李姣，歐水平，張建永，熊永愛，王森

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，遵義 563099)

中草藥已被廣泛認(rèn)為是創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的寶貴資源[1]。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸[Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth]的干燥近成熟果實(shí)，其性熱，味辛苦，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效[2-3]。吳茱萸次堿(rutaecarpine，Rut)是從中藥吳茱萸中提取分離的主要有效成分之一，在吳茱萸生物堿類成分中含量最高[4-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，Rut具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集、舒張血管、降壓等多種藥理作用[6-9]。越來越多的研究顯示，Rut 在心血管保護(hù)方面發(fā)揮著重要的作用，它不僅可以減輕大鼠缺氧誘導(dǎo)的右心室重塑[10]，抑制腹主動脈縮窄致模型大鼠左心室肥厚[11]，還能明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠及兩腎一夾型大鼠血壓[12]。Rut在離體血管和整體動物水平均證明能有效地舒張血管、保護(hù)心臟和降壓，但由于中藥有效成分多靶點(diǎn)發(fā)揮系統(tǒng)治療作用的特點(diǎn)和作用機(jī)制的多樣性，Rut抗心血管作用的機(jī)制尚未明確，合理解釋其抗心血管作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵具有重要的意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是建立在網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與多向藥理學(xué)基礎(chǔ)上的一門新興學(xué)科，涉及到組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用[13]。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛用于探索中藥的潛在有效成分、靶點(diǎn)和藥理機(jī)制，為分析中醫(yī)整體作用的科學(xué)內(nèi)涵提供線索，極大地促進(jìn)了藥物的發(fā)現(xiàn)。反向分子對接技術(shù)是一種基于反向藥效團(tuán)匹配的計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)，因其特有的高效便捷等特點(diǎn)，被聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)廣泛應(yīng)用于中藥的藥理作用機(jī)制研究，為中藥現(xiàn)代化研究提供了新方向和思路[14]。

為了進(jìn)一步研究Rut的抗心血管作用機(jī)制，筆者采用反向分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘Rut的潛在作用靶點(diǎn)、關(guān)聯(lián)疾病及信號通路，從系統(tǒng)生物學(xué)整體角度解釋Rut抗心血管的作用機(jī)制，為Rut的藥物開發(fā)和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1Rut的成藥性評價 TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)是一個獨(dú)特的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺，可以計算天然化合物的ADME(吸收、分布、代謝和排泄)相關(guān)特征[15]。利用TCMSP搜索關(guān)鍵詞“Rutaecarpine”，可獲得Rut的分子結(jié)構(gòu)和ADME相關(guān)特性。

1.2Rut的靶點(diǎn)預(yù)測 PharmMapper是一種通過反向?qū)荧@得潛在藥物靶標(biāo)的服務(wù)器，已被廣泛用于單味中藥及復(fù)方的活性成分靶點(diǎn)預(yù)測[16-18]。將Rut結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器進(jìn)行Rut的反向靶點(diǎn)預(yù)測分析，將Select Target Set設(shè)置為Human Protein Target Only，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.3相關(guān)疾病分析和抗心血管靶點(diǎn)的篩選 Comparative Toxicogenomics Database(CTD)(http：//ctdbase.org/ about/)是一個強(qiáng)大的開放數(shù)據(jù)庫，可通過化合物靶點(diǎn)查詢對應(yīng)疾病[19]。為分析Rut潛在相關(guān)疾病，將上述Rut潛在靶點(diǎn)輸入CTD數(shù)據(jù)庫，通過基因搜索獲得各個靶標(biāo)的相關(guān)疾病，然后根據(jù)醫(yī)學(xué)主題詞(MeSH)的疾病分類，篩選出心血管疾病(cardivovascular disease,CVD)的相關(guān)條目，得到Rut相關(guān)的CVD和抗心血管靶點(diǎn)。

1.4化合物-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 Cytoscape是一種強(qiáng)大的生物信息學(xué)軟件包，可用于可視化生物通路和分子間相互作用研究[20]。為了將化合物-靶標(biāo)-疾病的相互關(guān)系進(jìn)行可視化，利用Cytoscape 3.6.0版軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)。將Rut、潛在靶點(diǎn)和對應(yīng)的CVD構(gòu)建成Rut-潛在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集和潛在靶點(diǎn)-CVD數(shù)據(jù)集，并依次導(dǎo)入Cytoscape，采用軟件中的合并功能(Merge)將成分、靶點(diǎn)及CVD構(gòu)建成一個成分、靶點(diǎn)和CVD的三元綜合網(wǎng)絡(luò)模型。

1.5蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 String是一種開放的數(shù)據(jù)分析平臺，常用于分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用[21]。為探討Rut相關(guān)的心血管疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，將上述獲得的Rut抗心血管靶點(diǎn)導(dǎo)入String平臺進(jìn)行在線分析，研究物種限定為人，數(shù)據(jù)導(dǎo)出為TSV格式，并借助Cytoscape構(gòu)建Rut抗心血管靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6分子對接驗(yàn)證 為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測靶點(diǎn)的可靠性，利用Systems Dock(http：//systemsdock.unit.oist.jp/)數(shù)據(jù)庫對Rut和度值前5個抗血管靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。通過輸入5個靶蛋白的PDB ID，導(dǎo)入Rut結(jié)構(gòu)，得到Rut和5個靶蛋白的對接得分值(Dock Score)。根據(jù)Dock Score來判斷Rut與靶蛋白之間的匹配度。Dock Score越大，表示Rut與靶蛋白之間結(jié)合越穩(wěn)定。根據(jù)文獻(xiàn)[20，22]，通常Dock Score大于5.0說明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，大于7.0則說明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性。

1.7通路富集分析和高級氣泡圖的繪制 為闡明Rut作用于CVD的潛在機(jī)制，將Rut 抗心血管靶點(diǎn)映射到DAVID在線分析系統(tǒng)以富集分析，選擇“正式基因符號(official gene symbol)”，研究對象限定為人。根據(jù)CVD的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步篩選與CVD相關(guān)的顯著富集通路，并借助Omicshare在線平臺將所得通路構(gòu)建成高級氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1Rut的ADME相關(guān)參數(shù) OB和DL是兩個重要的藥動學(xué)參數(shù)。Rut的OB和DL值分別為40.30%和0.60，其他參數(shù)如相對分子質(zhì)量、AlogP、Hdon、Hacc、Caco-2、BBB、RBN、HL分別為287.34，3.36，13，1.13，0.71，0，8.21，均滿足文獻(xiàn)中活性化合物的篩選原則[23-24]，表明Rut是藥物開發(fā)的良好候選者。

2.2Rut的靶點(diǎn)預(yù)測 利用PharmMapper服務(wù)器將Rut反向?qū)舆M(jìn)行潛在靶點(diǎn)預(yù)測，總共得到192個靶蛋白，進(jìn)一步通過Z值降序排列挑選出前100個靶蛋白進(jìn)行下一步的分析，靶點(diǎn)詳細(xì)信息見表1。

表1 Rut的潛在靶點(diǎn)信息Tab.1 Information of potential targets from Rut

2.3化合物-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為了將化合物、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)系進(jìn)行可視化，借助Cytoscape構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)包括72個節(jié)點(diǎn)(1個化合物、42個靶點(diǎn)和29種CVD)和134條邊。網(wǎng)絡(luò)中不同顏色的節(jié)點(diǎn)分別代表化合物、抗心血管靶點(diǎn)和CVD，邊代表它們?nèi)咧g的相互作用。節(jié)點(diǎn)的大小反映了度值的大小。較大的節(jié)點(diǎn)表示較高的度值。網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，篩選的100個潛在靶點(diǎn)中有42個靶點(diǎn)與29種CVD相關(guān)。在29種CVD中，高血壓具有最多的度值，其次是心肌再灌注損傷、心肌缺血、心臟肥大，它們分別與11，7，7，6個靶點(diǎn)連接。在網(wǎng)絡(luò)中，度值是指一個節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，度值的大小代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。由此表明，Rut對高血壓、心肌再灌注損傷、心肌缺血、心臟肥大等多種CVD具有潛在的治療效果。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，Rut能明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠及兩腎一夾高血壓大鼠血壓[12]；減輕缺氧誘導(dǎo)的右心室重構(gòu)，抑制血管肥大和血管緊張素II誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[25-26]。這在一定程度上證明本研究策略的可行性。

黃色代表藥物；綠色代表靶點(diǎn)；藍(lán)色代表心血管疾病。圖1 Rut-靶點(diǎn)-心血管疾病網(wǎng)絡(luò)Yellow color represents drug；green color represents targets；blue color represents cardiovascular disease.Fig.1 Rut-target-CVD network

在大多數(shù)情況下，疾病的發(fā)生和發(fā)展可被認(rèn)為是作用于多個靶標(biāo)而非單個靶標(biāo)的結(jié)果[27-28]。一種疾病可能作用于多個靶點(diǎn)，同一個靶點(diǎn)也可能與多種疾病相關(guān)。在圖1中，與多種CVD作用較多的靶點(diǎn)有血紅素加氧酶1(HMOX1，度=9)，凝血酶原(F2，度=9)，血清白蛋白(ALB，度=8)，腎素(REN，度=7)和半胱氨酸蛋白酶-3(cathepsin-3，CASP3，度=7)等，表明這些靶點(diǎn)可能在Rut的心血管保護(hù)作用中起著至關(guān)重要的作用。

2.4心血管相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 通過將上述42個心血管相關(guān)靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫，得到這些靶蛋白之間的相互作用，利用Cytoscape將結(jié)果繪制成PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。該網(wǎng)絡(luò)包含39個蛋白、186條邊(其中CBR1、HSD11B1和SULT1E1與其他蛋白沒有相互作用，未在網(wǎng)絡(luò)中顯示)。在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的深淺代表度值的大小，邊的粗細(xì)代表蛋白之間的Combine score值。節(jié)點(diǎn)越大、顏色越深表示該節(jié)點(diǎn)的度值較高；邊越粗表示Combine score值越大。由圖可知，ALB、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、類固醇受體共激活因子(steroid receptor coactivator,SRC)、表皮生長因子受體(epidermal grouth factor receptor,EGFR)和CASP3在該網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著重要的地位，表明這些靶蛋白可能在Rut治療CVD中扮發(fā)揮重要的作用。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Protein-protein interaction network

2.5分子對接驗(yàn)證 為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的可靠性，使用Systems Dock對Rut和Rut-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)中度值前5個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。結(jié)果Rut與F2、HMOX1、ALB、REN、CASP3之間的對接得分分別為8.016，6.182，6.320，5.688，7.101，均高于5.0，表明Rut與5個靶蛋白之間具有較好的結(jié)合活性。同時，該結(jié)果驗(yàn)證了預(yù)測靶點(diǎn)的可靠性。

2.6通路富集分析與高級氣泡圖的繪制 使用DAVID數(shù)據(jù)庫對Rut 42個抗心血管靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，分析結(jié)果見表2，進(jìn)一步利用Omicshare平臺構(gòu)建高級氣泡圖(圖3)。高級氣泡圖是通過數(shù)值、顏色、圖形大小等直觀指標(biāo)展示富集通路差異基因情況。氣泡面積大小表示目標(biāo)基因集中屬于這個pathway的基因數(shù)量，氣泡顏色表示富集顯著性(即P值)，X軸表示富集因子(rich factor)，Y軸表示pathway名稱。其中富集因子越大，富集程度越大。由圖可知，Rut抗心血管靶蛋白主要富集于VEGF信號通路、MAPK信號通路以及缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信號通路。此外，研究發(fā)現(xiàn)Rut亦調(diào)控了CVD的經(jīng)典通路如胰島素抵抗和Toll樣受體信號通路等，進(jìn)一步表明Rut的多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用，推測Rut可能是通過調(diào)控這些通路發(fā)揮治療CVD作用。

表2 吳茱萸次堿潛在靶點(diǎn)的KEGG信號通路Tab.2 KEGG signaling pathway of potentially target of Rut

圖3 通路分析氣泡圖Fig.3 Bubble plot of pathway analysis

3 討論

藥物毒性和藥動學(xué)是影響藥物開發(fā)的重要因素，在藥物開發(fā)過程中優(yōu)先考慮這些方面，就能夠極大地降低藥物開發(fā)的成本。近年來，隨著生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，這種推測和模擬藥動學(xué)和藥物毒性的優(yōu)勢更加凸顯?；诖耍狙芯恳訰ut為對象，首先采用TCMSP平臺對Rut的ADME相關(guān)特性進(jìn)行考察。

TCMSP的預(yù)測結(jié)果表明，Rut具有較好的藥動學(xué)特征和成藥性，是良好的潛在候選藥物。通過進(jìn)一步進(jìn)行藥物-靶點(diǎn)預(yù)測、靶點(diǎn)-疾病分析和化合物-靶點(diǎn)-CVD網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)HMOX1、ALB、F2、REN和CASP3等具有較高的度值，推測Rut可能是通過作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)從而發(fā)揮干預(yù)CVD的作用。HMOX1是血紅素加氧酶系統(tǒng)中最重要的同工酶，具有抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等作用，在高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病中發(fā)揮著極其重要的作用[29]。研究顯示，Rut對叔丁基過氧化氫誘導(dǎo)的肝毒性具有保護(hù)作用，與增加HMOX1產(chǎn)生的產(chǎn)物有關(guān)[30]，提示Rut可能是通過作用于HMOX1，影響相關(guān)體內(nèi)代謝過程進(jìn)而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。血清ALB是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)之一，具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及清除自由基等功能[31]。血清ALB水平過低會導(dǎo)致高血壓腦出血患者的水腫程度加重，且其嚴(yán)重程度與血清ALB的水平呈負(fù)相關(guān)[32]。有研究指出，Rut和ALB可形成1：1型穩(wěn)定的復(fù)合物，最有可能的結(jié)合位點(diǎn)為Trp213殘基(牛血清ALB)或Trp214殘基(人血清ALB)附近[33]。由此推測Rut可能是通過與ALB結(jié)合、調(diào)節(jié)ALB水平發(fā)揮心血管保護(hù)作用。F2亦稱第Ⅱ因子，是血液凝固因子之一，存在于血漿中，是凝血酶的前身物質(zhì)，在凝血機(jī)制中起著中心的作用。研究表明，F(xiàn)2缺陷會導(dǎo)致血栓形成[34]，但目前筆者未見Rut通過作用于F2干預(yù)心血管疾病的報道，對進(jìn)一步深入研究具有重要意義。腎素是腎素-血管緊張肽系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)的重要組成部分，RAS是維持血壓、水和電解質(zhì)平衡及心血管穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控系統(tǒng)，對CVD的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要[35-36]。Rut可能通過作用于REN、調(diào)節(jié)RAS、維持心血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而在治療CVD中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞凋亡在CVD中起核心作用，CASP3是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白酶，參與調(diào)控糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡，下調(diào)Caspase-3能夠減弱心肌細(xì)胞的凋亡[37]。提示Rut可能是通過調(diào)節(jié)CASP3蛋白酶的表達(dá)，控制細(xì)胞凋亡進(jìn)而干預(yù)CVD，但目前筆者尚未見Rut通過調(diào)控CASP3進(jìn)而發(fā)揮心血管保護(hù)作用的報道，因此對本研究結(jié)果仍需進(jìn)一步深入研究。

通路富集預(yù)測結(jié)果顯示，Rut可能主要通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、MAPK和HIF-1信號通路進(jìn)一步發(fā)揮心血管保護(hù)作用。VEGF信號通路通過增加細(xì)胞增殖和降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附而具有內(nèi)皮保護(hù)作用[16]。研究顯示，Rut可通過調(diào)節(jié)VEGFR2和VEGFR2介導(dǎo)的Akt / mTOR / p70s6k信號傳導(dǎo)途徑來抑制血管生成[38]；MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以控制細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)，MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)可能在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[39]。研究報道，Rut可通過干擾氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制JNK / p38 MAPK信號通路，減輕大鼠腎臟缺血-再灌注損傷[40]；明顯防治大鼠腹主動脈縮窄所致左室肥厚，其作用機(jī)制至少部分與其抑制MAPK/ERK信號通路有關(guān)[11]。HIF-1α信號通路在生長因子和血管生成的調(diào)節(jié)中起重要作用[41]。報道顯示，Rut還可通過調(diào)節(jié)IRS-1/PI3K/Akt和AMPK/ACC2信號通路改善大鼠的高脂血癥和高糖血癥[42-43]；通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護(hù)心肌缺血-再灌注損傷，此作用與促進(jìn)降鈣素基因相關(guān)肽釋放有關(guān)[44]。

綜上所述，本研究利用反向分子對接和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對Rut的心血管保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明Rut在心血管領(lǐng)域具有較好的研究前景，其可能是治療CVD的潛在藥物。進(jìn)一步通過對靶點(diǎn)和通路預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)Rut可能通過作用于HMOX1、F2、ALB、REN和CASP3等靶點(diǎn)進(jìn)而參與調(diào)控VEGF、HIF-1、MAPK等信號通路，其可能是通過多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的機(jī)制發(fā)揮心血管保護(hù)作用。本研究為Rut干預(yù)CVD的藥理活性、靶標(biāo)和藥物開發(fā)研究提供了重要參考。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法還存在一定的局限性，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持與驗(yàn)證。