李昆陽 劉華一

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜固有腺體萎縮、減少為主的一類疾病，甚至發(fā)展為伴腸上皮化生和(或)異型增生的癌前病變。CAG屬Correa級聯(lián)反應(yīng)的中央階段，對于疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸具有重要的承接作用，積極治療對胃癌的防治具有重要臨床意義。然而，目前西醫(yī)尚未有統(tǒng)一、規(guī)范、有效的治療方案，多采用抗炎、殺菌、抑酸、助消化、黏膜保護(hù)等方法緩解癥狀，對于萎縮病理狀態(tài)的改變?nèi)匀狈μ匦?，僅通過具有生物活性功能的維生素、葉酸及微量元素改善胃黏膜狀態(tài)，以求延緩其進(jìn)展。中醫(yī)方劑具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點在治療該疾病中具有巨大優(yōu)勢，不僅能夠明顯改善癥狀，及時阻斷病程發(fā)展[1-3]，甚至能夠逆轉(zhuǎn)萎縮[4]。究其癥狀，CAG類屬中醫(yī)“胃痞”范疇，病程纏綿，“久病必虛，久病必瘀”且“陽明為多氣多血之腑”，“氣虛血瘀”貫穿CAG的整個疾病過程，故在補(bǔ)脾、疏肝、消積、理氣辨證治療基礎(chǔ)上加以活血、行氣、祛瘀之法。

丹參飲載于《時方歌括》，由丹參、檀香、砂仁組成，“治心痛、胃脘諸痛多效”，為行氣活血的代表方劑。方中重用丹參一兩為君，取其“專入血分，活血行血，內(nèi)達(dá)臟腑而化瘀滯”之功；檀、砂各用一錢為佐，檀香調(diào)脾胃、利胸膈，為理氣之要藥；砂仁理元?dú)狻⑼?，醒脾養(yǎng)胃；三藥合用，行氣活血而瘀自散，為行氣化瘀止痛之良方?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參飲具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種作用，臨床上廣泛應(yīng)用于CAG、消化性潰瘍等多種脾胃病的治療中，能夠有效改善氣虛血瘀癥狀[5-7]。但目前對其作用于疾病的活性物質(zhì)和特定的分子機(jī)制知之甚少，值得進(jìn)一步深入探究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種涵蓋化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和傳統(tǒng)藥理學(xué)的新方法，可更系統(tǒng)地揭示中藥的活性成分和潛在機(jī)制，從整體探索中藥和機(jī)體的相互作用[8]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究丹參飲治療CAG的有效成分、作用靶點及潛在機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 丹參飲化學(xué)成分的收集、篩選和靶點預(yù)測

通過檢索TCMSP[9]獲得丹參、檀香、砂仁已知的全部化學(xué)成分，以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為條件，篩選出丹參飲的主要活性成分；通過PubChem獲得活性成分的SMILES；檢索Swiss Target Prediction[10]，獲得相關(guān)靶點信息；與TCMSP獲得成分靶點合并去重，即可獲得丹參飲主要活性成分的相關(guān)靶點。

1.2 CAG靶點檢索

本研究以“Gastritis、Atrophic”為關(guān)鍵詞分別檢索DrugBank、DisGeNET、Genetic Association Database(GAD)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)數(shù)據(jù)庫，去除假陽性后合并去重，即為CAG相關(guān)靶點。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

通過UniProt數(shù)據(jù)庫將所有靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，得到其官方名稱及UniProt ID，用于后續(xù)分析工作。將丹參飲活性成分相關(guān)靶點與CAG相關(guān)靶點相映射，可獲得丹參飲治療CAG的潛在作用靶點。根據(jù)上述靶點預(yù)測結(jié)果，采用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建丹參飲“活性成分-作用靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點(node)代表活性成分、靶點；邊(edge)連接活性成分與靶點，展現(xiàn)兩者之間的關(guān)系。

1.4 富集分析

本研究利用 DAVID(Version 6.8)平臺對共同靶點進(jìn)行Gene ontology(GO)注釋分析和Pathway分析，用于描述候選靶點特征; 運(yùn)用Omicshare云平臺將結(jié)果可視化。其中GO注釋包括生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)，KEGG通路分析結(jié)果以氣泡圖形勢呈現(xiàn)富集結(jié)果的通路，以探究丹參飲治療CAG可能的作用機(jī)制。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

蛋白質(zhì)通常與脂質(zhì)、核酸和其他蛋白質(zhì)等共同發(fā)揮作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)有助于了解各種蛋白質(zhì)在復(fù)雜疾病中的作用，運(yùn)用Cytoscape軟件中Bisogenet插件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并將結(jié)果可視化。分別構(gòu)建丹參飲活性成分相關(guān)靶點及CAG相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)；Merge獲取2個網(wǎng)絡(luò)的交集，即為丹參飲治療CAG的直接或間接靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6 核心靶點篩選及聚類分析

網(wǎng)絡(luò)中的每個節(jié)點均有自由度(degree centrality，DC)、中心中介性(betweenness centrality，BC)、緊密度(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、網(wǎng)絡(luò)中心性(network centrality，NC)和局部邊連通性(loal average connectivity，LAC)等參數(shù)信息，可通過network analyzer、CytNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析評估。先以“DC≥2中位數(shù)DC”為篩選條件，然后選擇BC、CC、DC、EC、LAC、NC均大于中位數(shù)的節(jié)點為核心靶點。

人類機(jī)體復(fù)雜，由多個相對獨(dú)立而又相互作用的功能模塊組成，聚類分析作為一種重要的分類方法可以清楚展現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)中的固有規(guī)律，MCODE算法生成的模塊穩(wěn)定可靠，將篩選出的核心靶點以K-core≥4為條件篩選出聚類較好的基因模塊，從多角度解釋丹參飲治療CAG的機(jī)理。

2 結(jié)果

2.1 丹參飲活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到437個丹參飲成分，篩選后得到78個主要活性成分；另納入12種上述三種藥物中含量較高的成分，剔除不含相關(guān)信息的化學(xué)成分后，最終確定丹參飲86個活性成分，其中丹參67個、檀香7個、砂仁14個，丹參與檀香、丹參與砂仁各有一個共同活性成分，具體成分信息見表1。

表1 丹參飲中潛在活性成分表

續(xù)表

續(xù)表

2.2 丹參飲作用靶點

檢索、去重后共得到丹參飲有效靶點355個，其中丹參304個、砂仁147個、檀香123個，三味藥共同作用靶點57個，占全部藥物的16.1%，丹參、檀香共同靶點25個(7%)，丹參、砂仁共同靶點51個(14.4%)，砂仁、檀香共同靶點4個(1.1%)，可見不同藥物可通過相同的作用靶點共同發(fā)揮作用。degree值代表與該節(jié)點相連的邊的條數(shù)，越大則表明在網(wǎng)絡(luò)中越關(guān)鍵，圖中節(jié)點顏色隨著degree值的變大而逐漸加深，可直觀看出相對主要活性成分和重要靶點(圖1)。

2.3 丹參飲治療CAG的潛在作用靶點

檢索DrugBank、DisGeNET、GAD、OMIM分別得到14個、118個、46個和15個CAG相關(guān)靶點，去除重復(fù)后共得到165個CAG相關(guān)靶點。與丹參飲主要成分的作用靶點相映射，構(gòu)建“丹參飲-作用靶點-CAG”網(wǎng)絡(luò)，139條邊連接99個節(jié)點(圖2)，75個丹參飲成分通過作用于24個靶點對CAG起到直接治療作用，其中62個成分作用于PTGS2,29個成分作用于PPARG，NR1H2、DRD2、EGFR、TNF等靶點也被多個成分所調(diào)節(jié)，木犀草素、丹參酮IIA、丹參新醌D、β-谷甾醇、Glimepiride等活性成分調(diào)節(jié)多個靶點，由此可見中藥治療疾病多成分、多靶點的特點。

2.4 丹參飲治療CAG的生物功能分析

為了深入了解丹參飲對CAG的藥理作用機(jī)制，對24個共同靶點(PTGS2、PPARG、NR1H2、DRD2、EGFR、TNF、CYP1A2、BCL2、CYP2C19、TP53、ABCB1、AKT1、CYP2B6、CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、GSTP1、HSPA2、IL2、IL6、MIF、ODC1、SOD1、VEGFA)進(jìn)行了GO和KEGG通路分析，得到235個GO注釋結(jié)果和56條通路。其中16個BP、10個CC、8個MF具有重要意義(圖3)，其生物功能主要與物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖與凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原等相關(guān)，這體現(xiàn)出丹參飲通過調(diào)控多個復(fù)雜的生物過程來治療CAG。 以P<0.05為條件，共得到48條重要通路(圖4)，其中多與代謝、癌癥、炎癥相關(guān)，排名在前10的通路依次為：藥物代謝細(xì)胞P450、化學(xué)致癌、亞油酸代謝、癌癥通路、花生四烯酸代謝、細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的異生素代謝、HIF-1信號通路、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、PI3K-Akt信號通路、麻疹。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點

為了全面探究丹參飲治療CAG的核心藥理機(jī)制，課題組采用拓?fù)浞椒ㄔu估核心網(wǎng)絡(luò)，共得到關(guān)鍵節(jié)點156個，篩選策略示意圖見圖5。

2.6 聚類分析

將上述156個關(guān)鍵靶點，運(yùn)用MCODE 插件進(jìn)行聚類分析，得到5個聚類較好的模塊，然后對各個模塊進(jìn)行富集分析，GO結(jié)果所涉及的生物過程依次為：物質(zhì)代謝，基因表達(dá)、沉默和復(fù)制，DNA、RNA損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控。KEGG通路共37條，多與癌癥相關(guān)，不同模塊富集到相同的通路有核糖體、細(xì)胞周期、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解、PI3K-Akt信號通路、前列腺癌、病毒致癌、癌癥通路。

注：A為丹參的“成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)；B為砂仁的“成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)；C為檀香的“成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)；D為三味藥“成分—靶點”的韋恩圖。菱形—成分、圓形—靶點、藍(lán)色—丹參、黃色—砂仁、綠色—檀香。

注：菱形—成分、圓形—靶點、藍(lán)色—丹參、黃色—砂仁、綠色—檀香。

圖3 丹參飲活性成分治療CAG潛在靶點的GO生物學(xué)過程

圖4 丹參飲活性成分治療CAG潛在靶點的KEGG通路分析結(jié)果示意圖

圖5 丹參飲治療CAG的PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點篩選示意圖

3 討論

本研究篩選出丹參飲86個活性成分、355個潛在靶點，與165個CAG靶點相映射，得到24個共同靶點，包括多種功能酶、信號分子、轉(zhuǎn)錄因子等物質(zhì)；富集分析得到生物功能235個、信號通路56條，發(fā)現(xiàn)丹參飲的75個有效成分主要通過調(diào)控PTGS2、PPARG、NR1H2、DRD2、EGFR、TNF等相關(guān)靶點蛋白，干預(yù)機(jī)體的氧化還原、物質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡等生物途徑，并可能通過缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)、PI3K-Akt等信號通路來治療CAG，并抑制其發(fā)展為胃癌。

CAG作為一個臨床復(fù)雜疾病，為更全面探討其機(jī)理，本研究又構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)浞治?，將拓?fù)涞玫降?56個關(guān)鍵靶點進(jìn)行聚類分析，得到5個模塊，并對這5個模塊進(jìn)行富集分析。結(jié)果顯示，GO生物過程除了之前得出的物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖凋亡外，還增加了基因表達(dá)、沉默和復(fù)制，DNA、RNA損傷修復(fù)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及蛋白質(zhì)合成。KEGG通路仍主要富集在癌癥及與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞周期、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解、PI3K-Akt等信號通路上。

CAG萎縮分布不均勻，胃黏膜同時存在多種病理狀態(tài)，其發(fā)生發(fā)展是一個多階段、多因素、受多基因作用的復(fù)雜過程，而丹參飲可從多層次、多角度參與到胃黏膜的組織修復(fù)，這與其他研究結(jié)果所顯示的丹參飲能夠提高機(jī)體抗氧化能力，減輕細(xì)胞壞死及凋亡，改善胃黏膜微環(huán)境缺血缺氧狀態(tài)等作用也具有一致性[11-12]。丹參飲通過調(diào)節(jié)多個生物過程來治療CAG，與中醫(yī)通過辨證論治，治病求本，調(diào)節(jié)“體質(zhì)”的觀點也不謀而合。

本研究發(fā)現(xiàn)丹參飲治療CAG的作用機(jī)制主要體現(xiàn)在控制炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。(1)核心靶點均與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。其中PTGS2催化花生四烯酸產(chǎn)生多種炎性前列腺素，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，并與細(xì)胞粘附增加、表型變化、細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成密切相關(guān)[13-14]；PPARG是脂肪代謝和葡萄糖穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能調(diào)節(jié)MAPK p38、IL-6的磷酸化，其活化能促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和增殖，并抑制NF-κB介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[15-16]；核受體NR1H2可監(jiān)測內(nèi)源性甾醇水平以維持全身膽固醇水平，并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并能夠抑制細(xì)胞增殖[17-18]；多巴胺受體DRD2參與自主運(yùn)動、情緒及激素調(diào)節(jié)、多巴胺誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)和腫瘤等眾多生物過程，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、自噬、凋亡都密切相關(guān)[19-20]；受體酪氨酸激酶EGFR編碼表皮生長因子受體，通過其多種配體結(jié)合促發(fā)關(guān)鍵細(xì)胞磷酸化，激活至少4個下游信號級聯(lián)，包括RAS/RAF/MEK/ERK、PI3K/AKT、PLCγ/PKC、STATs，也可以激活NF-κB信號級聯(lián)反應(yīng)，還可直接磷酸化其他蛋白質(zhì)、酶及受體，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和分化[21-23]；TNF主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞死亡，在特定條件下可以刺激細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，是重要的炎癥介質(zhì)，并參與某些自身免疫病的病理損傷[24-26]。(2)富集分析結(jié)果中多種生物過程和通路都與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)。除了各種疾病通路外，顯著富集于HIF-1、PI3K/Akt、TNF、MAPK、VEGF等通路上。缺氧是腫瘤微環(huán)境中驅(qū)動腫瘤發(fā)生的最常見原因之一，HIF-1對維持氧穩(wěn)態(tài)起主要調(diào)節(jié)作用，其過表達(dá)與STAT3、NF-κB、TLR4、Myc、mTOR、AP-1、IGF-1、Wnt、TGF-β、Notch1等的激活都密切相關(guān)，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)、血管生成、細(xì)胞增殖凋亡、遷移和侵襲、物質(zhì)代謝而在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[27-28]。PI3K-Akt信號通路經(jīng)常在各種人類癌癥中被激活，PI3K催化PIP3的產(chǎn)生，PIP3作為第二個信使激活A(yù)kt，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能；PI3K/Akt/NF-κB/BMP-2-Smad軸、PTEN/PI3K/Akt軸、PI3K/Akt-mTOR等多種途徑均可調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移、存活和自噬[29-30]。機(jī)體內(nèi)各種反應(yīng)錯綜復(fù)雜，通路之間互相關(guān)聯(lián)影響，丹參飲通過調(diào)節(jié)多個靶點和通路，共同發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡。而CAG作為一種慢性炎癥，或(已)發(fā)展為胃癌前病變，抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的增殖和凋亡對防止該病轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴┚哂兄匾饬x。

中醫(yī)藥符合現(xiàn)代精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中個體化治療的理念，但在分子生物學(xué)水平上證明其治療效果仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)?！岸喑煞?、多靶點”既是中醫(yī)藥的優(yōu)勢，同時也為基礎(chǔ)研究帶來了不便，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過整合各數(shù)據(jù)庫結(jié)果，建立“藥物—成分—靶點—疾病”關(guān)系預(yù)測模型，系統(tǒng)而整體地去探究藥物治療疾病的作用關(guān)系，符合中醫(yī)的整體觀念，有利于中醫(yī)藥的現(xiàn)代研究和臨床推廣。但是，該方法仍具有一些缺陷，目前現(xiàn)有的中醫(yī)藥相關(guān)數(shù)據(jù)庫存在積累不足、質(zhì)量不高、現(xiàn)有數(shù)據(jù)重復(fù)性不強(qiáng)的局限性，而中醫(yī)藥成分信息的正確性對于網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析結(jié)果至關(guān)重要；另外該方法僅是通過計算機(jī)模擬得到活性成分與相關(guān)靶基因，但不能明確活性成分對靶基因調(diào)控關(guān)系，仍需進(jìn)一步通過實驗研究加以驗證。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步闡明丹參飲治療CAG的作用機(jī)制，科學(xué)地體現(xiàn)出了中醫(yī)整體觀和系統(tǒng)性，為中醫(yī)藥多成分、多靶點、多途徑的治療優(yōu)勢提供了有力證據(jù)，為中醫(yī)藥治療多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病提供了新途徑，同時為后續(xù)分子機(jī)制研究提供了一定方向。