查淑娟，晏繼喜

(武漢市武昌醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，武漢 430063)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者致殘與死亡的最主要原因之一，也是腎衰竭的原因之一。其患病率隨著糖尿病患病率的逐年升高而不斷升高，而且DN的預(yù)后極差，一旦發(fā)生，致死率極高[1-2]。臨床發(fā)現(xiàn)DN存在明顯的腎小球?yàn)V過率高、蛋白尿升高的現(xiàn)象[3]。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是保護(hù)腎小球過濾系統(tǒng)的主要成分，細(xì)胞表面有大量的窗孔，對(duì)水及小分子具有高滲透性，而對(duì)蛋白質(zhì)等大分子的滲透性很低，從而限制了蛋白質(zhì)通過[4]。高血糖狀態(tài)下，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損[5]，其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。研究表明，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能可能與腎衰竭和蛋白尿有關(guān)系[6-7]。因此，修復(fù)DN引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)治療DN具有重大的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有修復(fù)組織、器官損傷的作用[8-9]。己酮可可堿(pentoxifylline，PTX)是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，具有減緩蛋白尿和保護(hù)腎功能的作用[10-11]。筆者以腎小球內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建DN模型，探討PTX在MSCs對(duì)糖尿病腎病腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生清潔型C57BL/6小鼠4只，4～6周齡，購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物合格證號(hào)：42000600020849。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，人工光照明暗12 h交替，自由進(jìn)食和飲水。

1.2試劑 達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)-LG(Hyclone，批號(hào)：SH30021.01)；胎牛血清(BSA，Gibco，批號(hào)：10270-106)；兔抗CD31抗體、兔抗血管內(nèi)皮鈣粘蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-Cadherin)、鼠抗內(nèi)皮素(endothelin，ET)抗體、兔抗血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)抗體、鼠抗細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)抗體(Abcam，批號(hào)：ab28364、ab33168、ab2786、ab6994、ab171123)；兔抗GAPDH(CST，批號(hào)：2118)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、Percoll分離液、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(Bioswamp，批號(hào)：PAB180003，PAB180002、PAB180013、PAB180042、PAB160011)；CD30-APC、CD90-APC、CD105-APC(eBioscience，批號(hào)：17-0311-82、17-0909-41、17-1051-82)；甲醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10010018)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore，批號(hào)：IPVH00010、WBKLS0010)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(BD，批號(hào)：556547)。

1.3儀器 流式細(xì)胞儀(Beckman，型號(hào)：CytoFLEX SL)；顯微鏡(Nikon，型號(hào)：TS100-F)；倒置熒光顯微鏡(Olympus，型號(hào)：IX50)；酶標(biāo)儀(Thermo，型號(hào)：Multiskan FC)；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能儀器有限公司，型號(hào)：Tanon-5200)。

1.4MSCs細(xì)胞分離與鑒定 取C57BL/6小鼠處死、消毒處理后于超凈臺(tái)上暴露骨髓腔。用注射器吸取無血清的DMEM-LG將骨髓沖洗至培養(yǎng)皿，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液。250×g離心10 min，棄上清液。加骨髓細(xì)胞懸液等體積的Percoll分離液(濃度為1.073 g·mL-1)于新離心管中，再加入細(xì)胞懸液，600×g離心30 min，取第二層于離心管中。然后用15%胎牛血清和DMEM-LG完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔3～4 d換液1次，10 d左右細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

用0.25%胰蛋白酶消化處理生長(zhǎng)良好的第3代細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。離心棄上清液，然后用PBS清洗，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)·mL-1。取4只EP管，各加入單細(xì)胞懸液100 μL，第1管設(shè)為正常對(duì)照組，其他三管分別加入CD90-APC、CD105-APC、CD30-APC，各2 μL，4 ℃避光孵育45 min。然后加入流式染色緩沖液重懸細(xì)胞400 μL，進(jìn)行流式染色檢測(cè)。

1.5腎小球內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 取出腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)皿，PBS清洗2次，加入多聚甲醛進(jìn)行固定，PBS清洗3次。0.5%Triton X-100通透細(xì)胞后加入5%BSA，37 ℃封閉1 h。加入一抗(CD31、VE Cadherin)稀釋液置于濕盒內(nèi)，4 ℃孵育過夜，PBS清洗后再加入二抗(FITC標(biāo)記的單克隆抗體)稀釋液，37 ℃孵育1 h。PBS清洗后，染色并在熒光顯微鏡下觀察。

1.6PTX對(duì)MSCs和內(nèi)皮細(xì)胞的毒性檢測(cè) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的MSCs細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于96孔板中，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔單細(xì)胞懸液100 μL(每孔1×104個(gè))。37 ℃培養(yǎng)過夜后，加入1 mmol·L-1(加入96孔板前濃度)PTX進(jìn)行干預(yù)。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。加入二甲亞砜(DMSO)150 μL溶解液，混勻后于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)值。

1.7實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為6組：正常對(duì)照組、損傷組、MSCs組、MSCs+0.1 mmol·L-1PTX組、MSCs+0.3 mmol·L-1PTX組和MSCs+1 mmol·L-1PTX組。除正常對(duì)照組為正常腎小球內(nèi)皮細(xì)胞外，其余5組均采用30 mmol·L-1葡萄糖溶液構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，其中MSCs組、MSCs+0.1 mmol·L-1PTX組、MSCs+0.3 mmol·L-1PTX組和MSCs+1 mmol·L-1PTX組將受損細(xì)胞與MSCs細(xì)胞以1：10的濃度比分別接種于Transwell的上室和下室中進(jìn)行共培養(yǎng)，并用濃度為0.1，0.3和1 mmol·L-1PTX對(duì)其中3組MSCs組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。

1.8腎小球內(nèi)皮細(xì)胞存活率檢測(cè) 內(nèi)皮細(xì)胞和MSCs細(xì)胞共培養(yǎng)24，48 h后，將6組的內(nèi)皮細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為每孔3×103個(gè)，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3復(fù)孔，于37 ℃下培養(yǎng)48 h。然后每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，室溫孵育4 h后加入DMSO150 μL，混勻后在酶標(biāo)儀檢測(cè)A490 nm值。

1.9流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后培養(yǎng)48 h，然后PBS清洗貼壁細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后離心收集細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。各組取5×105個(gè)細(xì)胞，用PBS清洗2次后，離心去上清液。用緩沖液重懸細(xì)胞，并加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，混勻后4 ℃避光孵育30 min。隨后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.10Western blotting檢測(cè)ET、vWF及ICAM-1表達(dá) 提取各組內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白，配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，以每孔10 μL上樣量進(jìn)行電泳。然后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h。按照說明書稀釋抗體，與膜室溫孵育1 h。孵育了一抗(ET 1：500稀釋、vWF 1：500稀釋、ICAM-1 1：1000稀釋)的膜再與HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG 1：10 000稀釋)室溫孵育1 h，PBST洗滌3次，與化學(xué)發(fā)光劑混勻作用后置于化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，掃描條帶，通過軟件讀取條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1MSCs分離培養(yǎng)與鑒定 第3代MSCs細(xì)胞渦旋狀融合生長(zhǎng)，形狀呈梭形，部分含有細(xì)小顆粒(圖1A)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物表達(dá)：CD90表達(dá)率94.78%，CD105表達(dá)率97.72%，陰性指標(biāo)CD30表達(dá)率0.77%，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果符合MSCs特征(圖1B)。

A.第3代MSCs細(xì)胞(×100)；B.流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面抗原：空標(biāo)；陽性指標(biāo)：CD90、CD105；陰性指標(biāo)：CD30。圖1 MSCs分離培養(yǎng)與鑒定A.MSCs cells of the third generation(×100)；B.MSCs surface antigen detected by flow cytometry：blank；positive indicators：CD90，CD105；negative indicators：CD30.Fig.1 Isolation，culture and identification of MSCs

2.2腎小球內(nèi)皮細(xì)胞鑒定 CD31為鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的膜蛋白，VE Cadherin是內(nèi)皮細(xì)胞間一種主要的黏著蛋白。將培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見圖2，大部分細(xì)胞陽性表達(dá)CD31和VE Cadherin，說明該細(xì)胞為腎小球內(nèi)皮細(xì)胞。

2.3PTX亞毒性檢測(cè) MSCs細(xì)胞和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h后，利用MTT檢測(cè)1 mmol·L-1PTX對(duì)細(xì)胞的毒性。MSCs細(xì)胞的生長(zhǎng)率(79.40±0.12)%，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)率(80.80±0.23)%，說明當(dāng)PTX濃度為1 mmol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞的毒性較小。為了避免后續(xù)實(shí)驗(yàn)中PTX本身的毒性作用，在本研究中均采用濃度≤1 mmol·L-1的PTX溶液干預(yù)細(xì)胞。

A.藍(lán)色顯示為細(xì)胞核，綠色顯示為特異性標(biāo)志物CD31；B.藍(lán)色顯示為細(xì)胞核，紅色顯示為細(xì)胞間黏著蛋白VE Cadherin。圖2 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞CD31和VE Cadherin抗體免疫熒光染色(×400)A.nucleus (blue) and CD31，the specific marker (green)；B.nucleus (blue) and VE Cadherin，the intercellular adhesion protein (red).Fig.2 Immunofluorescence staining of CD31 and VE Cadherin in glomerular endothelial cells(×400)

2.4PTX對(duì)高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 在相同的時(shí)間段，與正常對(duì)照組比較，損傷組內(nèi)皮細(xì)胞的活力顯著降低(P<0.01)。與損傷組比較，MSCs組及PTX干預(yù)后MSCs組細(xì)胞活力增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。與MSCs組比較，不同濃度PTX干預(yù)后，細(xì)胞活力均顯著增強(qiáng)(P<0.01)，而且呈PTX濃度依賴性(圖3)。

①與正常對(duì)照組比較，t=15.452，19.763，P<0.01；②與損傷組比較，t=2.865～5.613，P<0.05；③與損傷組比較，t=16.397，P<0.01；④與MSCs組比較，t=18.322～20.308，P<0.01。圖3 6組細(xì)胞增殖水平比較①Compared with normal control group，t=15.452，19.763，P<0.01；② Compared with injury group，t=2.865-5.613，P<0.05；③ Compared with injury group，t=16.397，P<0.01；④ Compared with MSCs group，t=18.322-20.308，P<0.01.Fig.3 Comparison of the proliferation among six groups of cells

2.5PTX對(duì)高糖損傷內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 凋亡檢測(cè)結(jié)果見圖4，與正常對(duì)照組比較，高糖刺激48 h后的損傷組細(xì)胞凋亡增加。與損傷組比較，MSCs組、MSCs+0.1 mmol·L-1PTX組、MSCs+0.3 mmol·L-1PTX組和MSCs+1 mmol·L-1PTX組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少，而且呈現(xiàn)PTX濃度依賴性。

圖4 6組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig.4 Apoptosis detection of six groups of glomerular endothelial cells

2.6各組內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，損傷組ET、vWF及ICAM-1蛋白水平均顯著升高(均P<0.01)。與損傷組比較，MSCs組和PTX干預(yù)的各MSCs組高糖誘導(dǎo)的損傷內(nèi)皮細(xì)胞的ET、vWF和ICAM-1蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05或P<0.01)。與MSCs組比較，不同濃度PTX干預(yù)后的MSCs組的ET、vWF和ICAM-1蛋白表達(dá)水平都有所下降，MSCs+1 mmol·L-1PTX組顯著下降(P<0.01)，呈現(xiàn)PTX濃度依賴性(圖5)。

1.正常對(duì)照組；2.損傷組；3.MSCs組；4.MSCs+0.1 mmol·L-1 PTX組；5.MSCs+0.3 mmol·L-1 PTX組；6.MSCs+1 mmol·L-1 PTX組。①與正常對(duì)照組比較， t=20.487，16.735，24.582，P<0.01；②與損傷組比較，t=12.997～22.489，P<0.01；③與MSCs組比較，t=10.481～32.067，P<0.01。圖5 6組內(nèi)皮細(xì)胞ET、vWF、ICAM-1蛋白表達(dá)比較1.normal control group；2.injury group；3.MSCs group；4.MSCs+0.1 mmol·L-1 PTX group；5.MSCs+0.3 mmol·L-1 PTX group；6.MSCs+1 mmol·L-1 PTX group.①Compared with normal control group，t=20.487，16.735，24.582，P<0.01；② Compared with injury group，t=12.997-22.489，P<0.01；③Compared with MSCs group，t=10.481-32.067，P<0.01.Fig.5 Comparison of the protein expression of ET，vWF and ICAM-1 among six groups of endothelial cells

3 討論

DN是糖尿病的高糖環(huán)境導(dǎo)致腎臟微血管發(fā)生的病變，最終可能發(fā)展為終末期腎衰竭[12]。DN是西方發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的首要原因[13]，也成為我國(guó)患者進(jìn)行腎衰竭血液透析的第二大原因，是糖尿病患者死亡的主要原因之一，具有高發(fā)病率、無特異性治療及預(yù)后不良等特點(diǎn)[14]。糖尿病患者的腎小球選擇性濾過能力逐漸喪失，是西方發(fā)達(dá)國(guó)家的糖尿病演變?yōu)镋SRD的最常見原因[15]。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表面的窗孔是腎小球過濾屏障的重要成分，維持其結(jié)構(gòu)和功能完好是腎小球正常過濾的基礎(chǔ)。但是，糖尿病患者長(zhǎng)期的高血糖微環(huán)境會(huì)造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響腎小球過濾系統(tǒng)的正常生理功能，這也是糖尿病患者出現(xiàn)蛋白尿癥狀的原因。

MSCs是一種成體干細(xì)胞，最初發(fā)現(xiàn)于骨髓中，具有多向分化的潛能。而且，MSCs能夠?qū)κ軗p細(xì)胞、組織及器官進(jìn)行修復(fù)，如修復(fù)心肌梗死部位的心肌細(xì)胞[16]，恢復(fù)腦外傷導(dǎo)致的腦神經(jīng)功能受損[17]。PTX具有擴(kuò)張微血管、抑制血小板聚集以及降低蛋白尿排泄等作用，還能緩解炎癥反應(yīng)，減輕機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)[18-19]。本研究基于高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察PTX對(duì)MSCs修復(fù)糖尿病腎病腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。檢測(cè)PTX對(duì)MSCs和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示濃度<1 mmol·L-1的PTX對(duì)細(xì)胞的毒性作用較小，因此采用≤1 mmol·L-1的濃度(0.1，0.3和1 mmol·L-1)干預(yù)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的活力受到抑制，細(xì)胞凋亡增加[20-21]。本研究顯示，MSCs對(duì)受損的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞具有促增殖、抑凋亡作用，而PTX干預(yù)后，促進(jìn)了MSCs的作用。

ET是一種具有持久收縮血管、調(diào)節(jié)血流的內(nèi)皮縮血管肽，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到外源性或內(nèi)源性物質(zhì)刺激時(shí)，ET會(huì)異常表達(dá)，大量釋放[22]。vWF是一種黏附性多聚糖蛋白，是內(nèi)皮細(xì)胞生成的促凝因子，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，vWF會(huì)大量合成并釋放，是重要的內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物[23]。ICAM-1是一種細(xì)胞間黏附分子，王靜等[24]研究發(fā)現(xiàn)在脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中，ICAM-1、vWF等因子含量明顯高于正常內(nèi)皮細(xì)胞。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，高糖誘導(dǎo)的腎小球損傷內(nèi)皮細(xì)胞的損傷分子標(biāo)志物ET、vWF及ICAM-1蛋白表達(dá)量明顯升高，與文獻(xiàn)[24]報(bào)道一致。而與損傷組相比，MSCs組和PTX干預(yù)的MSCs組均降低了高糖刺激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷標(biāo)志物表達(dá)量，尤其是PTX干預(yù)后的MSCs組各損傷標(biāo)志物蛋白表達(dá)量顯著降低。

綜上所述，PTX可在一定程度上促進(jìn)MSCs對(duì)糖尿病腎病小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡抑制及損傷修復(fù)作用，并在小劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度依賴性，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。