安靜，萬江陵，楊祥良，李子福

(1.華中科技大學生命科學與技術(shù)學院，武漢 430074；2.國家納米藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430074)

隨著納米技術(shù)的蓬勃發(fā)展，一系列納米藥物輸送系統(tǒng)(nano drug delivery system，NDDS)被開發(fā)出來[1]?；谟袡C和無機納米材料的獨特理化性質(zhì)，結(jié)合化學治療(化療)、光熱治療、放射治療、基因治療、細胞治療和免疫療法等開發(fā)診療納米藥物的研究報道層出不窮[2]。這些納米藥物有生物穩(wěn)定性高、靶向性強、血液循環(huán)半衰期長、高效、低毒的優(yōu)勢[3]。其中，抗腫瘤納米藥物主要依靠高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)靶向腫瘤部位，但研究顯示過去開發(fā)的納米藥物腫瘤靶向效率的中位數(shù)僅為0.7%[4]，并且進入腫瘤部位僅僅是藥物輸送的第一步，納米粒運載的藥物在病灶及時有效地釋放也是其起到治療效果的關(guān)鍵[5]。根據(jù)生物標志物、受體和腫瘤微環(huán)境構(gòu)建的刺激響應型智能抗腫瘤納米藥物，通過主動靶向遞藥和刺激響應釋放產(chǎn)生顯著的抗癌療效、降低藥物的副作用，用于癌癥的精確治療，是“改良”版納米藥物，更具臨床轉(zhuǎn)化潛力。這些智能納米藥物對腫瘤外部或內(nèi)部的刺激具有反應能力，有可激活的成像信號或受激活后釋放藥物的特性，相比普通診療納米藥物，成像對比度或治療效果增強。光、溫度、超聲波或磁場等外源性刺激一般被用來觸發(fā)納米藥物的響應性變化，而缺氧、細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、酸性pH、過表達的受體或酶、細胞內(nèi)變化的三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)或谷胱甘肽(glutathione，GSH)等內(nèi)源性刺激可提高藥物的腫瘤靶向和在腫瘤微環(huán)境中的釋藥[1]。這樣的智能納米藥物是抗腫瘤納米藥物未來的發(fā)展趨勢，當刺激存在時，納米藥物結(jié)構(gòu)或理化性質(zhì)變化，釋放出藥物，產(chǎn)生細胞毒性。其中，人體內(nèi)的酶異常表達和活性失調(diào)是許多疾病的病理學基礎，失調(diào)的酶在腫瘤診療中非常有價值，可通過檢測酶診斷疾病，抑制酶的表達來治療疾病。內(nèi)源性酶也可作為刺激響應型智能納米藥物的生物觸發(fā)器，是近年來智能納米藥物的研究熱點，許多抗腫瘤療效顯著的酶響應納米藥物已被開發(fā)出來。筆者在本文綜述近年來酶響應納米藥物的研究進展，圍繞其設計原理和治療效果展開討論，并對酶響應納米藥物的臨床轉(zhuǎn)化面臨的機遇與挑戰(zhàn)進行展望。

1 酶響應納米藥物概述

1.1酶催化作用的特點 酶是由活細胞產(chǎn)生的生物催化劑，幾乎參與生物體內(nèi)所有生化代謝過程[6]，它對底物種類和結(jié)構(gòu)要求嚴格，具有高度的特異性，催化功能依賴于自身完整結(jié)構(gòu)。由于酶的作用，生物體內(nèi)的化學反應在極為溫和的條件下也能高效地進行。若因遺傳缺陷或其他原因造成酶的活性異常，常常引發(fā)物質(zhì)代謝紊亂，甚至發(fā)生疾病，多種癌癥的發(fā)生都伴隨著酶異常表達。

1.2酶響應納米藥物的設計原理 酶響應納米藥物的一般設計原理為：酶底物片段通過共價鍵、疏水作用或靜電作用等與納米材料偶聯(lián)，賦予納米載體酶敏感的特性，該納米載體包封治療劑或造影劑，入血后依靠EPR效應進入腫瘤組織，暴露于高濃度的酶并引發(fā)結(jié)構(gòu)改變，通過納米載體解組裝或偶聯(lián)鍵斷裂釋放藥物，從而提高治療效果或增強成像作用。

1.3酶響應納米藥物的獨特優(yōu)勢 相比于其他類型的刺激響應性納米藥物，酶響應的診療納米藥物具有以下優(yōu)點：①酶是內(nèi)源性物質(zhì)，不需要外加磁場、超聲波或光等，具有內(nèi)在生物相容性和生物安全性的優(yōu)點；②酶促反應反應迅速，反應條件溫和(體溫、溫和pH、水溶液)；③酶對底物有選擇性，避免藥物非特異靶向和釋藥[7-8]；④酶在腫瘤發(fā)展的不同時期表達水平不同，可根據(jù)患者腫瘤部位的酶水平個性化給藥，實現(xiàn)腫瘤個性化精準治療；⑤一些酶對底物要求不嚴格，允許有一定變化空間，例如蛋白酶底物肽可改變N端或C端氨基酸殘基，這樣允許肽段偶聯(lián)不同的納米材料。

2 病灶部位異常表達的酶

在多種癌癥中，腫瘤組織的細胞間質(zhì)或細胞內(nèi)往往出現(xiàn)酶的異常表達，它們是癌癥的治療靶點，例如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、組織蛋白酶B、透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HAase)、分泌性磷脂酶A2(secreted phospholipase A2，sPLA2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、前列腺抗原(prostate specific antigen，PSA)、氧化還原酶、α-淀粉酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-glutamyl transpep tidase，GGT)，這些酶的表達水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.1MMPs的病理特點 MMPs在多種重大疾病(如惡性腫瘤、心血管疾病以及關(guān)節(jié)炎等)表達異常，尤其在腫瘤的發(fā)展過程中大量表達。MMPs通過降解ECM使腫瘤細胞侵襲臨近正常組織，同時，ECM的改變釋放出隔離的生長因子，或產(chǎn)生生物活性片段促進腫瘤生長，例如，MMP-9降解ECM釋放血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，并切割IV型膠原生成血管生成抑制劑腫瘤抑素(tumstatin)[9]。因此，MMPs激活釋藥的抗腫瘤納米藥物有望抑制腫瘤惡化發(fā)展。人類基因組有24個MMP基因，表達23種MMPs，它在生理狀況下主要功能是降解ECM，調(diào)節(jié)細胞與細胞、細胞與ECM的相互作用，重塑基質(zhì)結(jié)構(gòu)；MMPs也能影響生長因子和細胞表面信號分子的功能，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡。其中， MMP-2和MMP-9在乳腺癌、直腸癌、胰腺癌和肺癌的腫瘤部位過表達；MMP-3在乳腺癌的腫瘤部位過表達，促使乳腺癌的發(fā)生發(fā)展；MMP-12在鱗狀細胞癌的腫瘤組織過表達，與腫瘤浸潤有關(guān)；MMP-12、MMP-13在肺癌的腫瘤部位過表達[10]。

2.2組織蛋白酶B的病理特點 組織蛋白酶B是惡性腫瘤的關(guān)鍵生物標志物，它是目前研究最為透徹的溶酶體酶之一[11-12]，臨床發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥的細胞內(nèi)高水平表達。因此，利用組織蛋白酶B激活釋藥的抗腫瘤藥物有望用于多種惡性腫瘤治療。組織蛋白酶B屬于木瓜蛋白酶家族，定位在溶酶體或內(nèi)質(zhì)體。其可與半胱氨酸蛋白酶抑制劑和膜聯(lián)蛋白II四聚體相互作用，降解IV型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白，改變ECM結(jié)構(gòu)，促使細胞遷移。組織蛋白酶B還能影響MMPs、纖溶酶和尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinasetype plasminogen activator，uPA)的活性。

2.3HAase的病理特點 HAase在多種癌癥(如膀胱癌、前列腺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌)表達水平升高，它能將高分子量透明質(zhì)酸(hyaluronan，HA)降解為低分子量的HA片段，這些低分子量HA片段刺激內(nèi)皮細胞增殖、粘附和遷移，促進腫瘤血管生成。其中HYAL1亞型是主要的腫瘤內(nèi)源性HAase，惡性乳腺癌細胞、浸潤性導管癌組織和乳腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中HYAL1過表達，活性升高[13]。在應用中，腫瘤部位過表達的HAase水解HA，釋放以HA為載體的納米藥物。HA在膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌和結(jié)腸癌等多種癌癥中濃度升高，應用中HA可作為納米藥物的無毒載體、MSN的封端劑和抗腫瘤藥物靶點，它與CD44、CD168、透明質(zhì)酸內(nèi)吞受體，Toll樣受體-2 和Toll樣受體-4相互作用參與細胞增殖、轉(zhuǎn)移和組織水化，其中CD44是主要的作用受體。

2.4sPLA2的病理特點 sPLA2在前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等多種疾病中過表達，特別是在發(fā)展成高級別的轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤，sPLA2IIA的表達水平增加22倍。sPLA2被廣泛用于抗前列腺癌、抗乳腺癌藥物的開發(fā)。這種酶能水解磷脂sn-2位的酯基，釋放溶血磷脂和游離脂肪酸，由于其僅對磷脂形成的脂質(zhì)體囊泡有水解作用，而對磷脂單體不敏感，sPLA2響應性抗腫瘤藥物一般設計成脂質(zhì)體。生理狀況下sPLA2可降解膳食磷脂、防止細菌感染和花生四烯酸的產(chǎn)生，并且有抗病毒作用，是一種Ca2+依賴型磷酯酶[14-15]。

2.5ALP的病理特點 ALP主要由肝臟合成，幾乎分布于機體所有組織中，但血液含量通常很低，在一些病理狀態(tài)，包括骨惡性腫瘤、惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移、肝硬化、肝癌，血清ALP升高[16]。ALP是乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的常見生物標志物[17-18]，臨床用于腫瘤骨轉(zhuǎn)移的篩查。ALP在骨肉瘤表達升高，可用于開發(fā)ALP響應抗骨肉瘤納米藥物。ALP的主要作用是使蛋白質(zhì)、核苷酸和生物堿去磷酸化，是一組同工酶。

2.6PSA的病理特點 PSA在前列腺組織選擇性表達，在前列腺腫瘤中，PSA的水平相對于非病變前列腺組織顯著升高，高水平的PSA易滲漏到血清，因此PSA是一種臨床上診斷前列腺癌的血清標志物。前列腺癌患者的PSA僅在前列腺有酶活性，而在其他正常組織均無PSA活性，因此，PSA適合用于設計前列腺靶向藥物。此外，血清中的PSA無酶活性，并與血漿蛋白酶抑制劑a1抗糜蛋白酶和a2微球蛋白形成復合物，這避免了PSA響應納米藥物在體循環(huán)中提前釋藥[19]。

2.7氧化還原酶的病理特點 氧化還原酶被用于許多載藥系統(tǒng)和生物傳感器的設計中，這是由于一些疾病(如癌癥、糖尿病等)與高水平的氧化還原酶表達相關(guān)。其中賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)和NAD(P)H：醌氧化還原酶1[NAD(P)H：quinone oxidoreductase 1，NQO1]在多種腫瘤中的濃度明顯升高。

LOX是一種調(diào)控腫瘤基質(zhì)的酶，通過催化膠原和彈性蛋白交聯(lián)增加ECM硬度[20]，乳腺癌中的LOX促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。LOX與多種癌癥的惡化發(fā)展有關(guān)。

NQO1與癌癥密切相關(guān)，在胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、腎癌和卵巢癌等多種癌癥的腫瘤細胞中上調(diào)，其水平比正常組織高50倍[21]，能催化醌類物質(zhì)的雙電子還原反應，是研究中常用的腫瘤治療靶點。

2.8α-淀粉酶的病理特點 在乳腺、卵巢和肺等腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)α-淀粉酶水平顯著升高，尤其在乳腺腫瘤，α-淀粉酶的水平比正常組織高85倍[22]，它能水解多糖類藥物載體。α-淀粉酶也存在于正常血液中，分解多糖和糖原，它能專一性斷裂α-1，4-葡萄糖苷鍵。

2.9GGT 的病理特點 GGT 是一種膜結(jié)合酶，分布于肝、腎、胰腺等分泌活性高的臟器中，在腎細胞癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌和結(jié)直腸癌的腫瘤部位大量表達，高水平表達GGT的癌癥預后不良。GGT參與GSH的代謝，在 GSH 代謝期間產(chǎn)生額外的ROS，而ROS 涉及調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和凋亡的生物反應[23]。在腫瘤細胞中過表達的GGT導致 ROS 的連續(xù)產(chǎn)生，促進腫瘤細胞的增殖及侵襲。

與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的酶是癌癥的診斷指標和治療靶點，腫瘤的分布和惡化程度可以依酶的活性判斷，例如ALP、PSA用于腫瘤診斷和預后，抑制LOX表達可以抑制腫瘤惡化。腫瘤部位異常的酶見表1。

表1 腫瘤部位表達異常的酶Tab.1 Abnormally expressed enzyme in tumor region

腫瘤部位異常的酶通常被設計為激發(fā)酶響應納米藥物釋藥的生物分子，一些在多種癌癥廣泛表達的酶，如MMPs和組織蛋白酶B，可用來設計廣譜抗癌藥；一些僅在一種腫瘤過表達的酶，如PSA，可以設計為該種癌癥的專一性藥物；一些酶可直接裂解納米載體，如HAase裂解HA、sPLA2裂解脂質(zhì)體和蛋白酶裂解自組裝肽載體。因此，由于酶的特殊性能，酶響應納米藥物具有非常高的臨床轉(zhuǎn)化價值。

3 酶響應納米藥物

疾病的病灶部位(如惡性腫瘤)中過表達的酶常用來進行疾病的診斷和預后，在研究中這些酶也被用于診療納米藥物的設計開發(fā)，例如MMPs、組織蛋白酶B、HAase等被用來設計酶響應藥物，從而對腫瘤進行精準治療。

3.1MMPs響應納米藥物

3.1.1MMPs響應納米藥物的設計原理與特點 MMPs響應納米藥物可以解決化療藥物生物利用度低的問題。例如姜黃素(curcumin，Cur)能抗癌、抗炎、抗氧化和清除自由基，其中對肺癌的治療效果最佳，但它有水溶性差、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和生物膜通透性低的問題。GUO等[24]將mPEG與MMP-2底物肽和藥物載體聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)連接合成mPEG-肽-PCL三元復合物，其能在緩沖液中自發(fā)形成包被Cur的單分散納米粒Cur-P-NPs，經(jīng)MMP-2作用后，在pH值=6.5時釋藥率達72.85%。體內(nèi)實驗中，實時熒光成像顯示Cur-P-NPs富集在小鼠肺腫瘤部位，表明Cur-P-NPs增強Cur的靶向性和穿透性，延長循環(huán)時間，提高對肺腫瘤的抑制作用。多柔比星(doxorubicin，DOX)也是一類脂溶性化療藥物，直接服用容易產(chǎn)生心臟毒性。CAO等[25]合成了MMP-7響應的肽序列Nap-FFGPLGLARKRK，它在緩沖液中聚集，自組裝成表面親水、內(nèi)核疏水的納米纖維，粒徑為7.0 nm，內(nèi)部運載DOX，當加入MMP-7時，肽纖維迅速裂解釋放DOX，粒徑減小為3.0 nm，90 min內(nèi)釋藥率最高可達80%。自組裝肽有毒性低、易降解的優(yōu)點，但釋藥時DOX容易吸附在肽段的疏水結(jié)構(gòu)域，影響釋藥效率，因此需對肽段組成進一步優(yōu)化。LIU等[26]以生物相容性良好的介孔二氧化硅納米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)為載體，MMPs底物肽連接MSNs與牛血清白蛋白(bovine serumalbumin，BSA)來封堵MSNs的孔道，制成MMPs響應MSNs運載鹽酸DOX。實驗中用MMP-13水解MSNs，8 h時釋藥率達57.9%。該載藥系統(tǒng)對小鼠腫瘤抑制明顯，且對內(nèi)臟器官無明顯毒副作用，有治療過表達MMPs腫瘤的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

酶響應納米藥物中的酶底物部分可根據(jù)酶對底物結(jié)構(gòu)的“偏好”進行優(yōu)化，從而加快酶作用釋藥。SARKAR等[27]將MMP-9底物肽與硬脂酸共價連接來合成脂肽，它能形成類膠原三螺旋，易被IV型膠原酶類MMP-9水解，硬脂酸鏈能增強螺旋程度，并使脂肽插入脂質(zhì)體中。該課題組將羧基熒光素包裹入脂質(zhì)體，加入MMP-9后，依熒光強度判斷出脂質(zhì)體迅速裂解。以納米脂質(zhì)體為載體有生物相容性、低毒性和弱免疫原性的優(yōu)點，其能提高運載藥物的穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時間，降低血漿清除率[28-30]，但該課題組制成的脂質(zhì)體載體面臨體循環(huán)中藥物的包裹是否穩(wěn)定、暴露于表面的肽與血液分子的相互作用是否會屏蔽MMP-9的裂解位點、體內(nèi)pH、溫度和離子強度的變化是否會引起肽螺旋松弛，而被其他種酶裂解造成非特異性釋藥等問題，這些問題是臨床使用的障礙，若對其改造，有望用于化療藥物或造影劑的輸送。

3.1.2MMPs響應納米藥物可用于基因治療 腫瘤的基因治療是將治療性基因插入質(zhì)粒(pDNA)，經(jīng)載體導入癌細胞，達到阻止癌細胞生長、轉(zhuǎn)移、復發(fā)的目的。VEIMAN等[31]利用細胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP) 運送pDNA至細胞內(nèi)，其中親水改性的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)可被MMP-2作用后斷裂。該藥物最大的優(yōu)點在于可根據(jù)患者癌癥部位的實際MMPs濃度，設計不同長度PEG鏈的納米藥物。KOGURE等[32]制成了一種用于基因治療的的多功能納米載體(multifunctional envelope-type nano device，MEND)，它是一種PEG化脂質(zhì)體。在臨床使用中，PEG化脂質(zhì)體(隱形脂質(zhì)體)能避免血清蛋白識別和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticulo-endothelial system，RES)攝取，且PEG的空間位阻作用能避免脂質(zhì)體聚集，從而增強脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，循環(huán)半衰期能延長至9～16 h[33]，但隱形脂質(zhì)體常常面臨“PEG窘境”，即PEG鏈影響靶細胞對脂質(zhì)體的攝取、妨礙脂質(zhì)體的核內(nèi)體逃逸，為解決此問題，該課題組對MEND進行優(yōu)化，加入PEG-MMP-2底物肽——二元醇磷脂酰乙醇胺(DOPE)三元復合物(PPD)[34]，使MEND在高濃度MMP-2的腫瘤間質(zhì)斷裂底物肽段釋放PEG。由于MMP-2底物肽與脂質(zhì)的相互作用影響PEG的靈活性，從而影響脂質(zhì)體長循環(huán)，他們用PEG-二硬脂?；字Ｒ掖及?PEG-DSPE)部分取代PPD，并保持PEG修飾脂質(zhì)的量固定在總脂質(zhì)的15%，從而平衡了該納米脂質(zhì)體長血液循環(huán)和有效細胞轉(zhuǎn)染的需求。

3.1.3MMPs響應納米藥物可用于細胞治療 細胞治療是將基因工程細胞或干細胞等治療性細胞注射進患者體內(nèi)，來替換、修復或增強受損組織或病變器官的療法，但細胞注射時剪切應力和體循環(huán)過程中免疫排斥使細胞治療面臨挑戰(zhàn)。YANG等[35]將PEG化的陽離子和陰離子明膠在靜電作用下，通過層層自組裝方法(layer-by-layer self-assembly，LBL)包裹在細胞表面，形成多層均勻明膠，將MMP-7的肽底物序列中Cys殘基與PEG化的馬來酰亞胺經(jīng)點擊反應連接，加固明膠層。用此方法合成聚合物納米殼，能使被包埋細胞長時間保持活性，并能抵抗外力和血液循環(huán)時的免疫作用。該策略使治療性細胞在過表達MMP-7腫瘤組織原位釋放，一定程度上解決細胞治療中細胞穩(wěn)定性問題。

MMPs一般裂解Gly殘基與Leu殘基或Iie殘基間的肽鍵[27]，因此其底物肽的氨基酸組成和肽鏈長度有一定變化空間，可靈活選擇與底物肽偶聯(lián)的載體。大多數(shù)報道的MMPs響應納米藥物常利用MMP-2與MMP-9。許多遞藥系統(tǒng)修飾PEG以實現(xiàn)長循環(huán)，但PEG長期服用引起細胞毒性和免疫反應，因此，MMPs響應抗腫瘤納米藥物在臨床轉(zhuǎn)化中需要優(yōu)化載體。另外，雖然MMPs在多種腫瘤間質(zhì)過表達，但患者腫瘤部位的MMPs依癌癥類型和時期出現(xiàn)變化，用藥時需對藥物的設計策略進行調(diào)整。綜合來看，MMPs是一種非常有價值的癌癥治療靶點，MMPs響應納米藥物有潛力開發(fā)為廣譜抗腫瘤藥物。

3.2組織蛋白酶B響應的納米藥物

3.2.1組織蛋白酶B響應納米藥物的設計原理與特點 組織蛋白酶B響應納米藥物可以以腫瘤間質(zhì)為治療位點。LEE等[36]設計了組織蛋白酶B響應藥物ATF-IONP-Gem，其中抗胰腺腫瘤的化療藥物吉西他濱(gemcitabine，Gem)與氧化鐵納米粒(iron oxide nanoparticles，IONP)經(jīng)組織蛋白酶B的底物肽連接，uPA通過N端序列ATF也連接在IONP上。uPA能靶向腫瘤細胞和腫瘤間質(zhì)成纖維細胞表面的高濃度uPA受體(uPAR)。該納米藥物經(jīng)注射后能高水平富集在胰腺腫瘤，由uPAR介導進入細胞，破壞腫瘤間質(zhì)細胞，從而提高化療藥物在實體瘤中的滲透率，增強治療效果。體內(nèi)實驗顯示ATF-IONP-Gem對人胰腺癌移植瘤小鼠的抑瘤率(50%)高于Gem單獨的抑瘤率(30%)，另外，它能增強磁共振成像(MRI)信號，可檢測藥物輸送、治療效果和耐藥性。組織蛋白酶B響應納米藥物也可用MSNs作載體，CHENG等[37]制成了納米MSNs輸送DOX，其中烷氧基硅烷化合物和α-環(huán)糊精(α-CD)形成的輪烷結(jié)構(gòu)封堵MSNs孔道，組織蛋白酶B的底物肽修飾輪烷結(jié)構(gòu)末端加固密封。MSNs進入腫瘤細胞后，經(jīng)組織蛋白酶B破壞封堵結(jié)構(gòu)，釋放DOX。細胞實驗中納米MSNs的24 h釋藥率達80%，顯示出較高的細胞毒性和抑瘤作用。

3.2.2組織蛋白酶B響應納米藥物可用于光動力治療(photodynamic treatment，PDT) PDT是一種非常有前景的微創(chuàng)療法，它利用光敏劑受激光照射后可產(chǎn)生活性氧不可逆地殺死腫瘤細胞來進行抗腫瘤治療。AI等[38]制成了用于PDT的上轉(zhuǎn)換納米粒(Upconversion nanoparticles，CRUNs)，它以摻雜La系Nd3+的上轉(zhuǎn)換納米結(jié)晶為核心，外部連接聚丙烯酸、聚乙烯亞胺、細胞毒性光敏劑二氫卟吩(chlorin e6，Ce6)、PEG和組織蛋白酶B的底物肽序列Ac-FKC(StBu)AC(SH)-CBT。瘤內(nèi)注射CRUNs，進入腫瘤細胞的CRUNs經(jīng)組織蛋白酶B水解表面肽段，暴露出Cys殘基，它與周圍CRUNs的表面肽段的CBT基團共價縮合，引發(fā)CRUNs的共價交聯(lián)。在波長為808 nm的近紅外光照射下，這種酶引發(fā)的CRUNs交聯(lián)增強光的上轉(zhuǎn)換，發(fā)射更強的可見光，放大可見光對Ce6的激活作用，從而使Ce6產(chǎn)生更多的細胞毒性單線態(tài)氧(1O2)，增強PDT效果。波長808 nm激光的組織穿透性強，可用于追蹤藥物的體內(nèi)位置，或判斷PDT治療效果。臨床上可將這種CRUNs與其他療法聯(lián)合使用，從而對組織蛋白酶B過表達的腫瘤進行診療。

組織蛋白酶B在多種癌癥的腫瘤細胞內(nèi)過表達，響應該酶的納米藥物適用于治療多種癌癥。但由于其為胞內(nèi)酶，納米載體需進入細胞才能釋放藥物，借助腫瘤細胞表面受體介導的內(nèi)吞作用是一種提高療效的方法。組織蛋白酶B響應納米藥物相比胞外酶響應藥物，只在細胞內(nèi)產(chǎn)生毒性，減少藥物在局部環(huán)境中釋放的毒副作用，是一種非常有價值的治療靶點，因此，運載胞內(nèi)作用的抗腫瘤藥物(如DOX)的納米載體常被設計為組織蛋白酶B響應性納米藥物。

3.3HAase響應納米藥物

3.3.1HAase響應納米藥物的設計原理與特點 HAase響應納米藥物可以提高抗腫瘤藥物氟尿嘧啶(fluorouracil，F(xiàn)u)的生物利用度。Fu是一種嘧啶類似物，是治療乳腺癌、膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)腸癌等多種癌癥的廣譜抗癌藥物，它主要作用于胸苷酸合成酶，干擾DNA合成[39]；但該藥物存在嚴重系統(tǒng)毒性，且血漿半衰期短。JIANG等[40]合成了運載Fu的HAase響應MSNs(HA/FMSN)用HA作為MSNs的封端結(jié)構(gòu)，腫瘤細胞表面高濃度CD44與HA結(jié)合，介導HA/FMSN內(nèi)吞。細胞實驗測得HA/FMSN的IC50值(1.08 μg·mL-1)遠小于游離Fu(6.89 μg·mL-1)，對結(jié)腸癌移植瘤小鼠的抑瘤效果是游離Fu的3倍，顯著提高了Fu的治療效果，大大降低系統(tǒng)毒性。HAase響應納米藥物也被設計成雙載體雙靶向來提高抗腫瘤效果。JIANG等[41]設計了聯(lián)合遞藥系統(tǒng)Gelipo，其包含脂質(zhì)體內(nèi)核和HA交聯(lián)外殼，脂質(zhì)體表面嵌有陽離子CPP，內(nèi)部攜帶DOX，HA包裹脂質(zhì)體，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體TRAIL在HA與脂質(zhì)體之間的腔內(nèi)。Gelipo入血后通過EPR效應和靶向CD44作用聚集在腫瘤，經(jīng)高濃度的HAase水解HA交聯(lián)外殼，釋放TRAIL，它與死亡受體DR4、DR5結(jié)合引發(fā)Caspase級聯(lián)反應誘導細胞凋亡；釋放的脂質(zhì)體經(jīng)CPP介導進入細胞，釋放DOX引發(fā)腫瘤細胞死亡。運載TRAIL和DOX的 Gelipo細胞毒性比僅運載DOX的Gelipo高5.9倍，對乳腺癌移植瘤小鼠也表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果。Gelipo能實現(xiàn)順序和位置特異性遞藥(sequential and site-specific delivery，SSSD)，具有極高的抗癌療效和低系統(tǒng)毒性，有臨床轉(zhuǎn)化潛力，并且可依癌癥類型改變Gelipo的表面配體分子，從而用于多種癌癥治療。

3.3.2HAase響應納米藥物可以用來監(jiān)控藥物釋放行為 ZHENG等[42]制成一種近紅外光雙發(fā)光納米載體，該載體以上轉(zhuǎn)換納米粒子UCNPs為核心(US)(λem=660 nm，λex=980 nm)，大孔二氧化硅(macroporous silica，DS)包裹細胞毒性細胞色素C蛋白(Cyt C)和US，外部用交聯(lián)HA層包裹保護，并命名Cyt C-US@DS@HA。DS摻雜有熒光染料(λem=710 nm，λex=660 nm)，其吸收光譜與US發(fā)射光譜重疊。注射該藥物后，在血清中DS與US因熒光淬滅而不發(fā)出熒光，當進入腫瘤組織后，HAase降解HA，釋放Cyt C和US，在980 nm外源光照射下，US的上轉(zhuǎn)換發(fā)光使DS發(fā)出熒光，通過檢測波長710 nm熒光可監(jiān)測藥物釋放。該納米藥物輸送系統(tǒng)可實時監(jiān)測藥物的輸送，這對于優(yōu)化納米藥物的設計和研究藥物輸送途徑有重要價值。

靶向HAase的載藥系統(tǒng)往往以HA作為載體，HA有天然無毒、能靶向腫瘤細胞表面CD44受體的優(yōu)勢。多種癌癥的腫瘤組織中高水平的HAase水解HA，使HAase響應納米藥物原位釋物，但HAase水解納米載體HA產(chǎn)生的小分子HA片段可能會促進腫瘤惡化，以HA為載體的HAase響應納米藥物還需要進一步研究和優(yōu)化。

3.4sPLA2響應納米藥物

3.4.1sPLA2響應納米藥物的設計原理與特點 sPLA2響應脂質(zhì)體比空間穩(wěn)定脂質(zhì)體(sterically stabilized liposomes，SSL)的載藥性能更好。1995年美國食品藥品管理局(FDA)首次批準的納米藥物脂質(zhì)體DOXIL?可治療晚期卵巢癌、多發(fā)性骨髓癌以及艾滋病并發(fā)的卡波西肉瘤，但其臨床使用中釋藥緩慢，MOCK等[43]制成運載DOX的sPLA2響應脂質(zhì)體SPRL，并將它們與運載DOX的SSL(類似DOXIL)比較，發(fā)現(xiàn)SPRL的DOX細胞攝取量是SSL1.5～2倍，對人前列腺移植瘤模型，SPRL比SSL輸送藥物效率高，抑瘤效果明顯好于SSL，有望用于前列腺癌和其他sPLA2過表達腫瘤治療。由于SPRL與臨床使用的SSL僅存在10%DSPE的差異，而且DSPE是一種大量存在細胞膜的天然磷脂，因此，SPRL有望成為臨床使用的脂質(zhì)體的組成成分。

酶響應脂質(zhì)體易出現(xiàn)脂質(zhì)體酶解和藥物釋放不同步的現(xiàn)象，且脂質(zhì)體常面臨藥物泄露問題[44]。將帶有羧酸基團的親脂性抗癌藥共價連接在磷脂的sn-2位，合成前藥，再以這種前藥制成脂質(zhì)體，在sPLA2水解后釋放抗癌藥物和細胞毒性的溶血磷脂[即抗癌醚脂(antitumor ether lipids，AELs)]，能解決上述問題。PEDERSEN等[45]將抗腫瘤藥物苯丁酸氮芥共價連接到不同磷脂的sn-2位上，發(fā)現(xiàn)帶有負電荷磷脂酰甘油頭基、sn-1位為C16酯鏈的苯丁酸氮芥磷脂前藥，可在緩沖液中形成單分散單層囊泡(small unilaminar vesicles，SUVs)，粒徑為104 nm，在sPLA2水解后釋藥最快，2 h后粒徑<5 nm，細胞實驗中IC50值遠小于苯丁酸氮芥自身IC50值，說明苯丁酸氮芥與sPLA2水解產(chǎn)生的AELs協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。該課題組用同樣方法，分別制成了連接有抗結(jié)腸癌、前列腺癌以及乳腺癌功效的全反式維甲酸的脂質(zhì)體[46]和連接抗白血病的前列腺素的脂質(zhì)體[47]，這些脂質(zhì)體都有較好的sPLA2響應性和抑制腫瘤細胞生長作用。另外，藥物也可以連接在磷脂的sn-1位。LINDEROTH等[48]將辣椒素的羥基共價連接到甘油磷脂sn-1位上制成前藥，其在緩沖液中分散后能自發(fā)形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表面均勻的脂質(zhì)體囊泡，加入sPLA2IIA后，脂質(zhì)體的磷脂sn-2位酯基水解，產(chǎn)生的羥基與sn-1位酯基發(fā)生環(huán)化反應形成五元內(nèi)酯，釋放辣椒素，24 h釋藥率達到90%。該納米載藥輸送系統(tǒng)中磷脂經(jīng)酶解發(fā)生環(huán)化而釋藥的設計原理，對于開發(fā)sPLA2響應脂質(zhì)體有啟發(fā)作用。

3.4.2小結(jié) sPLA2響應納米載藥輸送系統(tǒng)的設計中，sPLA2IIA是最常用亞型，它對陰離子脂膜水解作用強，其他sPLA2亞型對陰離子脂膜和兩性脂膜均有水解作用[49]。sPLA2對酯鏈短、帶有負電荷磷脂酰甘油或磷脂酰乙醇胺基團的磷脂更敏感，在脂質(zhì)體中加入適當組分的該磷脂可提高釋藥效率。此外，介導sPLA2下調(diào)的sPLA2受體(PLA2R1)也介導sPLA2敏感脂質(zhì)體的細胞攝取[50]。sPLA2響應脂質(zhì)體具有高靶向性和良好的釋藥效率，其中直接共價連接脂溶性藥物的脂質(zhì)體在sPLA2作用后釋放藥物和AELS協(xié)同抗癌，療效更好，具有很高的臨床轉(zhuǎn)化潛力，但其局限于脂溶性化療藥物，可用藥物范圍還需進一步擴大。

3.5ALP響應納米藥物

3.5.1ALP響應納米藥物的設計原理與特點 ALP響應納米藥物可設計為以細胞器為治療靶點的納米藥物。WANG等[51]合成了ALP響應自組裝肽序列FFYK，其修飾有靶向線粒體基質(zhì)的三苯基膦(triphenylphosphine，TPP)，藥物進入細胞后定位在線粒體，使線粒體內(nèi)環(huán)境失衡釋放細胞色素C，激活caspase級聯(lián)反應導致癌細胞死亡。體內(nèi)試驗中，F(xiàn)FYK可選擇性殺死人骨肉瘤細胞(Saos2)，沒有ALP存在時，即使高濃度的FFYK依然不產(chǎn)生細胞毒性。該藥物是靶向腫瘤細胞器的藥物，相比其他靶點的藥物有最小的獲得耐藥性。

3.5.2ALP響應納米藥物可應用于光熱治療(photothermal therapy，PTT) PTT是一種利用光熱材料(photothermal agents，PTAs)轉(zhuǎn)換外部光源為高溫從而殺死腫瘤細胞的療法，有無創(chuàng)、精準和容易控制的特性。吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是一種FDA批準的染料，可作為光熱材料、光聲成像分子和熒光探針[52]。HUANG等[53]設計了ALP響應的PTT藥物，以短肽NapFFKYp為載體，肽經(jīng)ALP去磷酸化后能自組裝成納米纖維，用來輸送ICG。瘤內(nèi)注射ICG和NapFFKYp，肽經(jīng)高濃度ALP作用后自組裝，ICG經(jīng)頭-尾排列作用(J-aggregtes)被包裹進納米纖維，聚集的ICG經(jīng)波長808 nm近紅外光照射后出現(xiàn)紅移，近紅外吸收增強，熱轉(zhuǎn)換也隨之增強，根據(jù)ICG發(fā)出的熒光可區(qū)分腫瘤組織和非腫瘤組織。體內(nèi)實驗中，注射4 h后，納米纖維ICG的腫瘤攝取量比游離ICG高25倍，腫瘤組織的藥物濃度是外周正常組織的15倍，納米纖維輸送ICG有效避免ICG被腎和脾的RES攝取。該藥物已在實驗中成功完全消除移植瘤小鼠的腫瘤，有改善光聲成像和增強PTT療效的作用，但使用時需要ICG與肽分別瘤內(nèi)注射，增加患者治療過程中的痛苦，且僅適用淺表層腫瘤。

自組裝肽在輸送抗腫瘤化療藥物方面極具臨床轉(zhuǎn)化潛力，許多研究中用ALP底物肽設計自組裝肽，經(jīng)ALP去磷酸化作用激發(fā)肽的自組裝。但ALP在正常組織廣泛存在，且許多非癌變因素也引起ALP的水平變化，因此ALP響應藥物經(jīng)常通過瘤內(nèi)注射使用。

3.6PSA響應納米藥物 PSA響應納米藥物的設計原理與特點：PSA響應納米藥物專一地用于治療前列腺腫瘤。前列腺癌生長緩慢、隱匿性強，轉(zhuǎn)移性前列腺癌的主要治療方法是抗雄激素療法，但它導致患者體內(nèi)雄激素劇烈下降，造成多系統(tǒng)失衡，若長期治療，副作用極大。環(huán)磷酰胺是一種烷基化抗腫瘤藥物，具有廣譜抗癌活性。 JIANG等[54]將PSA底物肽SSFY與4-氨基環(huán)磷酰胺分子連接，當加入PSA時迅速裂解釋藥，這樣的分子可作為酶激活的前體藥物，提高環(huán)磷酰胺生物利用度。雖然該藥物還處于研究初期，但它能大大降低環(huán)磷酰胺的治療劑量，有望成為治療前列腺癌的藥物。

前列腺特異性膜抗原(PSMA)也是前列腺癌治療靶點。XIANG等[55]制成了PSA和PSMA雙靶向脂質(zhì)體，脂質(zhì)體表面修飾葉酸(folic acid，F(xiàn)A)和PSA反應肽，F(xiàn)A可被前列腺腫瘤過表達的細胞膜糖蛋白PMSA識別結(jié)合，PSA反應肽包括陽離子CPP(聚Arg)、PSA底物結(jié)構(gòu)域(HSSKYQ)和屏蔽CPP的陰離子肽段(DGGDGGDGGDGG)，脂質(zhì)體內(nèi)負載沉默polo樣激酶1(PLK-1)基因的siRNA，該基因表達下調(diào)會使細胞凋亡。靜脈注射該藥物后，EPR效應和FA配體的靶向作用使藥物富集在前列腺腫瘤部位，高水平的PSA裂解PSA反應肽，去除聚陰離子結(jié)構(gòu)域的屏蔽作用，激活CPP結(jié)構(gòu)域，CPP和PMSA介導的內(nèi)吞作用協(xié)同使脂質(zhì)體進入細胞，誘導細胞凋亡。該合成策略用雙靶向原理提高脂質(zhì)體靶向特異性，在小鼠體內(nèi)療效顯著，提高抗前列腺癌療效。

PSA僅在前列腺特異性表達，且僅在前列腺有酶活性。前列腺癌專一性PSA控釋藥物大大降低藥物在其他部位的非特異靶向，提高藥物專一性治療的效率。

3.7氧化還原酶響應納米藥物

3.7.1LOX響應納米藥物的設計原理與特點 以LOX為靶向的納米藥物通過抑制LOX活性治療乳腺腫瘤。水溶性抗體LOXAB可抑制LOX活性，減緩腫瘤生長轉(zhuǎn)移，但治療劑量的LOXAB往往導致系統(tǒng)毒性，KANAPATHIPILLAI等[16]制成納米藥物LOXABNPs，將LOXAB連接到聚乳酸-羥基乙酸-PEG(PLGA-b-PEG-COOH)納米共聚物表面，輸送LOXAB到腫瘤ECM的LOX，該藥物在乳腺移植瘤小鼠模型中抑瘤作用顯著，有效劑量是游離LOXAB的1/50，且有不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點。

3.7.2NOQ1響應納米藥物的設計原理與特點 NOQ1響應納米藥物被用來提高化療藥物的生物利用度。GAYAM等[56]制成了NOQ1響應MSNs，MSNs表面用α-環(huán)糊精和二甘醇形成的輪烷結(jié)構(gòu)封堵，輪烷結(jié)構(gòu)外側(cè)連接苯醌，MSNs內(nèi)部負載DOX。腫瘤部位的高水平NOQ1催化苯醌還原為氫醌，使輪烷結(jié)構(gòu)的“鏈”自動斷開，釋放DOX。細胞實驗顯示，MSNs與細胞孵育4 h，加入NOQ1后釋藥迅速，體內(nèi)試驗中，負載DOX的MSN-NQO1第17天抑瘤明顯，遠好于DOX單獨的治療效果有一定臨床使用價值。

氧化還原酶在氧化應激中起著中心作用，是重要的治療靶點。除了化療，在抗腫瘤治療中，葡萄糖氧化酶也可用來進行腫瘤的饑餓療法[57]，同樣能產(chǎn)生高療效。因此，氧化還原酶是一類非常有價值的腫瘤治療靶點。

3.8α-淀粉酶響應納米藥物 α-淀粉酶響應納米藥物的設計原理與特點：α-淀粉酶響應納米藥物可用來輸送化療藥物。LI等[58]以羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)為載體，制成α-淀粉酶和GSH雙重響應的納米藥物HES-SS-PTX來輸送紫杉醇(paclitaxel，PTX)。靜脈注射后，血液中的α-淀粉酶水解 HES的糖苷鍵，HES-SS-PTX粒徑逐漸減小，這有利于其在腫瘤的深層穿透和富集，進入細胞后，細胞內(nèi)高濃度GSH斷裂二硫鍵，釋放出游離PTX。該藥物的抗腫瘤效果(63.6%)高于Taxol?(52.4%)，相比易引起超敏反應和神經(jīng)毒性的PTX類藥物Taxol和 Abraxane?，HES-SS-PTX毒副作用小，有很高的醫(yī)用價值。

α-淀粉酶響應納米藥物可通過抑制細胞增殖的信號通路來抑制腫瘤生長。磷脂酶A2(PLA2)是一種抗癌蛋白，通過與表皮生長因子受體(EGFR)作用抑制表皮生長因子EGF與EGFR的結(jié)合。FERGUSON等[59]用磷脂酶A2連接糊精制成納米藥物，使其活性降低36%，糊精在腫瘤組織中被高水平的α-淀粉酶降解，磷脂酶A2活性完全恢復，磷脂酶A2抑制細胞增殖，發(fā)揮抑瘤作用。這種納米藥物有抗乳腺癌作用，但長期服用可能產(chǎn)生耐藥。

α-淀粉酶在乳腺腫瘤中高水平表達，常被用來開發(fā)酶響應藥物治療乳腺癌。α-淀粉酶可降解HES、糊精、葡聚糖等天然多糖載體，適合作為酶響應抗腫瘤納米藥物的內(nèi)源刺激。

3.9GGT響應納米藥物 GGT響應納米藥物的設計原理與特點：GGT響應納米藥物能解決藥物在實體瘤中難以滲透擴散的問題。腫瘤組織的血管分布雜亂，腫瘤間質(zhì)和腫瘤細胞致密，瘤內(nèi)滲透壓高，導致僅依靠被動擴散的納米藥物難以滲透到血管遠端腫瘤細胞。ZHOU等[60]制成了運輸抗腫瘤藥物喜樹堿(camptothecin，CPT)的長循環(huán)納米共聚物，它由單體2-(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁胺)乙基丙烯酰胺(BEAGA)-CPT組成，其中CPT通過二硫鍵連接到BEAGA。在體循環(huán)中，聚2-(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁胺)乙基丙烯酰胺(PBEAGA)-CPT為電中性，到達腫瘤血管時，血管的管腔內(nèi)皮細胞表面密集的GGT作用脫去γ-谷氨酰胺，產(chǎn)生氨基，使共聚物表面陽離子化而吸附于內(nèi)皮細胞，進行吸附介導的跨細胞轉(zhuǎn)運(adsorption-mediated transcytosis，AMT)進入腫瘤間質(zhì)，也有一部分PBEAGA-CPT通過EPR效應滲入腫瘤，同時腫瘤細胞表面大量的GGT介導藥物進行AMT轉(zhuǎn)運，PBEAGA-CPT在相鄰細胞間內(nèi)吞和外排，從而相對均勻地分布在實體瘤，進入細胞的PBEAGA-CPT經(jīng)GSH斷裂二硫鍵釋放CPT。體內(nèi)試驗中，該藥物能消除50 mm3的大腫瘤，抑瘤率高達99%，它將藥物在瘤內(nèi)的運輸由被動擴散轉(zhuǎn)變?yōu)橹鲃訚B透，解決了EPR效應滲透率低的問題，克服了高壓導致藥物在瘤內(nèi)運輸難的障礙，具有非常高的臨床轉(zhuǎn)化價值。

GGT作用后的肽產(chǎn)生電荷翻轉(zhuǎn)，大大提高藥物進入細胞的效率，但依靠GGT介導藥物輸送易引起耐藥性，且不適合GGT異質(zhì)腫瘤，治療中可與其他療法結(jié)合。

酶響應納米藥物可結(jié)合多種療法，輸送不同種類的治療劑或成像劑，經(jīng)內(nèi)源性酶激活進行精準診療，是一種療效高、可塑性極強的載藥系統(tǒng)。酶響應納米藥物總結(jié)見表2。

表2 酶響應納米藥物的設計策略Tab.2 Design strategy of enzyme responsive nanomedicine

酶響應納米藥物降低了藥物副作用，有望實現(xiàn)腫瘤精準治療。sPLA2釋放共價連接磷脂藥物的設計策略中，納米脂質(zhì)體的水解產(chǎn)物AELs與化療藥物協(xié)同抗腫瘤，相比普通載藥系統(tǒng)，納米藥物釋藥迅速，抗腫瘤療效增強；依靠受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞的藥物，長期使用容易使受體下調(diào)產(chǎn)生耐藥，通過電荷翻轉(zhuǎn)來增加細胞對藥物的親和力是一種行之有效的方法；另外，腫瘤細胞表面GGT介導藥物跨細胞轉(zhuǎn)運的策略很大程度上解決了EPR效應介導藥物入瘤效率低和實體瘤滲透難的問題；對于載體，自組裝肽載體有低毒、易降解的優(yōu)點，具有很高的臨床應用價值。需注意的是，異質(zhì)性腫瘤的酶分布不均勻，不同微環(huán)境的治療效果出現(xiàn)差異，這是酶響應納米藥物面臨的一大問題，治療中需要與其他療法結(jié)合，更有效的抗腫瘤療法還需進一步研究。

4 結(jié)束語

酶響應納米藥物是由內(nèi)源性生物催化劑激活的納米藥物，與被動靶向納米藥物相比，在靶部位的富集濃度更高、治療效果更好和毒副作用更低；不同腫瘤或同一種腫瘤的不同發(fā)展時期，酶種類和水平不同，這是患者個性化給藥的依據(jù)。

盡管酶響應納米藥物具備諸多優(yōu)點，但鮮有臨床轉(zhuǎn)化成功的案例，在后續(xù)的酶響應藥物研發(fā)中需關(guān)注以下幾個問題：① EPR效應輸送藥物效率低且不穩(wěn)定。酶響應納米藥物首先需要通過EPR效應進入腫瘤，但EPR效應在腫瘤間存在差異，例如前列腺腫瘤、胰腺腫瘤相比肝細胞腫瘤與腎細胞腫瘤的血管密度低，EPR效應較弱；另外，在血管同一部位的不同時期EPR效應不同；收縮壓、凝血等因素也會影響EPR效應[5]。因此，高效地輸送藥物需要開辟其他途經(jīng)，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤血管的內(nèi)皮細胞有囊泡-空泡細胞器(vesiculo-vascuolar organelles， VVOs)結(jié)構(gòu)，它橫跨細胞質(zhì)，由大量相互連接的胞質(zhì)囊泡組成，一些小分子藥物可通過這些囊泡跨細胞轉(zhuǎn)運[61]，若充分開發(fā)該途徑，將其與EPR效應協(xié)同作用，可大大提高遞藥效率。②非病灶部位的酶易引起酶響應納米藥物釋藥。許多腫瘤部位異常的酶在正常組織中也廣泛存在(如ALP)，且同一家族酶的底物類似，這會引起藥物在非靶部位釋放。為使酶響應藥物只作用于病灶部位，還需發(fā)現(xiàn)更優(yōu)的腫瘤特異性酶。③酶響應納米藥物的設計應關(guān)注該酶催化反應動力學。酶反應時間和反應程度都影響藥物釋放速度和治療效果，可根據(jù)酶催化動力學優(yōu)化給藥劑量。④納米藥物易被RES攝取。90%納米藥物在給藥后都被RES攝取，為逃逸RES的清除，納米藥物的水合直徑需遠大于15 nm，另外可用紅細胞膜包裹納米粒來遮蔽調(diào)理素，抑制吞噬細胞的識別作用[4，62-63]。⑤人與小鼠的生理不同易使藥物臨床轉(zhuǎn)化失敗。目前納米藥物的開發(fā)過度依賴小鼠，但小鼠體內(nèi)環(huán)境、酶組成與人不同，這使移植瘤小鼠和人使用相同藥物后，產(chǎn)生不同的療效，例如小鼠和人的酯酶活性不同，小鼠酯酶響應的抗腫瘤藥不適用于對人治療[64]，因此還需要進一步研究。⑥多種刺激響應納米藥物不穩(wěn)定。多種刺激響應納米藥物的制備和治療機制較為復雜，一種刺激的缺失可能導致藥物治療失敗，需要在活體模型動物規(guī)律用藥的情況下連續(xù)長時間觀察效果，并對單一刺激缺失時的療效和毒性進行評估。