張文芳，胡梅，陳錦霞，林碧珊

(國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528303)

白術(shù)系菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz．的干燥根莖，性溫，味苦、甘，具健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎之功，用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安等[1]。主產(chǎn)于浙江、安徽，以浙江鄞縣、新昌地區(qū)產(chǎn)量最大，又以于潛(地處浙江臨安附近)所產(chǎn)品質(zhì)最佳[2]。主要含揮發(fā)油、內(nèi)酯類、有機(jī)酸、多糖及其他化學(xué)成分[3]。

近年來對(duì)白術(shù)成分的研究，多集中在揮發(fā)油、多糖、內(nèi)酯等[4～10]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)中同時(shí)含有多種有機(jī)酸類成分[11-12]，而植物的酚酸類成分在抑菌、抗感染等方面的報(bào)道越來越多[13-14 ]，且可在藥物中共同發(fā)揮藥理活性。白術(shù)酚酸類成分的相關(guān)報(bào)道不多，為保證白術(shù)臨床使用療效，本研究建立了同時(shí)測定其新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，為建立科學(xué)、合理、可控的白術(shù)活性成分質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)參考。

1 儀器與試藥

Acquity UPLC液相系統(tǒng)(四元低壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，Waters公司)；Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm，3 μm)；MS105DU、AL104型電子分析天平 (梅特勒-托利多公司)； KQ-500DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Synergy UV型超純水制備儀(Millipore公司)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)110753-201716，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%)來源于中國食品藥品檢定研究院，隱綠原酸對(duì)照品(批號(hào) DST170210-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%)、新綠原酸對(duì)照品(批號(hào)DST180130-015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%)均來源于成都德思特生物技術(shù)有限公司。超純水由Millipore純水儀制備；其他試藥均為分析純。15批白術(shù)批號(hào)及產(chǎn)地來源見表1，經(jīng)本單位質(zhì)管部黃國滿制藥助理工程師檢驗(yàn)，結(jié)果均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定。

表1 15批白術(shù)樣品來源信息Table 1 Sources of 15 batches of Atractylodes macrocephalae rhizome

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)H3PO4(B)，洗脫梯度(0～4 min，1%A→6%A; 4～10 min，6%A→9%A; 10～16 min，9%A→18%A; 16～22 min，18%A→20%A; 22～23min，20%A→90%A)；柱溫：25 ℃；流速：0.25 mL/min；檢測波長：325 nm；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取新綠原酸和隱綠原酸對(duì)照品各10 mg，分別置2個(gè)20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用；另取綠原酸對(duì)照品10 mg，置20 mL容量瓶中，加甲醇適量，使溶解，精密加入新綠原酸和隱綠原酸對(duì)照品溶液各2 mL，用甲醇稀釋至刻度，即得。 請(qǐng)明確寫出混合對(duì)照品溶液中新綠原酸、隱綠原酸的質(zhì)量濃度。

2.2.2 供試品溶液的制備 取白術(shù)樣品粉末(過3號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品、供試品溶液，取空白溶劑，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果表明，白術(shù)供試品溶液中3種酚酸類成分的分離度和理論塔板數(shù)均符合要求。見圖1。

1.新綠原酸； 2.綠原酸； 3.隱綠原酸。

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取混合對(duì)照溶液(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.099、0.983、0.099 5 mg/mL)0.05、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，即得各質(zhì)量濃度溶液；精密量取各線性溶液1 μL，注入超高效液相色譜儀，分別以峰面積為縱坐標(biāo)，待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 3種酚酸類成分的線性關(guān)系考察結(jié)果 Table 2 The linear relationship of three phenolic acids

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(S1)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD值分別為0.7%、 0.1%、0.7%，均低于2%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一白術(shù)樣品(S1)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h 各進(jìn)樣1次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積的RSD值分別為0.5%、0.2%、0.6%，均低于2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一白術(shù)樣品(S1)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.067、1.171、0.084 mg/g， 其RSD值分別為0.3%、0.7%、0.4%，均低于2%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)同一批次白術(shù)樣品(S1)6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品溶液0.6、1、0.8 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 白術(shù)中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the recoveries of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in Atractylodes macro-cephalae rhizome(n=6)

2.9 不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中3種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

取15 批不同產(chǎn)地白術(shù)樣品，各稱取白術(shù)藥材粉末(過3號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置燒瓶中，精密加30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算3種待測成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表4。15批藥材的新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.19～2.14 mg/g范圍內(nèi)。

表4 15批白術(shù)中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 4 The contents of neochlorogenic acid,chlorogenic acid and cryptochlorogenic acid in 15 batches Atractylodes macrocephalae rhizomew/(mg·g-1)

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別考察了不同檢測波長、流動(dòng)相、柱溫、流速、色譜柱對(duì)色譜峰分離效果的影響，最終確定色譜條件。

3.1.1 檢測波長的選擇 通過DAD檢測器對(duì)供試品溶液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，綜合考慮3種成分的吸收波長，發(fā)現(xiàn)在325 nm波長處各色譜峰的峰面積均較大，因此選擇325 nm作為檢測波長。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 考察了甲醇-水、乙腈-水，甲醇-0.1%H3PO4、乙腈-0.1%H3PO4為流動(dòng)相的分離效果，發(fā)現(xiàn)在乙腈-水體系下峰形較寬，甲醇-水和甲醇-0.1%H3PO4體系產(chǎn)生的柱壓較高，故不進(jìn)一步考察；乙腈-0.1%H3PO4為流動(dòng)相時(shí)，色譜中各待測成分均能達(dá)到很好分離，故確定為洗脫流動(dòng)相。

3.1.3 柱溫、流速的選擇 分別比較了柱溫為20、25、30 ℃，流速分別為0.20、0.25、0.30 mL/min時(shí)的分離效果，結(jié)果表明柱溫為25 ℃、流速為0.25 mL/min時(shí)，分離效果比較好。

3.1.4 色譜柱的選擇 考察了Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)、Thermo BDS HYPERSIL C18(2.1 mm×50 mm，3 μm)2種類型色譜柱，以及3種不同批號(hào)Waters BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)色譜柱的分離效果，結(jié)果顯示均有較好的分離度，表明不同色譜柱的耐用性均較好。

3.2 提取條件的優(yōu)化

分別考察了不同提取溶劑(水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、甲醇、10%乙醇、30%乙醇)、提取方法(回流、超聲)、提取時(shí)間(30、40、60、90、120 min)對(duì)白術(shù)中3種成分提取效果的影響，結(jié)果顯示30%乙醇回流提取40 min效果最佳。

對(duì)白術(shù)主產(chǎn)區(qū)浙江省金華市，河北省保定市，安徽省亳州市、宿州市、宣城市，河南省焦作市，重慶市秀山縣，湖南省、湖北省等產(chǎn)區(qū)白術(shù)中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定，結(jié)果表明不同產(chǎn)地白術(shù)中3種指標(biāo)類成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別較大，從高到低分別是河北省保定市(3批均值1.76 mg/mL)>河南省焦作市(2批均值0.86 mg/mL)>安徽省(4批均值0.35mg/mL)>重慶市秀山縣(3批均值0.33mg/mL)>浙江省金華市(3批均值0.26 mg/mL)，提示不同產(chǎn)地白術(shù)中有機(jī)酸類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定差異。綠原酸、隱綠原酸和新綠原酸三者結(jié)構(gòu)相似[15]，其藥理作用基本一致，故本研究建立的UPLC法同時(shí)測定白術(shù)中三種酚酸類物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)，方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于控制白術(shù)的質(zhì)量。