郭志雄，曾澤乾，黃建盛,2,3，王維政，李洪娟，陳 剛,2,3

急性低氧脅迫對大規(guī)格軍曹魚幼魚肝臟氧化應(yīng)激、能量利用及糖代謝的影響

郭志雄1，曾澤乾1，黃建盛1,2,3，王維政1，李洪娟1，陳 剛1,2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室（湛江），廣東 湛江 524025；3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】研究軍曹魚在急性低氧應(yīng)激時肝臟代謝機能狀態(tài)變化。測定急性低氧脅迫前后肝臟氧化應(yīng)激指標、能量利用指標及糖代謝指標的變化。1）急性低氧脅迫后，軍曹魚肝臟超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 活性均降低，與脅迫前差異極顯著（<0.01）；脂質(zhì)過氧化物(LPO) 活性、丙二醛(MDA) 含量均升高，與脅迫前差異極顯著（<0.01）；過氧化氫酶(CAT) 活性略有降低，與脅迫前無顯著性差異（> 0.05）。2）急性低氧脅迫后，軍曹魚肝糖原(LG) 含量、ATP酶活性均下降，與脅迫前差異極顯著（< 0.01）。3）急性低氧脅迫后，軍曹魚肝臟乳酸脫氫酶(LDH)、丙酮酸激酶（PK）、己糖激酶（HK）活性均升高，與脅迫前差異極顯著（<0.01）。急性低氧脅迫對軍曹魚幼魚肝臟組織造成顯著的氧化損傷，使肝臟氧化應(yīng)激、能量利用及糖代謝相關(guān)指標發(fā)生顯著變化。

軍曹魚；急性低氧；氧化應(yīng)激；能量利用；糖代謝

軍曹魚（）隸屬鱸形目、軍曹魚科、軍曹魚屬，亦稱海鱺、海龍等，分布于大西洋、印度洋和太平洋等熱帶水域，為肉食性魚類。因其肉質(zhì)細嫩鮮美、無肌間刺、營養(yǎng)價值高、生長速度快、經(jīng)濟價值高等優(yōu)勢現(xiàn)已成為我國南方沿海地區(qū)深水網(wǎng)箱重要養(yǎng)殖對象，為具有開發(fā)前景海水魚類養(yǎng)殖品種之一。本課題組在2002年突破軍曹魚全人工繁育技術(shù)及規(guī)?；珀P(guān)鍵技術(shù)，成功解決了種苗來源問題。在軍曹魚幼魚生長及抗氧化酶活性[1]、仔魚生長及消化酶活性[2]、血細胞發(fā)生[3]、骨骼系統(tǒng)[4]、消化系統(tǒng)胚后發(fā)育[5]、能量收支[6]等多方面開展研究。近年來，軍曹魚養(yǎng)殖海區(qū)，特別是在較高密度的養(yǎng)殖區(qū)域，常因風和潮汐，水體溫度、季節(jié)等因素的影響而出現(xiàn)短期急性缺氧現(xiàn)象。本實驗室開展系列軍曹魚響應(yīng)急性低氧反應(yīng)機理的探討，并報道了急性低氧對軍曹魚大規(guī)格幼魚血液生化指標的影響[7]。肝臟是機體對外界刺激反應(yīng)最早、最敏感的組織之一，也是最早出現(xiàn)損傷的組織，嚴重時則會使魚類肝臟處于超負荷狀態(tài)[8]。魚類應(yīng)對急性低氧引起的氧化應(yīng)激，肝臟組織的代謝情況也備受關(guān)注[8-11]。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，筆者以大規(guī)格軍曹魚幼魚為對象，研究急性低氧脅迫對其肝臟氧化應(yīng)激、能量利用及糖代謝的影響，以期為軍曹魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及其耐低氧品種選育的抗逆性研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

軍曹魚幼魚100尾，體質(zhì)量（240.78±30.24）g，體長（27.75±2.08）cm，取自廣東省湛江市東海島生物研究基地。2018年7月10日充氧運輸至廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院魚類種子工程與養(yǎng)殖團隊實驗室，置于室內(nèi)自制的循環(huán)水系統(tǒng)（包括供氣、回流水循環(huán)系統(tǒng)、生物濾池和20個養(yǎng)殖水槽等）暫養(yǎng)。養(yǎng)殖水槽容量規(guī)格為長70 cm，寬50 cm，高60 cm，水體交換量90 L/h。將試驗魚分別放入5個水槽中，每個水槽放幼魚20尾。暫養(yǎng)期間，通過調(diào)節(jié)水槽內(nèi)的充氣量大小，保持水中溶解氧在6 mg/L以上，鹽度28 ~ 30，溫度27.5 ~ 29.0 ℃，pH 8.0，氨氮在0.01 mg/L以下，自然光照周期，每天09:00投喂一次海水魚專用配合飼料（水分、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、鈣、磷質(zhì)量分數(shù)分別為9.01%、52.94%、12.21%、14.51%、3.0%以下、2.0%以下、1.8%以下）。暫養(yǎng)2周后進行試驗。試驗開始前一天停止投喂。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的5個水槽中進行。脅迫前采集對每個水槽水體及幼魚取樣。試驗時停止充氣及流水，用保鮮薄膜封閉水槽上方，使水體溶解氧迅速下降，當魚出現(xiàn)缺氧癥狀，上躥下跳和打轉(zhuǎn)隨后臥于水底瀕臨死亡時對水體及幼魚取樣。脅迫前后每個水槽取3次水樣，用碘量法測定水體溶解氧，脅迫前為（6.23±0.23）mg/L，脅迫后為（1.85±0.11）mg/L。實驗魚從開始到出現(xiàn)缺氧癥狀歷時25 ~ 30 min。脅迫前、后每個水槽各取幼魚10尾，置于含100 mg/L MS-222的海水中快速麻醉，用紗布擦干魚體，剖取肝臟組織，迅速置于液氮中速凍，于?80 ℃冰箱中保存待測。

1.3 指標測定

組織樣品按每克待測組織加入9 mL生理鹽水的比例在冰水浴條件下用勻漿機制成100 g/L的勻漿，以2 000 r/min、4 ℃條件離心10 min。取上清液，于4 ℃冰箱保存，用以測定酶活性和蛋白質(zhì)、糖原含量。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、丙酮酸激酶（PK）和己糖激酶（HK）活性以及丙二醛(MDA)、肝糖原(LG)、蛋白質(zhì)含量均使用購自南京建成生物科技有限公司試劑盒，參照說明書檢測。采用羥胺法測定SOD，鉬酸銨法測定CAT活性，微板法測定LDH活性，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量；采用比色法測定ATP酶、PK、HK、GSH-Px活性及糖原含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 5軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，用配對檢驗法分析軍曹魚急性低氧脅迫前后肝臟各指標數(shù)據(jù)差異顯著性，顯著性水平α = 0.05或0.01。

2 結(jié)果

2.1 急性低氧對軍曹魚肝臟氧化應(yīng)激指標的影響

軍曹魚肝臟氧化應(yīng)激指標結(jié)果見圖1。由圖1可知，急性低氧脅迫后，CAT活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（= 2.372，4，> 0.05）（圖1-b）。SOD活性比脅迫前降低18.77 U/mg（95% CI：10.99 ~ 26.55），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 6.204，4，< 0.01）（圖1-a）；GSH-Px活性降低119.2 U/mg（95% CI：61.17至177.2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 5.282，4，< 0.01）（圖1-c）；LPO活性升高0.4 μmol/g（95% CI：-0.5463至-0.2537），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 7.027，4，< 0.01）（圖1-d）；MDA含量升高3.0 nmol/mg（95% CI：-4.134至-1.880），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 6.858，4，< 0.01）（圖1-e）。

**表示差異極顯著（P<0.01）Notes：** shows extremely significant difference.

2.2 急性低氧對軍曹魚肝臟能量利用的影響

軍曹魚肝臟糖原含量、ATP酶活性結(jié)果見圖2。由圖2可知，低氧脅迫后，糖原含量比脅迫前降低9.4 mg/g（95% CI：6.062 ~ 12.75），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 7.234，4，< 0.01）。ATP酶活性下降3.8 U/mg（95% CI：1.999 ~ 5.505），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 5.502，4，< 0.01）。

2.3 急性低氧對軍曹魚肝臟糖代謝的影響

軍曹魚肝臟乳酸脫氫酶活性、丙酮酸激酶活性和己糖激酶活性結(jié)果見圖3。由圖3可知，急性低氧脅迫后，乳酸脫氫酶活性比脅迫前升高115.5 U/mg（95% CI：-143.4 ~ -87.67），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 10.66，4，< 0.01）。丙酮酸激酶活性升高1.1 U/mg（95% CI：-1.132 ~ -1.014），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 46.87，4，< 0.01）。己糖激酶活性升高1.3 U/mg（95% CI：-1.824 ~ -0.7462），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（= 6.132，4，< 0.01）。

**，差異極顯著（Extremely significant difference）（P < 0.01）

圖3 急性低氧對軍曹魚肝臟乳酸脫氫酶活性、丙酮酸激酶活性和己糖激酶活性的影響

3 討論

3.1 急性低氧對軍曹魚肝臟氧化應(yīng)激的影響

研究表明，魚類在低氧環(huán)境下有氧呼吸速率下降，活性氧自由基（ROS）增加，可影響魚體抗氧化防護能力，從而引起魚類產(chǎn)生氧化應(yīng)激[9, 12]。當過多的ROS無法被魚類自身及時有效地消除時,多余的ROS會引發(fā)諸如蛋白、核酸等生物大分子的加重氧化，生成可能直接破壞細胞結(jié)構(gòu)功能完整性的過氧化物產(chǎn)物，引起各種生理機能的改變，最終誘發(fā)疾病[13, 14]。為減少ROS的積累，增強細胞保護，降低氧化應(yīng)激水平，魚類在長期適應(yīng)進化過程中已形成以抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）和小分子抗氧化劑（類胡蘿卜素、維他命等）一套穩(wěn)定的抗氧化體系機制[12, 14]。本研究中，軍曹魚幼魚經(jīng)歷急性低氧脅迫后，肝臟SOD、GSH-Px活性極顯著低于脅迫前水平（<0.01），CAT活性無顯著性差異（>0.05），顯示肝臟抗氧化酶系統(tǒng)不能有效清除機體內(nèi)ROS，機體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致MDA積累。此外，MDA含量和LPO活性極顯著高于脅迫前也證實這一結(jié)論。MDA和LPO為脂質(zhì)過氧化指標，其含量增加表明低氧脅迫已對魚體產(chǎn)生氧化損傷[15, 16]。有觀點認為，脂質(zhì)過氧化物積累過多將會降低甚至降解抗氧化酶活性[17]。經(jīng)歷急性低氧脅迫的軍曹魚幼魚MDA增加、SOD降低的現(xiàn)象支持上述觀點，大黃魚()低氧脅迫[18]研究亦支持這一觀點。在以往研究中，淇河鯽 () 在低氧環(huán)境下肝胰臟抗氧化酶活性顯著降低[9]；葛氏鱸塘鱧()[19]、細鱗肥脂鯉()[20]肝胰臟CAT活性和GSH-PX活性顯著降低，與本研究結(jié)果相似。也有與本研究不一致的報道，如銀鯽()[21]肝臟CAT活性，德國鏡鯉()[11]、鯔魚()[8]肝臟SOD活性在低氧環(huán)境下顯著升高；花鱸（）在低氧脅迫后肝臟中SOD和CAT活力與對照組無顯著性差異[22]。這與魚類對低氧脅迫的耐受性、發(fā)育階段、脅迫處理等因素有關(guān)。魚類響應(yīng)低氧脅迫是一種復(fù)雜的生理過程，是多種因素相互作用的結(jié)果[18]，需在基因水平、信號通路、低氧信號途徑網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等層次深入探討其響應(yīng)機理。

3.2 急性低氧對軍曹魚肝臟能量利用的影響

肝臟是魚類存儲糖原的重要器官[23]。糖原是機體內(nèi)最重要的供能物質(zhì)，對維持機體的能量代謝及重要功能物質(zhì)合成有重要作用[22]，肝糖原、肌糖原是魚體內(nèi)主要的糖存儲能源，但正常情況下肝糖原相對穩(wěn)定，其含量受無氧代謝中乳酸積累影響[29]。研究發(fā)現(xiàn)，魚類面臨低氧脅迫時，會用肌肉、肝臟的糖原作為能量代謝底物來獲得足夠的能量，延長存活時間。如白鰱（）經(jīng)急性低氧處理后，肝糖原含量呈下降趨勢[24]；銀鲇魚（）經(jīng)低氧處理后肝糖原迅速分解并加快糖異生[23]?；|（）肝臟中糖原和乳酸含量則在低氧處理后顯著降低[22]，褐牙鲆() 幼魚經(jīng)10 d的低氧處理后，有明顯動員體內(nèi)糖原作為能量代謝底物的過程[25]。本研究也有類似結(jié)果。軍曹魚經(jīng)歷急性低氧脅迫后，肝糖原含量極顯著降低，表明軍曹魚啟動肝糖原利用應(yīng)對急性低氧應(yīng)激。筆者在前期的研究發(fā)現(xiàn)，軍曹魚經(jīng)歷急性低氧脅迫后，血液中的葡萄糖含量顯著升高[7]，也說明大量的肝糖原分解為葡萄糖釋放到血液中，導(dǎo)致魚體出現(xiàn)應(yīng)激性高血糖現(xiàn)象，是機體自我保護機制的表現(xiàn)。

ATP是魚類進行正常生命活動的主要供能物質(zhì)，其合成由ATP酶控制。水體溶解氧變化影響著魚類ATP酶活性[26, 27]。有研究顯示，隨著水體溶解氧的降低，魚類ATP酶活性呈先升后降的變化趨勢[26]。河川沙塘鱧（）急性低氧時肝臟ATP酶活性呈先上升后回落的趨勢[27]，小鱗毛足鱸() ATP酶在低氧條件下出現(xiàn)上升趨勢[28]。但是，本研究中，急性低氧脅迫后，軍曹魚肝臟ATP酶活性出現(xiàn)極顯著降低（<0.01）。推測軍曹魚在短期（30 min）急性低氧脅迫后，ATP消耗量顯著超過再合成量，魚體調(diào)節(jié)能力在線粒體內(nèi)膜出現(xiàn)損傷后可能受到一定干擾，使能量代謝紊亂。這反映不同魚類應(yīng)對低氧環(huán)境適應(yīng)機理不同，軍曹魚屬于低氧敏感魚類。

3.3 急性低氧對軍曹魚肝臟糖酵解的影響

魚類面臨低氧脅迫后，機體內(nèi)的有氧代謝水平被抑制，導(dǎo)致機體所需要的能量供給不足，機體就會被動地進行以無氧代謝為主的供能方式[22,29-30]。多數(shù)魚類已發(fā)展不同分子策略來應(yīng)對低氧脅迫，如啟用葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-2低氧誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運[31]；采取一系列與糖酵解相關(guān)的酶完成氧化磷酸化過渡到糖酵解轉(zhuǎn)化[32]。就低氧條件下糖酵解相關(guān)酶活性顯著提高來說，這種反應(yīng)更像是一種在細胞水平下必不可少的保護機制，這種機制是一種進化上保守，可滿足細胞短期低氧環(huán)境下的生長所需[33]。在生物體內(nèi)，LDH可催化糖無氧代謝的最終產(chǎn)物乳酸，脫去全部吸附的氫原子，實現(xiàn)乳酸與丙酮酸之間的逆轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化成的丙酮酸在線粒體中被氧化成水和二氧化碳，經(jīng)過電子傳遞鏈生成ATP供能，所以乳酸脫氫酶是糖酵解代謝過程中又一重要酶[34]。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的主要限速酶之一，可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為烯醇式丙酮酸，并產(chǎn)生ATP供能。己糖激酶是催化己糖官能基團的磷酸化糖酵解反應(yīng)的第一步，與底物親和力較低，也決定了其與肝臟生理功能和機體血糖穩(wěn)定密切相關(guān)的關(guān)系，所以也決定了己糖催化激酶在整個磷酸化反應(yīng)中比較重要的作用。研究表明，在機體利用無氧代謝時，魚體內(nèi)LDH活性顯著升高，催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。鳉（）在缺氧下糖酵解酶活性發(fā)生變化，LDH顯著增加[35]；叉尾石首魚（）在缺氧時，鰓中的LDH活力顯著升高[36]；在長時間低氧脅迫下，斑馬魚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)后得出，斑馬魚與糖酵解有關(guān)的基因表達增強[37]。本研究中，經(jīng)歷急性低氧脅迫后，軍曹魚肝臟乳酸脫氫酶活性、丙酮酸激酶活性和己糖激酶活性均出現(xiàn)極顯著性升高，與鳉、叉尾石首魚的結(jié)果一致。一般認為糖酵解受低氧誘導(dǎo)因子（HIF）調(diào)節(jié)。研究表明，LDH和丙酮酸脫氫酶激酶（PDK1）都不同程度地受低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α調(diào)節(jié)。在HIF-1α誘導(dǎo)下，LDH表達可進一步促進丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[38]，PDK1表達則會對丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A產(chǎn)生抑制作用[39]。目前，已從多種魚類中克隆和鑒定出HIF-1ɑ[40-41]，關(guān)于軍曹魚HIF-1ɑ在低氧條件的調(diào)節(jié)有待進一步探討。

4 結(jié)論

在急性低氧脅迫前后，大規(guī)格軍曹魚幼魚在調(diào)節(jié)自身氧化抗氧化酶體系活性的過程中，幼魚肝臟氧化應(yīng)激、能量利用及糖代謝相關(guān)指標均發(fā)生顯著變化，肝臟組織出現(xiàn)一定程度的氧化損傷。

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Effects of Acute Hypoxia on Oxidative Stress, Energy Utilization and Carbohydrate Metabolism in Liver of Large-Sized Juvenile Cobia ()

GUO Zhi-xiong1, ZENG Ze-qian1, HUANG Jian-sheng1,2,3, WANG Wei-zheng1, LI Hong-juan1, CHEN Gang1,2,3

（1.,,524088,; 2.(),524025,; 3.524088,）

To study the changes in metabolic functions of cobia () liver under hypoxia stress.The oxidative stress index, energy utilization index and glucose metabolism index were measured before and after acute hypoxia stress.1) After acute hypoxia stress, the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the liver were decreased, and the differences were highly significant (<0.01) while the increase in lipid peroxide LPO) and malondialdehyde (MDA) were significantly (<0.01). Although the activities of catalase (CAT) was decreased slightly, the difference was not significant (>0.05). 2) After acute hypoxia stress, glycogen (LG) content and ATPase activity in the liver decreased in different degrees, and the differences were highly significant (<0.01). 3) After acute hypoxia stress, lactate dehydrogenase (LDH) activity, pyruvate kinase (PK) activity and hexose kinase (HK) activity in the liver increased in different degrees, and the difference was highly significant (<0.01).Acute hypoxia stress caused significant oxidative damage to the liver of juveniles cobia, resulting in significant changes in oxidative stress, energy utilization and some related indicators of glucose metabolism.

; acute hypoxia stress; oxidative stress; energy utilization; carbohydrate metabolism

S917.4；S965.399

A

1673-9159（2020）03-0134-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.017

2019-12-12

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金資助(CARS-47)；南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(湛江)(ZJW-2019-06)；2018年廣東海洋大學(xué)起航計劃項目(QHJHZR201818)；廣東海洋大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(CXXL2018131)

郭志雄（1993―），男，碩士研究生，主要研究方向海水魚類養(yǎng)殖生理生態(tài)學(xué)。E-mail: 478210431@qq.com

黃建盛（1981―）男，博士，副教授，主要研究方向為海水魚類養(yǎng)殖生理生態(tài)學(xué)。E-mail:huangjs@gdou.edu.cn

郭志雄，曾澤乾，黃建盛，等. 急性低氧脅迫對大規(guī)格軍曹魚幼魚肝臟氧化應(yīng)激、能量利用及糖代謝的影響[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（3）：134-140.

（責任編輯：劉慶穎）