晁毛妮，胡喜貴，張晉玉，王潤(rùn)豪，溫青玉，孫新凱，黃中文

(1.河南科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 鄭州 450002)

大豆是我國(guó)重要的油料作物，也是重要的植物油來源，其種子油脂含量和脂肪酸組分對(duì)大豆品質(zhì)具有重要影響[1]。油酸和亞油酸是大豆種子油脂中對(duì)人體有益的不飽和脂肪酸，在預(yù)防高血壓和心臟病等方面具有重要作用，而亞麻酸易于氧化，容易使油脂變質(zhì)[2-3]。因此，在大豆品質(zhì)育種中，提高大豆種子油脂含量尤其是油酸和亞油酸含量，同時(shí)降低亞麻酸含量已成為研究的熱點(diǎn)。

三酰甘油(TAG)是油料作物油脂積累和儲(chǔ)存的主要形式，對(duì)植物種子油脂的形成十分重要[4-8]。二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)是催化TAG生物合成的關(guān)鍵酶，在TAG的合成和積累過程中具有重要調(diào)控作用[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)4種類型的DGAT，包括DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和可溶性的DGAT[10]，其中DGAT1研究得最為深入，已在旱金蓮[11]、甘藍(lán)型油菜[12]、大豆[13]、玉米[14]和煙草[15]等多個(gè)物種中被克隆和研究。研究表明，DGAT1是TAG積累的主要貢獻(xiàn)者，在植物中主要影響種子的含油量[16-21]。例如，將旱金蓮TmDGAT1基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥、油菜和高芥酸油菜，可使其干種子含油量提高3.5%～10%[11]；在玉米中，過表達(dá)DGAT1不僅可以提高玉米種子的含油量，還改變了種子油脂的組成[14]。相反地，在擬南芥DGAT1突變體植株中，種子含油量下降20%～40%[22]。關(guān)于大豆DGAT的研究發(fā)現(xiàn)，大豆中共存在10個(gè)DGAT基因，其中包含3個(gè)DGAT1基因[23]。進(jìn)一步將GmDGAT1A在擬南芥中進(jìn)行過表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因種子含油量提高15.4%～21.7%[24]，表明大豆GmDGAT1A基因在提高植物種子含油量方面具有很大潛力。因此，研究大豆GmDGAT1A基因的表達(dá)調(diào)控，不僅有助于深入了解其表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，也可為通過改變GmDGAT1A表達(dá)水平，提高大豆種子油脂含量提供一種新途徑。

啟動(dòng)子是RNA聚合酶能夠識(shí)別與結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要，決定了基因的表達(dá)模式和強(qiáng)度[25-26]。另外，啟動(dòng)子區(qū)具有很多重要的調(diào)控元件，包括響應(yīng)于非生物脅迫、植物激素和光照等，它們可以通過響應(yīng)外界環(huán)境條件來調(diào)控下游基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性[26-28]。因此，研究基因的啟動(dòng)子，對(duì)于增強(qiáng)植物的抗逆性和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性等也具有重要意義。GmDGAT1A是大豆油脂代謝過程中的一個(gè)關(guān)鍵基因，目前對(duì)于GmDGAT1A表達(dá)特性和功能已開展一些研究[13，29]，但是關(guān)于該基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制還知之甚少。本研究對(duì)大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子進(jìn)行克隆，并對(duì)其順式作用元件進(jìn)行分析，另外，又進(jìn)一步構(gòu)建了含有報(bào)告基因GUS的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A，并通過轉(zhuǎn)化擬南芥和GUS組織化學(xué)染色來研究其功能，旨在探究油脂代謝基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，并為通過基因工程提高大豆種子油脂含量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為大豆品種科豐1號(hào)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家大豆改良中心提供，用于GmDGAT1A啟動(dòng)子的克隆。

1.2 大豆基因組DNA的提取

以大豆葉片為試驗(yàn)材料，使用基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP321)，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行大豆基因組DNA的提取，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取的質(zhì)量。

1.3 GmDGAT1A啟動(dòng)子的擴(kuò)增

根據(jù)GmDGAT1A啟動(dòng)子的序列信息，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列：pGmDGAT1A-F1：GACCTAAACCGATAACCAAAGAA，pGmDGAT1A-R1：AACCTGACGGAAAATGGTGTC。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括25 μL 2 × Phanta Max Buffer (Mg2+plus)，1.0 μL dNTP Mix (10 mmol/L each)，正、反向引物(10 μmol/L)各2 μL，1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme，P505-d1)，2.5 μL DNA 模板和16.5 μL ddH2O，共計(jì)50 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 3 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確定為目的基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒(Axygen，AP-GX-4)回收后送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 GmDGAT1A啟動(dòng)子序列分析

利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行GmDGAT1A啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的預(yù)測(cè)。

1.5 GmDGAT1A啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

選用無啟動(dòng)子、含有GUS基因的pCAMBIA1381Z作為表達(dá)載體，利用雙酶切方法構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A。首先根據(jù)啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基的上下游引物，上游引物為pGmDGAT1A-F2：5′-CGCGGATCCGACCTAAACCGATAACCAAAGAA-3′，下劃線為酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ；下游引物為pGmDGAT1A-R2：5′-AAACTGCAGTGGAAAAGAAGACCGAGCG-3′，下劃線為酶切位點(diǎn)為PstⅠ。以測(cè)序正確的膠回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同上所述。使用BamH Ⅰ和PstⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和pCAMBIA1381Z空載體質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，電泳后的膠回收產(chǎn)物用T4連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。挑選單克隆進(jìn)行菌液PCR，陽性菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，含有目的基因片段的菌液送深圳華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法[30]將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(Cloumbia-0)，獲得T0轉(zhuǎn)基因種子。將T0種子種在含有潮霉素抗性的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，經(jīng)抗性篩選長(zhǎng)出的植株為T1植株，待其長(zhǎng)出2片真葉后移栽到蛭石中，并置于光照培養(yǎng)箱(22 ℃，光16 h/暗8 h)中進(jìn)行培養(yǎng)。于幼苗期取T1轉(zhuǎn)基因植株的葉片，用于進(jìn)一步的PCR檢測(cè)，PCR檢測(cè)所用引物序列：pGmDGAT1A-F3：5′-GACCTAAACCGATAACCAAAG-3′，pGmDGAT1A-R3：5′-TGGAAAAGAAGACCGAGCGAGC-3′。PCR檢測(cè)為陽性的植株于成熟期收獲T1種子。采用同樣的方法繼續(xù)對(duì)T1種子進(jìn)行抗性篩選，收獲的T2種子用于后續(xù)的GUS組織化學(xué)染色分析。

1.7 GUS組織化學(xué)染色

擬南芥幼苗和處于成熟期擬南芥植株的根系、葉片、莖和角果等組織的GUS染色參照J(rèn)efferson等[31]方法并略加修改。首先，取待染色的各組織，加入GUS染色液；接著，置于37 ℃溫育24 h；然后，用70%乙醇進(jìn)行脫色，直至底色完全消失；最后在體視鏡(AXIO Zoom.V16，蔡司)下觀察染色結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子的克隆

用已克隆的GmDGAT1A基因ID號(hào)(Glyma.13G106100/Glyma13g16560)檢索大豆基因組數(shù)據(jù)庫，得到其ATG上游約2 000 bp的啟動(dòng)子序列。然后，在該啟動(dòng)子序列上下游約500 bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，并以大豆品種科豐1號(hào)DNA(圖1-A)為模板，擴(kuò)增大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子。根據(jù)上下游引物的位置可知，擴(kuò)增片段的理論大小為2 495 bp。由圖1-B可以看到，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期片段大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后，與大豆基因組數(shù)據(jù)庫參考序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段包含GmDGAT1A基因ATG上游2 192 bp的啟動(dòng)子序列，且與大豆基因組參考序列一致，表明本研究已成功克隆GmDGAT1A的啟動(dòng)子pGmDGAT1A。

圖1 大豆基因組DNA的提取(A)及GmDGAT1A啟動(dòng)子的擴(kuò)增(B)Fig.1 The extraction of genomic DNA (A) and PCR amplification of GmDGAT1A promoter (B) in soybean

2.2 大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子的序列分析

對(duì)已克隆的pGmDGAT1A進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子包含有TATA-box和CAAT-box等啟動(dòng)子所必需的基本順式作用元件，另外還含有7個(gè)參與光響應(yīng)的順式作用元件(G-box、LAMP-element 、TCT-motif和Box 4)，4個(gè)參與脫落酸響應(yīng)順式作用元件(ABRE)，1個(gè)參與赤霉素響應(yīng)的順式作用元件(GARE-motif)，以及一些像MYB、ERE、AAGAA-motif和Myc等功能未知的順式作用元件(表1)。這些結(jié)果表明，GmDGAT1A的表達(dá)可能受光、赤霉素和脫落酸等多種環(huán)境條件的影響。

2.3 大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

利用雙酶切法將克隆的啟動(dòng)子片段pGmDGAT1A連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z(有GUS，無啟動(dòng)子)上。將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后挑選陽性克隆測(cè)序，序列比對(duì)結(jié)果正確。進(jìn)一步利用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和PstⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明，表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A可被切為2個(gè)片段，分別為2 192 bp的目標(biāo)基因片段和載體片段，且載體片段與pCAMBIA1381Z空載體酶切片段的大小一致(圖2)，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

表1 大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件Tab.1 Cis-acting elements in promoter of GmDGAT1A in soybean

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的鑒定

將pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，成熟后收獲T0轉(zhuǎn)基因種子。對(duì)T0轉(zhuǎn)基因種子用含有潮霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選后，進(jìn)一步對(duì)T1擬南芥幼苗進(jìn)行基因組DNA提取和PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，T1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗和陽性對(duì)照(表達(dá)載體質(zhì)粒)均能擴(kuò)增到2 192 bp的GmDGAT1A啟動(dòng)子片段，而陰性對(duì)照(野生型擬南芥)擴(kuò)增不到目標(biāo)條帶(圖3)，表明被檢測(cè)的T1轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗為陽性植株，成熟后收獲T1轉(zhuǎn)基因種子。T1轉(zhuǎn)基因種子經(jīng)潮霉素抗性篩選和PCR檢測(cè)后，于成熟期收獲T2種子，用于后續(xù)的功能分析。

M.Marker；1.pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A表達(dá)載體；2：空載體(pCAMBIA1381Z)。M.Marker；1.pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A expression vector；2.Empty vector(pCAMBIA1381Z).

2.5 大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子的功能分析

對(duì)轉(zhuǎn)pGmDGAT1A擬南芥植株各組織進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果表明，pGmDGAT1A驅(qū)動(dòng)的GUS主要在轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉脈(圖4-A1-A2)和根(圖4-A1、A3-A4)中表達(dá)，在主根和側(cè)根的根尖部分(圖4-A3-A4)不表達(dá)；在成熟期轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，葉脈(圖4-B1)、成熟的根(圖4-B3-B4)、角果內(nèi)的隔膜和珠柄(圖4-B5-B9)GUS染色較深，而莖(圖4-B2)和發(fā)育的種子(圖4-B10-B12)未染色。這些結(jié)果表明，pGmDGAT1A驅(qū)動(dòng)的GUS主要在擬南芥的根、葉脈以及角果內(nèi)隔膜和珠柄中表達(dá)。

M.Marker；1.表達(dá)載體pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A質(zhì)粒(陽性對(duì)照)；2.野生型擬南芥(陰性對(duì)照)；3-10.轉(zhuǎn)基因擬南芥。M.Marker；1.Expression vector pCAMBIA1381Z-pGmDGAT1A(Positivecontrol)；2.Wild Arabidopsis thaliana (Negative control)；3-10.Transgenic Arabidopsis thaliana.

A1-A4.轉(zhuǎn)pGmDGAT1A擬南芥幼苗(A1)及其葉片(A2)、側(cè)根(A3)和主根(A4)對(duì)應(yīng)位置放大圖；B1-B12.成熟期轉(zhuǎn)pGmDGAT1A擬南芥植株的葉片(B1)、莖(B2)、根(B3)、根對(duì)應(yīng)位置放大圖(B4)、角果(B5-B9)、發(fā)育的種子(B10)和種子對(duì)應(yīng)位置放大圖(B11-B12)。A1-A4.pGmDGAT1A transgenic Arabidopsis thaliana seedlings (A1) and enlarged view of its leaf (A2)，lateral roots (A3) and main roots (A4)；B1-B12.The leaf (B1)，stem (B2)，roots (B3)，enlarged view of roots (B4)，silique (B5-B9)，seeds (B10)and enlarged view of seeds (B11-B12) in mature pGmDGAT1A Arabidopsis thaliana.

3 結(jié)論與討論

植物種子中的油脂是人類重要的食用油來源，也是重要的工業(yè)原料。目前，關(guān)于油脂代謝的生化途徑及相關(guān)基因的功能已比較清楚，但其調(diào)控機(jī)理尚不明確[32-33]。啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，在基因的表達(dá)調(diào)控中具有重要作用[34]。為了解大豆油脂代謝重要基因GmDGAT1A表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，本研究對(duì)大豆油脂代謝基因GmDGAT1A啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmDGAT1A啟動(dòng)子區(qū)除具有基本的順式作用元件外，主要還包括一些響應(yīng)于光、脫落酸和赤霉素等順式作用元件。許多研究表明，脫落酸是調(diào)控種子發(fā)育、成熟和休眠的重要內(nèi)源激素[35]，對(duì)于油籽脂肪酸含量和組分具有影響[36-38]。例如，在油菜中，噴施脫落酸可通過抑制脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)基因FAE1的表達(dá)，影響芥酸等超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成，進(jìn)而促進(jìn)不飽和脂肪酸含量的增加和蛋白質(zhì)含量下降[38]。與脫落酸功能不一樣的是，赤霉素具有促進(jìn)種子萌發(fā)的作用[39]。由于種子在萌發(fā)過程中需要消耗油脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來滿足種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成所需的能量，因此，赤霉素有利于種子油脂消耗而不利于油脂的積累[40]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素信號(hào)途徑主要是通過抑制DELLA蛋白的表達(dá)，從而上調(diào)與種子脂肪分解相關(guān)的SFARs類GDSL脂酶基因的表達(dá)，最終抑制種子中油脂的積累[41]。在本研究中，大豆油脂合成的關(guān)鍵基因GmDGAT1A啟動(dòng)子區(qū)具有脫落酸和赤霉素響應(yīng)元件，表明大豆種子油脂的積累可能與其他植物一樣也受植物激素脫落酸和赤霉素的影響，它們可能通過啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控油脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響大豆種子中油脂的合成與分解。有趣的是，與赤霉素響應(yīng)元件相比，GmDGAT1A啟動(dòng)子區(qū)具有較多拷貝的脫落酸響應(yīng)元件。一方面，脫落酸對(duì)于油籽種子中脂肪酸含量的積累有促進(jìn)作用[36-39]；另一方面，有研究表明，啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件的數(shù)目可能會(huì)影響基因表達(dá)的強(qiáng)度和誘導(dǎo)特性[42]。目前還不清楚脫落酸響應(yīng)元件ABRE是如何調(diào)控下游基因GmDGAT1A表達(dá)和強(qiáng)度，以及脫落酸在大豆種子油脂合成中的作用。因此，在今后的研究中仍需通過啟動(dòng)子功能區(qū)的缺失分析等來進(jìn)一步確定參與基因表達(dá)調(diào)控的重要元件及對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度的影響。

目前，關(guān)于DGAT1基因的組織表達(dá)特性研究已有較多報(bào)道，普遍認(rèn)為DGAT1基因在植物的許多組織均有表達(dá)，且在不同植物中DGAT1基因的表達(dá)模式存在很大差異。例如，旱金蓮DGAT1基因僅在種子中表達(dá)[11]，蓖麻DGAT1基因在各個(gè)組織表達(dá)水平接近[43]。在大豆中，GmDGAT1A基因在種子中表達(dá)量最高，在根、葉、莖、花和莢等組織也有較高的表達(dá)，且在不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)規(guī)律與油脂含量積累規(guī)律一致[13]，暗示著其在大豆種子油脂積累中起著重要作用。先前研究表明，基因的表達(dá)模式主要受上游啟動(dòng)子的表達(dá)調(diào)控，為了探究GmDGAT1A的組織特異性表達(dá)模式是否由于其上游啟動(dòng)子的調(diào)控，本研究進(jìn)一步通過擬南芥轉(zhuǎn)化來探究大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子的功能。對(duì)大豆GmDGAT1A啟動(dòng)子的功能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，GmDGAT1A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS在擬南芥的根、葉片的葉脈中具有較高的表達(dá)，這與先前研究表明GmDGAT1A基因在根和葉中具有較高表達(dá)量的結(jié)果較為一致[13]；而在擬南芥的角果中，GmDGAT1A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS主要在角果內(nèi)的隔膜和珠柄中表達(dá)，在發(fā)育的種子中表達(dá)量很低。擬南芥角果內(nèi)珠柄的主要功能是為擬南芥種子的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)通道[44]，GmDGAT1A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS在擬南芥角果內(nèi)的隔膜和珠柄中的高表達(dá)，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中油脂的積累可能主要通過在其他地方合成并通過營(yíng)養(yǎng)通道運(yùn)輸來完成。由于擬南芥角果的構(gòu)造和發(fā)育規(guī)律與大豆莢果可能存在差異，因此，有必要在大豆中進(jìn)一步通過GUS組織定位來探究GmDGAT1A啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因在莢果內(nèi)的表達(dá)情況，從而為深入了解GmDGAT1A啟動(dòng)子的功能奠定基礎(chǔ)。