尹國利，趙露，鄒成梅，胡婷

（武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢430205）

大葉冬青苦丁茶（Ilex latifolia Thunb.）是冬青科植物大葉冬青的葉，主要分布在我國西南和華南等地區(qū)，其成品茶清香有苦味、而后回味甘涼?？喽〔鑳?nèi)含有多種生物活性物質(zhì)，具有豐富的次生代謝產(chǎn)物和潛在的生物活性。

現(xiàn)代藥理研究表明，天然多酚具有抗氧化、降血糖和降血脂等功效，因其活性強、副作用小，可用于研制抗糖尿病和保肝殺菌藥物[1]。Guilherme等[2]發(fā)現(xiàn)，膳食多酚可以調(diào)節(jié)腸道功能，改變食物的表觀血糖指數(shù)，從而降低代謝綜合征引起的血糖和血脂水平。另有研究表明，抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性可有效降低血糖和血脂含量，從而起到預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的作用[3-5]。目前，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的合成抑制劑藥物如阿卡波糖等已得到廣泛的臨床應(yīng)用，但合成藥物易產(chǎn)生胃腸道功能紊亂，肝細胞性肝損傷等副作用[4]。苦丁茶作為一種天然資源，其多酚含量相當可觀，近年來關(guān)于苦丁茶多酚的提取及其藥理作用的研究備受關(guān)注[6]。

本研究以大葉冬青苦丁茶多酚為原料，利用超聲輔助提取法（ultrasound-assisted extraction，UAE）提取苦丁茶多酚，采用響應(yīng)面法（response surface method，RSM）探究不同工藝參數(shù)對苦丁茶多酚得率的影響，并根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)化，旨在獲得最佳的提取工藝條件。然后利用鐵氰化鉀還原法測定苦丁茶多酚的總還原力，采用分光光度計法測定苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，初步評價其抗氧化和降糖活性，以期為降血糖藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為苦丁茶成為一種新型生物活性物質(zhì)在食品工業(yè)和人體健康方面的應(yīng)用開辟新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

大葉冬青苦丁茶原料：廣州三香茶葉有限公司，粉碎研磨過80目篩。福林酚：北京索來寶科技有限公司；綠原酸：上海佳和生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）、α-葡萄糖苷酶（10 000 U/g）、α-淀粉酶（10 000 U/g）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖（p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside，PNPG）：廣州東聚實驗化工儀器有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析級。

1.2 苦丁茶多酚提取

準確稱取2 g苦丁茶粗粉，加入乙醇溶液。分別探討提取溫度、提取時間、料液比、超聲功率、乙醇濃度對多酚得率的影響。反應(yīng)結(jié)束后，8000 r/min離心10 min，取上清液濃縮干燥至恒重即得多酚樣品。以10 mg多酚樣品為原料，制備1.0 mg/mL的苦丁茶多酚溶液。

1.3 多酚得率測定

多酚得率的測定采用福林酚比色法[7]。吸取1.0 mL苦丁茶多酚提取液，加入3.0 mL的福林酚顯色劑，充分搖勻后在室溫25℃下反應(yīng)5 min。加入4.5 mL飽和Na2CO3溶液，混勻，加水定容至25 mL。搖勻后在30℃保溫箱中避光反應(yīng)30 min。以去離子水代替樣品溶液為空白，在747 nm處測定反應(yīng)液的吸光值。以綠原酸濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制綠原酸的標準曲線。樣品溶液中的多酚得率以綠原酸當量計，苦丁茶中多酚得率的計算公式如下：

1.4 苦丁茶多酚提取工藝的優(yōu)化研究

1.4.1 變量擇優(yōu)

將料液比 [1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]、提取時間（30、60、90、120、150 min）、提取溫度（20、30、40、50、60℃）、乙醇濃度（0%、25%、50%、75%、100%）和超聲功率（40、50、60、70、80 W）作為單一因素的變量選取范圍，探究其對苦丁茶多酚得率的影響。

1.4.2 試驗設(shè)計

以苦丁茶多酚得率為響應(yīng)值，選取提取時間（A）、超聲功率（B）和料液比（C）為自變量，每個變量選擇3個水平（-1，0，1），在 Design-expert軟件的 Box-Behnken設(shè)計中選擇5個中心點后自動生成試驗設(shè)計，將數(shù)據(jù)擬合為二階多項式模型，得到回歸系數(shù)，采用以下方程式進行回歸分析：

式中：Y 是響應(yīng)值；β0、βi、βii、βij分別是截距、一次回歸系數(shù)、二次回歸系數(shù)和交叉積回歸系數(shù)；Xi和Xj是自變量的編碼值；k是被測變量的個數(shù)（k=3）。

1.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化

通過對過程、響應(yīng)面和輪廓圖的回歸擬合，得到各因素水平對應(yīng)的響應(yīng)值，據(jù)此得到最優(yōu)預(yù)測響應(yīng)值和相應(yīng)的試驗條件[8-9]。響應(yīng)面分析主要采用非線性擬合的方法得到擬合方程，根據(jù)擬合方程，繪制響應(yīng)面圖，得到最佳試驗條件，并進行試驗驗證。

1.5 抗氧化活性的測定[10]

還原力是表現(xiàn)體外抗氧化能力的一項重要指標。本試驗采用鐵氰化鉀還原法測定了苦丁茶多酚的還原力。依次將不同濃度的樣品溶液（1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL）、0.2 mol/L pH=6.6的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）和 1%K3Fe（CN）6溶液各取0.4 mL加入離心管中，混勻，在50℃保溫20 min后，加入0.4 mL 10%的三氯乙酸混合離心10 min。取上清液1.0 mL，依次加入1.0 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵溶液，混勻后在室溫25℃下反應(yīng)10 min，在700 nm處測定其吸光度，以VC作陽性對照。計算其相對總還原百分率，計算如下公式：

式中：A和A0分別表示測定樣品的吸光值和空白樣品的吸光值，Amax為在一次測量內(nèi)最大的吸光值。

1.6 苦丁茶多酚酶活性抑制研究

1.6.1 苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用[11]

在離心管中依次加入0.05 U/mL 800 μL的α-葡萄糖苷酶溶液（10 000 U/g）和不同濃度（6、5、4、3、2、1.8、1.5、1.2、1、0.8 mg/mL）的待測樣品溶液（400 μL），在搖床中（37℃，40 r/min）孵育5 min。在每個離心管中加入 3 mmol/L底物溶液（400 μL），混勻，同條件再次孵育30 min。最后加入0.1 mol/L的Na2CO（31 mL）來終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光度值。陰性對照試驗是用相同體積的PBS代替樣品溶液。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率（%）按如下公式計算：

式中：A1表示陰性對照試驗的吸光值；A2表示待測樣品的吸光值；A3表示只加樣品的吸光值。

1.6.2 苦丁茶多酚對α-淀粉酶的抑制作用[12]

取0.25 mL的α-淀粉酶溶液（10 000 U/g）與相同體積不同濃度的樣品（6、5、4、3、2、1.8、1.5、1.2、1、0.8 mg/mL）溶液混合，37℃預(yù)熱10 min。后加入0.5 mL同樣已預(yù)熱的底物溶液，在37℃水浴中反應(yīng)8 min，然后加入 0.5 mL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）顯色劑，混合后沸水加熱8 min。冷卻至室溫25℃后加入5 mL去離子水稀釋，并在540 nm處測定吸光度值。另取0.25 mL去離子水代替樣品溶液，作為無抑制劑的對照組。樣品對α-淀粉酶的抑制率（%）按如下公式計算：

式中：A1和A2分別表示無抑制劑和有抑制劑情況下的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標準曲線的測定

通過測定綠原酸標準品吸光度曲線，得到回歸方程為：y=2.404 8x+0.025 9，相關(guān)系數(shù) R2=0.999，x 為綠原酸含量，y為吸光度值，綠原酸標準曲線如圖1所示。

圖1 綠原酸標準曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

結(jié)果表明，綠原酸含量在0.01 mg/mL～0.1 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，可作為計算苦丁茶多酚得率的標準曲線。

2.2 單因素試驗

多酚得率受到提取時間、溶劑濃度、料液比和提取溫度等因素的影響[8]。本研究初步探討了不同參數(shù)對苦丁茶多酚得率的影響，試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2A可知，乙醇濃度從0%增加到50%時，多酚得率隨著乙醇濃度的增加而上升；當乙醇濃度大于50%時，多酚得率逐漸下降。由此可知，提取苦丁茶多酚的最佳溶劑濃度為50%乙醇。與其它濃度的乙醇溶液作為提取溶劑相比，使用50%乙醇來提取多酚的得率具有絕對優(yōu)勢，故將乙醇濃度這個單因素視為影響苦丁茶多酚得率的非關(guān)鍵因素，不作Box-Benhnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化分析。

由圖2B可知，提取苦丁茶多酚的最佳提取溫度為40℃。相關(guān)文獻報道，適當提高多酚的提取溫度有利于提取過程中有機溶劑的擴散和傳質(zhì)，但過高的溫度也會分解提取物中的多酚物質(zhì)[13]。因此，選擇40℃作為苦丁茶多酚的最佳提取溫度，將提取溫度這個單因素視為影響苦丁茶多酚得率的非關(guān)鍵因素，不作Box-Benhnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面優(yōu)化分析。

圖2C與圖2D試驗結(jié)果分別顯示出最佳的料液比與提取時間分別為1∶20（g/mL）和90 min。Liu等[14]和Wang等[15]的研究也顯示出類似的結(jié)果。提取溶劑的體積越大，接觸面積越大，浸提過程越充分，多酚的得率也越高，但隨著溶劑體積的不斷增大，會增加多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的溶解，從而阻礙多酚的溶解。因此最佳料液比與提取時間需要通過Box-Benhnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析來確定。

超聲功率對苦丁茶多酚得率的影響結(jié)果如圖2E所示，在超聲功率為60 W時多酚得率最高，但與其他功率時的多酚得率差別不大，因此最佳超聲功率也需要通過Box-Benhnken試驗設(shè)計和響應(yīng)面分析來確定。

2.3 Box-Benhnken試驗設(shè)計及響應(yīng)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素初步結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇超聲時間（60、90、120 min）、超聲功率（50、60、70 W）和料液比[1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）]作為 3 個關(guān)鍵影響因素，比較 3 個自變量的測定值、預(yù)測值以及優(yōu)化條件下苦丁茶多酚的提取率。每組試驗重復(fù)3次，具體試驗結(jié)果見表1所示。

表1 Box-Benhnken設(shè)計及多酚含量試驗預(yù)測值Table 1 Box-Benhnken design and total polyphenol content test prediction value

2.4 模型分析

利用Design-expert軟件處理所得的試驗數(shù)據(jù)進行二次方差分析（AVOVA）?；貧w系數(shù)與各因素間的相互作用顯著性如表2所示，證明多酚產(chǎn)量模型具有重要意義（R2=0.988 3）。

軟件分析得到的回歸方程如下：

從回歸方程變異分析結(jié)果可以看出，F(xiàn)值為14.72，P<0.01，說明響應(yīng)面模型具有很高的顯著性。另外，相關(guān)系數(shù)R2為0.988 3，大于0.900 0，說明方程的模擬相關(guān)度很好?；貧w方程反映了各因素與響應(yīng)值間的關(guān)系，可利用回歸方程確定最佳提取工藝。從表中的數(shù)據(jù)可以得出，一次項B和相互作用項AC對多酚得率有顯著影響，A2、B2和C2對多酚得率的影響極為顯著。

表2 響應(yīng)面二次模型方差分析表Table 2 Analysis of variance of response surface quadratic model

2.5 最佳工藝條件的確定

利用二維等高線圖和三維響應(yīng)面圖反映不同因素對苦丁茶多酚得率的交互作用，如圖3所示。

圖3（A）與圖3（C）分別表示當料液比為最佳時，提取時間和超聲功率對苦丁茶多酚得率的相互作用與超聲功率處于最佳水平時，提取時間和料液比對苦丁茶多酚得率的影響。從這兩個圖可看出，兩兩因素交互作用的響應(yīng)面圖都較為平緩，因此，兩者交互作用并不明顯。由圖3（B）可知，當超聲功率很低時，多酚得率隨溶劑體積的增大而顯著上升，表現(xiàn)為曲線較陡。當超聲功率較高時，隨著溶劑體積的增大，多酚的得率略有增加。當溶劑體積很小時，多酚得率隨超聲功率的增加顯著增加。當溶劑體積相對較大時，隨著超聲功率的增加，多酚的得率略有增加，但不明顯。結(jié)果表明，料液比與超聲功率的交互作用明顯。

2.6 模型合理性論證

通過Design-expert對各關(guān)鍵因素分析，確定了最佳提取條件：超聲時間106.85 min、超聲功率61.88 W、料液比1∶20.67（g/mL）。在優(yōu)化條件下，用該模型預(yù)測最大多酚得率為54.114%。為了驗證模型的充分性，并考慮實際操作的可能性，對最佳提取條件進行了修正：提取時間107 min，超聲功率62 W，料液比1∶21（g/mL）。同時，將最佳提取溫度（40℃）和乙醇濃度（50%）確定為兩個非臨界因素，并在此條件下進行了驗證性試驗，通過3次平行試驗驗證模型的準確性，所得多酚的平均得率為54.13%。與理論值比較，響度偏差為0.016%，說明用響應(yīng)面法優(yōu)化苦丁茶多酚的提取工藝是可行的，該模型合理，理論值與實際值基本一致，具有一定的應(yīng)用價值。

圖3 各因素交互作用對苦丁茶多酚得率影響的響應(yīng)面與等高線圖Fig.3 Contour plots and response surface showing the interactive effects of various factors on the extraction yield of polyphenol from Ilex latifolia Thunb

2.7 總還原力的測定

苦丁茶多酚和陽性對照VC的總還原力比較曲線如圖4所示。

圖4 VC和苦丁茶多酚的還原能力Fig.4 Reduction ability of VCand polyphenols from Ilex latifolia Thunb.

由圖4可知，苦丁茶多酚和VC在濃度為0.02mg/mL～1.0 mg/mL時，相對總還原百分率均隨著樣品濃度的增加而增大。經(jīng)過相關(guān)計算得出，苦丁茶多酚的總還原力IC50值為0.584 mg/mL，陽性對照VC的總還原力IC50值為0.476 mg/mL，苦丁茶多酚的IC50值略微低于VC。在低濃度區(qū)（0.02 mg/mL～0.1 mg/mL時），苦丁茶多酚的總還原力高于VC；在中濃度區(qū)（0.1 mg/mL～0.8 mg/mL時），苦丁茶多酚和VC的總還原力均呈現(xiàn)迅速上升趨勢；在高濃度區(qū)（0.8 mg/mL～1.0 mg/mL時），苦丁茶多酚和VC的總還原力相差不大，兩者的相對總還原百分率非常接近。由此表明，苦丁茶多酚具有很好的抗氧化活性。

2.8 苦丁茶多酚對酶活性的抑制作用

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成一定量的對硝基苯酚，因此，以PNPG為底物可以測定樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。Pradeep等[16-18]的研究表明，植物酚類化合物能抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，顯著降低淀粉水解速率?？喽〔瓒喾訉γ富钚缘囊种谱饔靡妶D5。

圖5 苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.5 Inhibition of polyphenol from Ilex latifolia Thunb.on α-glucosidase and α-amylase

由圖5（A）可知，隨著苦丁茶樣品濃度的增加，多酚樣品溶液對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率也隨之上升，苦丁茶多酚溶液濃度在0.8 mg/mL～6.0 mg/mL范圍內(nèi)，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率呈劑量依賴關(guān)系。在低濃度區(qū)域，多酚樣品溶液對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于40%，當多酚溶液濃度為6.0 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于80%，抑制作用明顯，經(jīng)過計算得到，苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶活性抑制的IC50值為1.15 mg/mL。由試驗結(jié)果可以看出，苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶的活性有一定的抑制作用。

由圖5（B）可知，多酚樣品溶液顯示出對α-淀粉酶的劑量依賴性抑制，隨著多酚濃度的增加，其對α-淀粉酶的抑制率也不斷上升，苦丁茶多酚對α-淀粉酶活性抑制的IC50值為1.31 mg/mL。當多酚樣品溶液濃度為6.0 mg/mL時，對α-淀粉酶活性的抑制率高于90%，抑制效果顯著。由此可以得出，苦丁茶多酚對α-淀粉酶的活性也有很好的抑制作用。

3 結(jié)論

超聲輔助提取技術(shù)是一種快速提取苦丁茶多酚的優(yōu)良方法，本研究以大葉冬青苦丁茶多酚為原料，用超聲輔助提取苦丁茶多酚，采用響應(yīng)面法探究不同工藝參數(shù)對苦丁茶多酚得率的影響，并根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計對工藝條件進行優(yōu)化，通過單因素與正交試驗確定苦丁茶多酚最佳提取工藝條件為：提取時間107 min、料液比 1 ∶21（g/mL）、超聲功率 62 W，苦丁茶多酚的得率為54.13%。利用鐵氰化鉀還原法測定苦丁茶多酚的總還原力，初步評價其抗氧化活性，試驗結(jié)果表明，苦丁茶多酚濃度在0.02 mg/mL～1.0 mg/mL時，總還原力隨著樣品濃度的增加呈迅速上升趨勢，IC50值為0.584 mg/mL，略低于陽性對照VC的抗氧化能力，由此表明，苦丁茶多酚具有很好的抗氧化活性，是一種很好的天然抗氧化物質(zhì)。此外，采用分光光度計法測定苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，初步評價其降糖活性，試驗結(jié)果表明苦丁茶多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制效果均顯著，IC50值分別為1.15 mg/mL和1.31 mg/mL，這提示苦丁茶多酚可能成為治療2型糖尿病的有效功能成分，以期為降血糖藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，對臨床治療和保健食品的開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。