劉佳等

摘 要 以紅辣椒、青線椒和黃燈籠辣椒的超臨界二氧化碳提取物為原料，進行體外抑菌試驗，比較分析以上3種辣椒油樹脂對雞的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。試驗結(jié)果表明：海南黃燈籠辣椒提取物對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果均優(yōu)于青辣椒和紅辣椒；對金黃色葡萄球菌的抑菌作用與紅辣椒相當(dāng)，但低于青辣椒。青辣椒提取物的丙酮溶液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.75、0.6和0.9 mg/mL，最低殺菌濃度分別為0.9、0.75和1.2 mg/mL；海南黃燈籠辣椒提取物的丙酮溶液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.6、0.45和1.2 mg/mL，最低殺菌濃度分別為0.75、0.6和1.5 mg/mL；紅辣椒提取物的丙酮溶液對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.9、0.9和1.2 mg/mL，最低殺菌濃度分別為1.2、1.2和1.5 mg/mL。

關(guān)鍵詞 黃燈籠辣椒 ；超臨界 ；抑菌

分類號 S641.3

Abstract The supercritical carbon dioxide method was used on red pepper，green pepper and Capsicum chinense for analyze the bacteriostatic action to E. coli， Salmonella and Staphylococcus aureus. Antibacterial test results show that： Capsicum extract inhibitory effect on E. coli and Salmonella are better than green peppers and red peppers； inhibitory effect on Staphylococcus aureus and red pepper equivalent， but less than green peppers. The acetone solution of green pepper extract minimum inhibitory concentration for E.coli， Salmonella， and Staphylococcus aureus were 0.75， 0.6 and 0.9 mg/ml， minimum bactericidal concentrations were 0.9， 0.75 and 1.2 mg/ml. The acetone solution of Capsicum extract minimum inhibitory concentrations for E. coli， Salmonella and Staphylococcus aureus were 0.6， 0.45 and 1.2 mg/ml， respectively， the minimum bactericidal concentration 0.75， 0.6 and 1.5 mg/ml. The acetone solution of red pepper extract minimum inhibitory concentration for E. coli， Salmonella， and Staphylococcus aureus were 0.9， 0.9 and 1.2 mg/ml， minimum bactericidal concentrations were 1.2， 1.2 and 1.5 mg/ml.

Keywords Capsicin chinese ； supercritical carbon dioxide method ； bacteriostatic action

黃燈籠辣椒，又名黃帝椒，中國辣椒，多年生草本植物，起源于亞馬遜流域，是海南特有的特色品種之一[1]。味辣且有奇香，有巨大藥用價值和開發(fā)潛力[2]。其主要藥用有效成分為辣椒堿類物質(zhì)，辣椒堿具有鎮(zhèn)痛、抑菌、健胃消食、調(diào)節(jié)腸道菌群和提高免疫力的作用，并廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、美容等領(lǐng)域[3-5]。黃燈籠辣椒的超臨界提取物黃燈籠辣椒油樹脂，常溫下為油狀液體，是一種主要成分為辣椒堿的混合物[6]。以紅辣椒、青線椒和黃燈籠辣椒的超臨界二氧化碳提取物為原料，進行體外抑菌試驗，本研究首次比較分析以上3種辣椒油樹脂對雞的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用。以期為后續(xù)在畜禽飼料添加方面的應(yīng)用研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮黃燈籠辣椒，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所蔬菜種質(zhì)圃；鮮紅辣椒，市售；鮮青線椒，市售；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HA221-40-11超臨界CO2萃取裝置，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司；DT302A型電子天平，北京友儀四方科技發(fā)展有限公司；MH肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；SS瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；HZ-9811K型雙速恒溫培養(yǎng)箱，上海百典儀器設(shè)備有限公司；SA-960-2型潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；HVE-50型高壓蒸汽滅菌器，日本Hirayama公司；培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、培養(yǎng)基、過濾器、移液槍頭、試管、稀釋用蒸餾水等使用前均在 121℃下濕熱高壓滅菌20 min。每次開始試驗前，開啟超凈工作臺紫外滅菌燈，滅菌2 h。

1.2 方法

1.2.1 辣椒油樹脂的提取

將鮮黃燈籠辣椒、紅辣椒、青線椒洗凈，剪開，55℃烘干48 h，磨粉，過40目篩，避光保存?zhèn)溆?。?yīng)用超臨界二氧化碳萃取裝置，設(shè)定壓力23 MPa，溫度50℃，流量45 L/h，連續(xù)提取90 min，得到對應(yīng)3種辣椒油樹脂，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 體外抑菌試驗

1.2.2.1 培養(yǎng)基的制備

營養(yǎng)肉湯：稱取營養(yǎng)肉湯干粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min，置于4℃冰箱冷藏備用；

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：稱取培養(yǎng)基干粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min。冷卻至50℃左右，倒入平皿中，待凝固后，置于4℃冰箱冷藏備用。

麥康凱培養(yǎng)基制備同營養(yǎng)瓊脂。

Baird-parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基：稱取Baird-parker瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基干粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，加熱煮沸至完全溶解，121℃高壓滅菌15 min。冷卻至50℃左右，加入亞碲酸鹽卵黃增菌劑，搖勻，倒入平皿中，凝固后，置于4℃冰箱冷藏備用。

SS瓊脂培養(yǎng)基：稱取SS瓊脂培養(yǎng)基干粉于錐形瓶中，加入蒸餾水，加熱煮沸至完全溶解，不需要高壓滅菌，冷卻至50℃左右，倒入平皿中，凝固后，置于4 冰箱冷藏備用。

1.2.2.2 菌種的活化和菌種濃度確定

將大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌冷藏菌種分別接入裝有2 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，37℃培養(yǎng)48 h，得到活化菌懸液?；罨笾糜?℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

取6支試管，編號1～6，分別加入4.5 mL滅菌營養(yǎng)肉湯，取0.5 mL菌懸液加人到裝有4.5 mL的1號試管中（此濃度為0.5 mL/5 mL=0.1，即為10-1），將10-1試管充分搖勻，吹吸菌液數(shù)次使其混勻。用移液槍吸取10-1試管中菌液0.5 mL，加入2號試管，吹吸菌液數(shù)次使其混勻（此濃度為10-2），重復(fù)操作以此類推，稀釋到10-6。

分別吸取4、5、6號試管中的菌液0.2 mL置于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，用涂布器涂板，每一個稀釋濃度菌液平行劃板3個，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，選取菌落數(shù)在30～300的同一稀釋濃度梯度的培養(yǎng)基進行菌落計數(shù)，計算菌落平均數(shù)A。按公式：每毫升中菌落形成單位（cfu）=A×稀釋倍數(shù)×5，計算出菌懸液濃度。取一定量的菌懸液，用滅菌營養(yǎng)肉湯稀釋，配成濃度為10×105 cfu/mL的菌懸液待用。

1.2.2.3 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的確定

根據(jù)各辣椒提取物中辣椒素類物質(zhì)的總含量，取辣椒提取物用0.22 μm微孔濾器過濾后，配成含辣椒素類物質(zhì)濃度為6 mg/mL后備用，其中辣椒堿、二氫辣椒堿以及其他辣椒素類物質(zhì)濃度見表1。

采用數(shù)據(jù)客觀、便于操作的微量稀釋法[7-9]對抑菌效果進行測定：在超凈工作臺上，取10支滅菌試管，分別標(biāo)記為1～10，將辣椒提取物分別配制成3、1.5、1.2、0.9、0.75、0.6、0.45、0.375 mg/mL的營養(yǎng)肉湯稀釋液，分別加入濃度為10×10-5 cfu/mL的大腸桿菌懸液，其中，9號試管為不加辣椒提取物貯備液的陽性對照，10號試管為陰性對照。每個濃度重復(fù)3次。將辣椒提取物分別配制成1.5、1.2、0.9、0.75、0.6、0.45、0.3、0.15 mg/mL的營養(yǎng)肉湯稀釋液，分別加入濃度為10×10-5 cfu/mL的沙門氏菌懸液，其他步驟同上。1.5、1.2、0.9、0.75、0.6、0.45、0.375、0.3 mg/mL的營養(yǎng)肉湯稀釋液，分別加入濃度為10×10-5 cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液，其他步驟同上。將所有試管置于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h，在黑色背景下肉眼觀察試驗結(jié)果。判定MIC的方法參照李漢浠等的方法，試管內(nèi)液體為混濁狀即為有細(xì)菌生長，試管內(nèi)液體呈澄清透明狀即為無菌生長，根據(jù)渾濁與否用“+”、“-”表示。無菌生長的最低辣椒提取物溶液濃度即為最低抑菌濃度（MIC）[10]。

取最低抑菌濃度（MIC）以上各濃度的澄清狀試管內(nèi)液體0.2 mL，用涂布器均勻接種至無菌平皿瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將含有大腸桿菌的液體對應(yīng)接種至麥康凱平皿培養(yǎng)基上，含有沙門氏菌的液體對應(yīng)接種至SS瓊脂平皿培養(yǎng)基上，含有金黃色葡萄球菌的液體對應(yīng)接種至Baird-Parker 瓊脂平皿培養(yǎng)基上，每個樣品做3個重復(fù)，37℃恒溫培育24 h，肉眼觀察試驗結(jié)果，瓊脂培養(yǎng)基中菌落數(shù)少于5個的最低辣椒提取物濃度，即為該辣椒提取物的最低殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒提取物對雞大腸桿菌抑菌效果

紅、青、黃3種辣椒提取物對雞的大腸桿菌均有抑菌效果，且抑菌效果隨著濃度的升高呈增強趨勢。黃燈籠辣椒提取物的抑菌效果優(yōu)于青椒和紅椒，最小抑菌濃度為0.6 mg/mL，辣椒提取物和紅辣椒提取物的最低抑菌濃度分別為0.75和0.9 mg/mL。見表2。

2.2 辣椒提取物對雞沙門氏菌抑菌效果

紅、青、黃辣椒提取物對雞沙門氏菌均有抑制效果，且抑菌效果不同，由強到弱依次為黃燈籠辣椒>青辣椒>紅辣椒。其中，黃燈籠辣椒提取物的抑菌效果尤為顯著，最低抑菌濃度僅為0.45 mg/mL，青辣椒和紅辣椒提取物的最低抑菌濃度分別為0.6和0.9 mg/mL。見表3。

2.3 辣椒提取物對金黃色葡萄球菌抑菌效果

紅、青、黃辣椒提取物對雞沙門氏菌均有抑制效果，且抑菌效果存在差異，青辣椒提取物的抑菌效果優(yōu)于紅辣椒和黃燈籠辣椒，為0.9 mg/mL，紅辣椒提取物和黃燈籠辣椒提取物的最低抑菌濃度分別為1.2 mg/mL。見表4。

2.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）

紅、青、黃3種辣椒提取物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度見表5。

3 討論與結(jié)論

本試驗研究表明，超臨界二氧化碳萃取法所得的紅、青、黃3種辣椒提取物都具有對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的抑制作用。其中，青辣椒提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.75、0.6和0.9 mg/mL，最低殺菌濃度為0.9、0.75和1.2 mg/mL；黃燈籠辣椒提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.6、0.45和1.2 mg/mL，最低殺菌濃度為0.75、0.6和1.5 mg/mL；紅辣椒提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為0.9、0.9和1.2 mg/mL，最低殺菌濃度為1.2、1.2和1.5 mg/mL。

Wahba等[11]的研究結(jié)果表明，辣椒可以有效抑制大腸桿菌、沙門氏菌和酵母菌的增長繁殖。吳影等[12]的研究表明，辣椒堿對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、啤酒酵母菌、黑曲霉和青霉菌等在酸堿條件下均有顯著抑制效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著高于大腸桿菌。梁麗鵬等[13]的研究表明，辣椒堿浸取物對6種常見菌有抑制效果，尤其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、啤酒酵母抑制作用明顯，且抑菌效果與辣椒堿浸取物的濃度呈正相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)均在0.85以上。與本試驗的結(jié)果一致。

劉銳等[14]的研究表明，辣椒的乙醇提取物對沙門氏菌等6種菌類有顯著抑制作用。Dorantes等[15]證明，辣椒提取物對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等5種菌有抑制作用，其有效成分之一可能為肉桂酸類物質(zhì)。這與本試驗的研究結(jié)果一致。

曹曉等[16]的辣椒乙醇提取物試驗證明，辣椒對金黃色葡萄球菌等12種常見菌有選擇性抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.25 mg/mL。這與本試驗的定量試驗結(jié)果存在偏差，可能與所用提取溶劑不同有關(guān)，也可能與乙醇溶液本身存在抑菌效果有關(guān)。

綜上所述：黃燈籠辣椒提取物對雞大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果均優(yōu)于青辣椒和紅辣椒；對金黃色葡萄球菌的抑菌作用與紅辣椒相當(dāng)，但低于青辣椒。

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