李宏偉 慈百全 侯明磊 羅智文 張瑤 林連兵 張棋麟

摘要：從健康雞腸道中自行分離篩選出9株乳酸菌株為試驗(yàn)菌株，通過考察菌種的生長速度、耐酸、耐膽堿、耐腸胃液，并以抑菌性能作為主要指標(biāo)。通過產(chǎn)酸能力測定、耐酸能力測定、耐受腸胃極端環(huán)境性能測定得到2株乳酸菌，2株乳酸菌上清液經(jīng)牛津杯雙層平板法對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌等5株指示菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)2株乳酸菌對5株指示菌株都具有非常明顯的抑菌作用。采用16s rDNA分子標(biāo)記對乳酸菌進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，L2為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、L4為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）。

關(guān)鍵詞：雞源乳酸菌;耐受能力;菌株鑒定;抑菌

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0188-04

收稿日期：2019-08-24

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31760042、31960286）;云南省教育廳科學(xué)研究基金（編號：2019J0050）。

作者簡介：李宏偉（1993—），男，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槟c道微生物及其高密度發(fā)酵。E-mail：lihongwei667@163.com。

通信作者：張棋麟，副教授，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)基因組學(xué)。E-mail：zhangqilin88888@126.com。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類可以使碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細(xì)菌的總稱[1];形態(tài)上常分為桿狀和球狀2類，為革蘭氏陽性、兼性厭氧型細(xì)菌[2];被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中，被公認(rèn)為安全的微生物，可應(yīng)用于醫(yī)療、食品添加和畜牧等行業(yè)[3-5]。乳酸菌是工業(yè)上重要的細(xì)菌，這些細(xì)菌利用各種底物生產(chǎn)發(fā)酵食品和飲料，如牛奶、蔬菜、谷物、肉類、可可豆等。酸奶、奶酪和發(fā)酵乳制品被廣泛認(rèn)為是益生菌的主要來源[6-7]。益生菌被定義為“活的微生物”，在攝入一定數(shù)量的益生菌后，除固有的基本營養(yǎng)外，還能發(fā)揮健康益處[8-9]。益生菌的有益作用包括預(yù)防和治療腹瀉病、預(yù)防感染、管理炎癥性腸病、免疫調(diào)節(jié)等疾病[2，10-11]。本研究從健康雞腸道十二指腸黏膜中分離出優(yōu)質(zhì)的乳酸菌，通過對乳酸菌的耐酸、耐膽堿、耐腸胃液能力、產(chǎn)酸能力以及乳酸菌對大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella）等革蘭氏陰性菌及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等革蘭氏陽性菌抑菌效果等指標(biāo)測試評價(jià)，獲得生長速率快、耐受極端環(huán)境強(qiáng)、抑菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣的優(yōu)良菌株。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)及時(shí)間

本試驗(yàn)于2019年3—7月在昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院腸道微生物課題組內(nèi)完成。

1.2材料與試劑

1.2.1菌種乳酸菌從云南特有品種無量山烏骨雞（Gallus gallus）健康成年雞腸道內(nèi)分離獲得。沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、無乳鏈球菌為昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院噬菌體與腸道微生物課題組實(shí)驗(yàn)室保存。

供試雞，購自云南南澗無量山烏骨雞養(yǎng)殖場。

1.2.2培養(yǎng)基與試劑MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.00 g、牛肉粉8.00 g、酵母粉4.00 g、葡萄糖 20.00 g、硫酸錳0.04 g、磷酸氫二鉀2.00 g、檸檬酸氫二銨2.00 g、乙酸鈉5.00 g、硫酸鎂0.20 g、吐溫-80 1.00 g、瓊脂15.00 g，加水至1 L，采用 1 mol/L 鹽酸將培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8，121 ℃下滅菌 20 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉 10 g、瓊脂15 g，加水至1 L，121 ℃下滅菌 20 min。

其他生化試劑：結(jié)晶紫、碘液、乙醇、鹽酸、胰蛋白酶、胃蛋白酶、豬膽鹽等所有生化試劑，均購置于上海源葉生物科技有限公司。

1.3主要設(shè)備儀器

落地式超凈工作臺[邦西儀器科技（上海）有限公司]、酸堿度pH測定計(jì)（上海佑科儀器表有限公司）、紫外分光光度計(jì)（上海佑科儀器表有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）、臺式高速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、超低溫冰箱（日本三洋電器股份有限公司）。

1.4方法

1.4.1雞腸道中乳酸菌的分離和純化取健康雞腸道，采用無菌生理鹽水清洗雞腸道并刮去腸道內(nèi)容物，在腸黏膜表層不同位置刮取黏液，置于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)12 h[12]。將菌液取 100 μL 涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上（含5% CaCO3），37 ℃下培養(yǎng)24 h[13]。挑取生長最為旺盛且具有透明溶鈣圈的單菌落繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，將產(chǎn)生溶鈣圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，革蘭氏染色陽性菌株初步定為乳酸菌，將上述菌株用含有15%甘油的MRS培養(yǎng)基保存于-80 ℃。

1.4.2菌株產(chǎn)酸分析將上述純化后的菌株，取200 μL接種于5 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 下培養(yǎng)24 h，使用分光光度計(jì)檢測乳酸菌在600 nm處的吸光度，并使用pH計(jì)檢測其pH值。

1.4.3強(qiáng)酸耐受性試驗(yàn)選取產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，37 ℃下培養(yǎng)24 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取沉淀，將沉淀重懸于pH值為2.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150r/min恒溫培養(yǎng)3h，分別在0、3 h取樣，以稀釋涂布平板法測定菌株濃度[14]。

1.4.4膽鹽耐受性試驗(yàn)將耐酸菌株接種于含0.3%豬膽鹽的MRS中，37 ℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)，于0、4、8 h各取樣1次，采用酶標(biāo)儀檢測其吸光度D值[15-16]。

1.4.5人工胃腸液耐受性試驗(yàn)將磷酸鹽緩沖液（PBS）滅菌后，調(diào)至pH值為2.5，加入0.3%過濾除菌后的胃蛋白酶，制成模擬人工胃液;將PBS滅菌后，調(diào)至pH值為6.8，加入0.1%的胰蛋白酶和0.3%的豬膽鹽，制成模擬人工腸液[16]。

將活化3代的菌液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用上述模擬人工胃液將菌體重新震蕩懸浮，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)3 h。然后將處理后的乳酸菌按照2%接種量接入至人工腸液中，在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)，分別于0、4、8 h取樣，利用酶標(biāo)儀檢測其吸光度D值。

1.4.6抑菌試驗(yàn)將耐酸、耐膽汁的供試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，離心取上清液，并用0.2 μm的過濾膜除菌，制得供試菌株無細(xì)胞培養(yǎng)液。

采用牛津杯法測定供試菌株的抑菌效果，利用牛津杯雙層平板法將5株指示菌株分別混合于上層MRS軟瓊脂培養(yǎng)基中。待凝固后，采用鑷子將無菌牛津杯置于無菌培養(yǎng)皿中，吸取供試菌株無細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL于牛津杯中，先于4 ℃下放置4～5 h，使培養(yǎng)液完全擴(kuò)散，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑[17]，試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每個試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，取其平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。采用Microsoft Excel 2007及IBM SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖。

2乳酸菌菌株的鑒定

2.1乳酸菌基因組總DNA提取

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取乳酸菌的基因組總DNA。

2.2乳酸菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增、測序與同源性分析

以乳酸菌菌株基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3′），對乳酸菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;然后 94 ℃ 變性30 s、52 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物大小經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測驗(yàn)證后，將目標(biāo)條帶進(jìn)行純化，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物的Sanger測序[18-19]。

將乳酸菌序列提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Informmion，NCBI）網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLAST在線服務(wù)器（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）將其與細(xì)菌數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過比對得分最高的已知乳酸菌種類確定種名。

3結(jié)果與分析

3.1分離菌株的生長曲線及產(chǎn)酸能力比較

通過含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基對雞腸道中的乳酸菌進(jìn)行篩選，經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑選生長旺盛、溶鈣圈明顯的菌落。將上述菌落繼續(xù)在MRS固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行平板劃線分離，得到純化后具有溶鈣圈的革蘭氏陽性菌疑似乳酸菌9株，對9株疑似乳酸菌菌株編號為L1～L9（表1）。

3.2強(qiáng)酸耐受性比較

選取產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌株，進(jìn)行強(qiáng)酸耐受性試驗(yàn)，得到4株產(chǎn)酸能力強(qiáng)的菌株，于pH值為2.5的強(qiáng)酸MRS培養(yǎng)基中37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)3 h，使用稀釋涂布平板法檢測活菌數(shù)，見表2。

由表2可知，4株產(chǎn)酸能力比較強(qiáng)的菌株對酸的耐受能力不同，其中L2、L4對酸的耐受能力達(dá)到100%，L3耐受力為24.5%，L6耐受力為19%。選擇L2、L4進(jìn)行下步試驗(yàn)。

3.3膽鹽耐受性比較

將產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的2株乳酸菌L2、L4取 200 μL 接種于5 mL含有0.3%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)8 h，吸光度檢測結(jié)果見表3。由表3可知，2株乳酸菌受0.3%膽鹽脅迫，仍能夠保持良好的生長狀態(tài)，L2的膽鹽耐受能力顯著低于L4的耐受力。

3.4乳酸菌抑菌試驗(yàn)

通過牛津杯平板法對2株乳酸菌進(jìn)行抑菌能力檢測，由表4可知，2株菌株對5株指示菌株的抑菌圈平均直徑均在18 mm以上，說明2株乳酸菌對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性菌、以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌都具有非常明顯的抑菌效果。

乳酸菌對致病菌的最低抑菌濃度可以在一定程度上反映金黃色葡萄球菌對乳酸菌的敏感性，也反映了乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用。抑制濃度越低，乳酸菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用越明顯。由圖1、圖2可知，雖然接種5%乳酸菌無細(xì)胞上清液對金黃色葡萄球菌有一定抑制作用，但效果不明顯。而接種10%以上的乳酸菌無細(xì)胞上清液對金黃色葡萄球菌的抑制作用幾乎達(dá)到100%。結(jié)果表明，一定量的乳酸菌無細(xì)胞培養(yǎng)物可以抑制金黃色葡萄球菌的生長。所得數(shù)據(jù)可為未來工業(yè)應(yīng)用中添加乳酸菌質(zhì)量濃度的選擇提供直接參考。

3.5耐人工腸胃液比較

由表5可知，2株乳酸菌經(jīng)人工胃液處理3 h后，活菌數(shù)無明顯差異。將2株經(jīng)人工胃液處理后的乳酸菌轉(zhuǎn)接至人工腸液中，發(fā)現(xiàn)2株乳酸菌均不受人工腸液影響，能夠正常生長，由此推斷2株乳酸菌不但能夠耐受人工胃液，而且能夠在腸液中生長，具備良好的腸胃液耐受能力。

4菌種鑒定

結(jié)果表明，菌株L2 16S rDNA基因序列與植物乳桿菌（L. plantarum）均有高于99%的同源性，確定L2菌株為植物乳桿菌。L416SrDNA基因序列

5結(jié)論與討論

乳桿菌廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中，如發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵肉類等。本研究從雞十二指腸黏膜上分離得到的2株乳桿菌，較分離于自然環(huán)境下的乳桿菌更易于定殖在動物腸道內(nèi)，維持腸道菌群平衡，經(jīng)16S rDNA鑒定屬于植物乳桿菌和短乳桿菌。本研究中的2株乳桿菌，產(chǎn)酸、耐酸性能較為突出，均能在pH值=2.5的培養(yǎng)基中生存，這說明2株乳桿菌能夠通過胃達(dá)到腸道，這為其發(fā)揮益生性能起到了先決作用。2株乳酸菌在含0.3%膽堿培養(yǎng)基中能夠生存并繁殖，滿足了優(yōu)良益生菌的特性。此外，2株乳桿菌對革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌都具有良好的抑菌效果。由此可知，2株乳酸菌對動物腸道及食品中的有害細(xì)菌具有廣譜抑菌作用，這對發(fā)酵肉制品、蔬菜等食品生產(chǎn)和貯存具有重要意義。

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