蹈梢宜嵋阴?。? mL色譜純的甲醇將氮吹后殘留在玻璃管中的物質(zhì)重新溶解，隨后密封于2 mL進(jìn)樣小瓶，置于-20 ℃中避光保存，備測。采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（RRLC-MS/MS）（Agilent 1290 LC-Agilent 6460 QQQ, USA）測定NET濃度。NET檢測限和回收率分別為0.02 ~ 0.24 ng/L和72% ~ 107%[9]。NET在3個(gè)處理組的實(shí)測質(zhì)量濃度分別為7、84和810 ng/L，溶劑控制組未測到NET。下文以NET的實(shí)測濃度表示。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式來表示，采用Spss13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，并用OriginPro 2016作圖。采用單因素ANOVA檢驗(yàn)分析方法中的Tukey多重比較法分析溶劑對(duì)照組與NET處理組免疫調(diào)節(jié)因子含量差異的顯著性，≤0.05（*）、≤0.01（**）、≤0.001（***）時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NET對(duì)斑馬魚腸道組織中NF-κB含量的影響

斑馬魚雌魚和雄魚腸道組織中NF-κB含量測定結(jié)果如圖1所示。NET在7和84 ng/L時(shí)對(duì)雌性斑馬魚腸道中NF-κB含量無顯著影響，在810 ng/L時(shí)NF-κB平均值提高，但與對(duì)照組無顯著性差異（圖1A）。在雄魚腸道組織中，NET在7 ng/L時(shí)NF-κB含量平均值低于對(duì)照組，但與對(duì)照組無顯著性差異（圖1B）；NET在810 ng/L時(shí)顯著提高雄魚腸道組織中NF-κB含量（< 0.05），但在84 ng/L時(shí)沒有改變NF-κB水平（圖1B）。

圖1 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中NF-κB含量變化

2.2 NET對(duì)斑馬魚腸道組織中IFN-α含量的影響

雌性和雄性斑馬魚腸道組織中IFN-α含量測定結(jié)果如圖2所示。雌魚腸道中，7和84 ng/L暴露組IFN-α含量平均值較對(duì)照組有一定提高，但變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）；NET在810 ng/L時(shí)顯著提高腸道IFN-α水平（< 0.01）（圖2A）。在雄魚腸道組織中，IFN-α含量在7 ng/L時(shí)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）；NET在84 ng/L時(shí)未改變腸道IFN-α水平，但在810 ng/L時(shí)顯著提高IFN-α含量（< 0.05）（圖2B）。

圖2 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IFN-α含量變化

2.3 NET對(duì)斑馬魚腸道組織中IL-1α含量的影響

雌、雄性斑馬魚腸道組織中IL-1α含量測定結(jié)果見圖3。雌魚腸道中，隨NET暴露濃度的上升，IL-1α含量平均值不斷升高（圖3A），但僅在810 ng/L時(shí)顯著提高IL-1α含量水平（< 0.05）（圖3A）。雄魚腸道中，NET在7和84 ng/L時(shí)IL-1α含量無顯著變化，在810 ng/L時(shí)顯著提高IL-1α含量(<0.001)(圖3B)。

圖3 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IL-1α含量變化

2.4 NET對(duì)斑馬魚腸道組織中IL-1β含量的影響

圖4可見，在雌魚腸道中，各組IL-1β含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅在7 ng/L NET處理組有下降趨勢（圖4A）。在雄魚腸道組織中，NET暴露在7 ng/L時(shí)顯著降低IL-1β含量（<0.01），在810 ng/L時(shí)亦顯著提高了IL-1β水平（<0.05），而在84 ng/L時(shí)IL-1β含量，但無明顯變化（圖4B）。

圖4 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IL-1β含量變化

2.5 NET對(duì)斑馬魚腸道組織中TNF-α含量的影響

雌、雄斑馬魚魚腸道組織中TNF-α含量測定結(jié)果如圖5所示。在雌魚腸道組織中，隨著NET暴露濃度不斷提高，TNF-α含量平均值不斷提升，在810 ng/L時(shí)TNF-α水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01）（圖5A）。在雄魚腸道組織中，NET僅在810 ng/L時(shí)顯著提高TNF-α水平（<0.001），在7、84 ng/L NET處理組TNF-α含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但7 ng/L組平均值有所下降（圖5B）。

圖5 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中TNF-α含量變化

3 討論

本研究表明，NET主要在高濃度組（810 ng/L）對(duì)腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α產(chǎn)生顯著影響，提高了它們的含量，對(duì)腸道免疫系統(tǒng)有潛在的干擾效應(yīng)。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）蛋白家族參與免疫細(xì)胞活化和組織應(yīng)激性反應(yīng)，在生物中廣泛存在[20,22]。NF-κB可調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在細(xì)胞的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，NET在最高濃度組誘導(dǎo)了雄魚腸道組織NF-κB的表達(dá)，且對(duì)雌魚腸道組織NF-κB水平也有提高趨勢，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞因子IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生。本研究也檢測到這些細(xì)胞因子含量在NET處理下顯著上升。

干擾素（IFN）是一種特殊的分泌蛋白或糖蛋白，是人體或動(dòng)物機(jī)體對(duì)環(huán)境中各種刺激（包括病毒）而產(chǎn)生的，通過調(diào)節(jié)干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來達(dá)到發(fā)揮抗病毒的作用[23]。干擾素有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒能力，主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-γ三類。研究發(fā)現(xiàn)，病毒的感染可誘導(dǎo)斑馬魚IFN的表達(dá)，誘導(dǎo)斑馬魚的免疫應(yīng)答[24]。本研究中，NET在810 ng/L時(shí)顯著誘導(dǎo)了雌、雄斑馬魚腸道組織中IFN-α表達(dá)，表明環(huán)境中殘留的NET可誘導(dǎo)斑馬魚腸道干擾素的產(chǎn)生，從而對(duì)環(huán)境中NET做出免疫應(yīng)答效應(yīng)，保護(hù)斑馬魚免受NET的污染，有潛在抗污染能力。

白細(xì)胞介素（IL）是一類由免疫細(xì)胞或白細(xì)胞產(chǎn)生且在免疫應(yīng)答中發(fā)揮極為重要作用的糖蛋白。可參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生[25]，魚類體內(nèi)存在IL-1α與IL-1β兩種類型的分子。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度組NET主要提高了IL-1α和IL-1β的含量，暗示NET可加劇斑馬魚腸道組織的炎癥反應(yīng)，防止機(jī)體受外來物質(zhì)的干擾。值得注意的是，NET在極低濃度時(shí)（7 ng/L）可降低雄魚腸道組織IL-1β含量，可能與暴露濃度有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

腫瘤壞死因子（TNF）是具有生物活性的細(xì)胞因子，主要分為TNF-α和TNF-β兩種亞型，TNF-α由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，而TNF-β由T細(xì)胞產(chǎn)生。斑馬魚TNF主要是由活化的巨噬細(xì)胞所分泌的TNF-ɑ亞型，已有研究顯示，斑馬魚體內(nèi)的TNF-ɑ與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的TNF-ɑ相似[20, 26]，因而重點(diǎn)研究TNF-ɑ在斑馬魚腸道中的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)NET可顯著提腸道TNF-ɑ含量，進(jìn)而使機(jī)體腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死，從而保護(hù)機(jī)體免受污染物侵襲。

環(huán)境中NET等孕激素物質(zhì)進(jìn)入斑馬魚，會(huì)對(duì)斑馬魚腸道組織產(chǎn)生一定影響，而斑馬魚腸道組織將以產(chǎn)生炎癥來抵御NET引起的損傷，并分泌免疫調(diào)節(jié)因子以激起機(jī)體的免疫應(yīng)答，進(jìn)而誘導(dǎo)免疫細(xì)胞對(duì)機(jī)體的炎癥進(jìn)行修復(fù)。湛江近海沉積物中，多氯聯(lián)苯可誘導(dǎo)斑馬魚腸道IL-1β、IL-8和TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[20]；多溴聯(lián)苯醚（DE-71）可提高斑馬魚腸道中IL-1β水平[27]；聚苯乙烯微塑料也可提高斑馬魚腸道中IL-1α、IL-1β、IFN基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和蛋白水平[28]。這些環(huán)境污染物對(duì)免疫調(diào)節(jié)因子的影響，可反映斑馬魚機(jī)體發(fā)生炎癥以及受損情況。因此，免疫調(diào)節(jié)因子的含量變化可以用于監(jiān)測環(huán)境污染物的污染情況。

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Effects of Northindrone on Immunoregulatory Factors of Intestine in Zebrafish ()

LIANG Yan-qiu1, SITU Yan-jie1, DONG Zhong-dian2, XU Wen-qiang1, LIANG Xing-yi1, JING Zhan-xin1

（1.,,524088,; 2.,524088,）

To assess the adverse effects of the progestin northindrone on immunoregulatory factors of the intestine in zebrafish ().Adult zebrafish were exposed to 0, 7, 84 and 810 ng/L northindrone for 90 d, and the effects of northindrone on the contents of nuclear factor κB (NF-κB), as well as cytokines containing interferon α (IFN-α), interleukin 1α (IL-1α), interleukin 1β (IL-1β), and tumor necrosis factor α (TNF-α) were investigated in the intestine of females and males.Northindrone significantly increased the levels of IFN-α, IL-1α and TNF-α in the intestine of females, as well as NF-κB, IFN-α, IL-1α, IL-1β and TNF-α in the intestine of males.Northindrone could activate the NF-κB signaling pathway and promote the secretion of cytokines in the intestine of zebrafish, consequently induce inflammation response in the intestine.

; intestinal immunity; norethindrone; progestin; interruption; cytokines;nuclear factor-kappa B

X174；X503.225

A

1673-9159（2020）03-0001-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.001

2020-01-13

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2017A030310662)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41907346)；廣東海洋大學(xué)科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目(R17075)；廣東海洋大學(xué)2019年度大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（CXXL2019304）

梁燕秋（1989—），女，博士，講師，主要從事環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail: liangyanqiu11@126.com

董忠典（1987—），男，博士，講師，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖及分子生物學(xué)研究。E-mail: dzhd888@163.com

景占鑫（1986—），男，博士，講師，主要從事海洋化學(xué)方向的研究。E-mail：393345494@qq.com

梁燕秋，司徒艷結(jié)，董忠典，等. 炔諾酮對(duì)斑馬魚腸道免疫調(diào)節(jié)因子的干擾效應(yīng)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（3）：1-6.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）