安玉婷 李然紅 陳鑫 劉丹

摘要：利用生物信息學(xué)方法，對(duì)白樺BpPRI理化性質(zhì)、親水/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及與其他植物PRI蛋白的同源性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，同時(shí)對(duì)該基因啟動(dòng)子的順式作用元件以及基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，①BpPR1的cDNA全長(zhǎng)為816 bp，CDS為53lbp，編碼由176個(gè)氨基酸構(gòu)成的穩(wěn)定親水性蛋白，存在跨膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu)，屬于CAP蛋白家族的一員。白樺BpPR1與葡萄、棗親緣關(guān)系較近;②BpPR1基因組結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子;③BpPR1啟動(dòng)子含有多個(gè)真核生物啟動(dòng)子的基本元件CAAT-box和TATA-box，還含有與低溫響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、細(xì)胞分裂素響應(yīng)相關(guān)的響應(yīng)元件以及MYBHvl結(jié)合位點(diǎn)等，說(shuō)明該蛋白可能受多種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控，參與生物與非生物脅迫過(guò)程。

關(guān)鍵詞：白樺（Betula platyphylla）;病程相關(guān)蛋白;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（ 2020）12-0171-04

DOI：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.12.038

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

白樺（Betula platyphylla）為樺木科樺木屬落葉木本植物，在亞歐大陸中分布較多。而在中國(guó)，其主要分布于東北、華北及西北等地區(qū)[1]。白樺具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、材質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，已成為當(dāng)今社會(huì)最有應(yīng)用價(jià)值及發(fā)展?jié)摿Φ臉?shù)木種類(lèi)之一，對(duì)白樺相關(guān)研究也越來(lái)越受到重視[2]。同時(shí)，白樺形態(tài)優(yōu)美、表面光潔，常作為城市綠化樹(shù)種[3]。白樺皮及白樺汁具有很高的藥用價(jià)值，近年來(lái)，白樺已被列入重點(diǎn)的科技研究項(xiàng)目之一[4]。植物病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis—related protein，PR）是植物在生物或非生物脅迫下產(chǎn)生的一類(lèi)抵御不良環(huán)境的蛋白總稱。PR蛋白最早在煙草中被發(fā)現(xiàn)，在病毒侵染植株后產(chǎn)生，并且在侵染及未侵染部位PR基因都有大量表達(dá)[5]。PR廣泛存在于動(dòng)物、植物中，在單子葉和雙子葉植物中存在更為廣泛，由17個(gè)蛋白家族組成，其中，已被發(fā)現(xiàn)功能的有PR2（β一1，3一葡聚糖酶）、PR3（幾丁質(zhì)酶）、PR5（類(lèi)甜蛋白）、PR6（蛋白酶抑制劑）、PR7（蛋白內(nèi)切酶）、PR9（過(guò)氧化物酶）、PRlO（類(lèi)核糖核酸酶）、PR12（防衛(wèi)素）、PR13（硫素）、PR14（脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）等。當(dāng)植物受到病原體感染時(shí)，PR的表達(dá)量顯著提高[6-8}。PR1作為病程相關(guān)蛋白家族成員之一，現(xiàn)已經(jīng)被證實(shí)具有抵抗真菌入侵、限制病毒擴(kuò)散及抵御逆境脅迫能力等功能。白樺類(lèi)病斑突變體Imd對(duì)半知菌亞門(mén)的鏈格孢菌[ Alternaria alternata（ Fr.） Keissler]具有顯著抗性，BpPR1基因表達(dá)量在病原菌入侵時(shí)顯著提高。[9]。

本研究參考白樺轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)[10]，獲得白樺BpPR1基因的序列信息，利用生物信息學(xué)方法對(duì)其理化性質(zhì)、疏水性/親水性、蛋白結(jié)構(gòu)功能域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)及同源性等進(jìn)行了預(yù)測(cè)，對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與其他植物PR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

白樺BpPR1基因啟動(dòng)子和基因序列從CoCe網(wǎng)站獲得（ https：//genomevolution.org/coge/）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）、葡萄（Vitis vinifera）、核桃（Juglans regia）和毛果楊（Populus trichocarpa）的基因結(jié)構(gòu)信息從CoGe網(wǎng)站獲得。葡萄、棗（Ziziphusjujuba）、榴蓮（Durio zibethinus）、毛白楊（PoprLILLs to-mentosa）、橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）、耬斗菜（Aquile-gia viridiflora）、豇豆（Vigna unguiculata）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、核桃（Juglans regia）、可可（Theobroma cacao）、鼠尾草（Herrania umbratica）、紅車(chē)軸草（Trifolium pratense）、花芽龍眼（Dimocarpus longan）、克萊門(mén)柚（Citrus clementina）、毛果楊（Popu-lus trichocarpa），木豆（Cajanus cajan）、栓皮櫟（Quer-cus suber）等植物基因信息在NCBI（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。

1.2 方法

本研究中用到的軟件及網(wǎng)址見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺BpPR1基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件GSDS（http：//gsds. cbi. pku. edu.cn）[11]對(duì)BpPR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并與擬南芥、葡萄、毛果楊、核桃等植物的PR1基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果（圖1）表明，BpPR1基因中有3個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，CDS為531 bp;毛果楊、擬南芥PR1基因中都含有一個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子，CDS長(zhǎng)度為485 bp;葡萄PR1基因的CDS也為485 bp，但沒(méi)有內(nèi)含子;核桃PR1基因沒(méi)有內(nèi)含子，CDS為503 bp;擬南芥、葡萄、毛果楊PR1基因的CDS都是485 bp，其基因結(jié)構(gòu)的差別在于內(nèi)含子不同。

2.2 白樺BpPR1理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用ProtParam軟件對(duì)白樺BpPRI的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，BpPR1基因cDNA全長(zhǎng)為816 bp，基因編碼區(qū)（CDS）為cDNA序列中第37至661個(gè)堿基，共編碼176個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量19 265.90D，理論等電點(diǎn)為8.93，負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Clu）為10，正電荷殘基總數(shù)（ Arg+Lys）為15，分子式為C842：H1312 N246，O250，S12，總原子數(shù)2 662，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index，Ⅱ）為31.7，脂肪系數(shù)（Aliphatic in-dex）為1.36，平均親水性（GRAVY）水平為-0.178，說(shuō)明該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白中含量最多的氨基酸為纈氨酸，占1 1.4%，其次為甘氨酸，占9.7%，含量最少的為谷氨酸和苯丙氨酸，分別為1.7%和1.1%。通過(guò)ProtScale軟件分析預(yù)測(cè)，該蛋白質(zhì)整個(gè)肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為3.311，在第11個(gè)氨基酸處，最小值為-2.656，在第265個(gè)氨基酸處，氨基酸的負(fù)值分值大，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水性蛋白（圖2）。

2.3 BpPR1信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SignaIP-4.1預(yù)測(cè)BpPRI信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）表明，原始剪切位點(diǎn)的分值（C值）在第25個(gè)氨基酸時(shí)有最大值，為0.445，信號(hào)肽的分值（S值）在第14氨基酸時(shí)有最大值，為0.990，綜合剪切位點(diǎn)的分值（Y值）在第25個(gè)氨基酸時(shí)有最大值，為0.644，其D-cut off為0.717 06（>0.5），表明BpPRI蛋白含有信號(hào)肽，存在跨膜運(yùn)輸結(jié)構(gòu)。

2.4 BpPR1二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)是指肽鏈由氫鍵構(gòu)成有規(guī)則的卷曲折疊具有周期性的空間結(jié)構(gòu)，使用SOPMA對(duì)白樺BpPRI二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，該蛋白9.83%可能會(huì)形成螺旋（Helix），27.12%可能形成延伸鏈（ Strand），4.14%可能形成轉(zhuǎn)角（Turn），58.64%為無(wú)規(guī)卷曲（Random coil），無(wú)二硫鍵的形成，沒(méi)有特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對(duì)BpPR1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)（圖4），不同類(lèi)型二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊，形成具有空穴的高級(jí)結(jié)構(gòu)，可能是某些互作物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。

2.5 氨基酸序列同源性對(duì)比

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別搜索葡萄、棗、榴蓮、毛果楊、榴蓮、橡膠樹(shù)、耬斗菜、豇豆、菜豆、核桃、可可、鼠尾草、紅車(chē)軸草、花芽龍眼、克萊門(mén)柚、毛果楊、木豆、栓皮櫟等17種植物的PRI序列，與白樺BpPRI氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果（圖5）表明，病程相關(guān)蛋白BpPRI與葡萄、棗親緣關(guān)系較近，而與榴蓮、毛白楊等植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.6 白樺BpPR1基因啟動(dòng)子序列分析

利用PlantCare對(duì)白樺BpPR1基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件進(jìn)行分析。結(jié)果（表2）表明，BpPR1基因含有多個(gè)真核生物啟動(dòng)子的基本元件CAAT-box和TATA-box，含有茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件、光響應(yīng)順式作用元件、低溫響應(yīng)的順式反應(yīng)原件、脫落酸響應(yīng)的順式作用原件、MYBHvl結(jié)合位點(diǎn)、生長(zhǎng)素響應(yīng)的順式作用元件、水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、細(xì)胞分裂素的順式作用元件等，說(shuō)明PR1基因與逆境脅迫密切相關(guān)。乙烯（ET）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）是誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病性重要的信號(hào)分子，可誘導(dǎo)植物中PRI的表達(dá)[12，13]。白樺BpPR1基因與多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑響應(yīng)有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

病程相關(guān)蛋白是植物中一類(lèi)重要的蛋白，植物在受到病原體侵染時(shí)，水楊酸（ Salicylicacid，SA）、茉莉酸（ Jasmonicacid，JA）、乙烯（Ethylene，ET）等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑含量會(huì)隨之改變，同時(shí)PR基因會(huì)選擇性表達(dá)‘14.15]。PR1作為病程相關(guān)基因重要的一員，對(duì)其結(jié)構(gòu)功能的研究也在逐步進(jìn)行。侯麗霞等[16]研究表明葡萄PRI可對(duì)多種脅迫產(chǎn)生響應(yīng)應(yīng)答，霜霉病菌、低溫、鹽、干旱、水楊酸、脫落酸、茉莉酸、一氧化氮、過(guò)氧化氫和硫化氫等可誘導(dǎo)其大量表達(dá)。馬立功等[17]對(duì)向日葵的研究發(fā)現(xiàn)PR1在鹽脅迫、干旱脅迫、核盤(pán)菌及其代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)下可上調(diào)表達(dá)，將該基因轉(zhuǎn)接到煙草中，獲得轉(zhuǎn)基因煙草，轉(zhuǎn)基因植株也提高了對(duì)核盤(pán)菌的抗性。PR1基因的表達(dá)受多種基因調(diào)控，PR1基因是否具有抗病性與其基因結(jié)構(gòu)有關(guān)。張凱敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)剛毛檉柳的TbPR1基因的編碼區(qū)長(zhǎng)為537 bp，共編碼178個(gè)氨基酸，與白樺BpPR1較為接近。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)葡萄中煙草野火病菌只有在堿性PRI存在的情況下才不表達(dá);Bonasera等[20]將PR1基因轉(zhuǎn)入到蘋(píng)果中，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果植株并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)相應(yīng)病菌的抗性。PR蛋白基因不僅具有一定的抗病功能，同時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)、抵抗逆境脅迫、抗植株衰老及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)等方面同樣發(fā)揮著至關(guān)重要作用。

本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法對(duì)BpPR1的基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件、理化性質(zhì)及同源性等進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明，BpPR1的cDNA全長(zhǎng)為816 bp，CDS為531 bp，編碼176個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為8.93，為堿性蛋白質(zhì)，理論上具有較高的抗菌性。對(duì)其同源性進(jìn)行比對(duì)，BpPRI與葡萄、棗親緣關(guān)系較近。BpPR1基因結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，與擬南芥、毛果楊等PR1基因結(jié)構(gòu)有所不同，但其編碼區(qū)大小差別不大。PR蛋白是受多基因調(diào)控的蛋白質(zhì)，不同植物的表達(dá)量存在相對(duì)差異。對(duì)啟動(dòng)子順式反應(yīng)原件進(jìn)行分析得到，BpPRI中含有茉莉酸甲酯響應(yīng)的順式作用元件、光響應(yīng)順式作用元件、低溫響應(yīng)的順式反應(yīng)原件、脫落酸響應(yīng)的順式作用原件、MYBHvl結(jié)合位點(diǎn)、生長(zhǎng)素響應(yīng)的順式作用元件、水楊酸響應(yīng)的順式作用元件、細(xì)胞分裂素的順式作用元件等，說(shuō)明BpPRI參與多種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答，該蛋白如何通過(guò)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑響應(yīng)調(diào)控白樺抗病性還有待進(jìn)一步研究。

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基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31800558）

作者簡(jiǎn)介：安玉婷（1991-），女，黑龍江安達(dá)人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参飳W(xué)，（電話）18904534279（電子信箱）swxanyuting@126.com;通信作者，李然紅，（電話）18504539007（電子信箱）swxlrh@126.com。