張佳薇 張旭 肖英 韓朝君 劉華領(lǐng) 張振峰 梁楠松 詹亞光

摘?要：該研究通過基因克隆獲得了水曲柳PHV基因，并命名為FmPHV。生物信息學(xué)分析表明，水曲柳FmPHV基因編碼區(qū)全長為2?112?bp，包含有一個(gè)完整的開放閱讀框，其編碼了一個(gè)由703個(gè)氨基酸組成的蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測其主要存在于葉綠體中，為穩(wěn)定親水蛋白。保守域及同源分析表明，F(xiàn)mPHV與油橄欖、芝麻和煙草等物種的同源蛋白保守結(jié)構(gòu)域同源性高達(dá)99%。在低溫4??℃條件下，使用50?mg·L-1吲哚丁酸（IBA）溶液對水曲柳樹皮進(jìn)行處理，獲得了水曲柳形成層細(xì)胞，并進(jìn)一步誘導(dǎo)獲得形成層愈傷組織。對FmPHV基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行分析表明，F(xiàn)mPHV基因6月表達(dá)量最高，同時(shí)FmPHV能在芽中高表達(dá)，通過樹皮獲得的不同來源的愈傷組織相互比較可知，F(xiàn)mPHV在來源為形成層分生組織形成層愈傷組織中的表達(dá)量顯著高于其在其他來源的愈傷組織中的表達(dá)。此外，對水曲柳幼苗瞬時(shí)過表達(dá)FmPHV基因，對其所在通路關(guān)鍵基因的表達(dá)特征進(jìn)行分析，F(xiàn)mPHV瞬時(shí)過表達(dá)后，生長素相關(guān)基因表達(dá)下降，細(xì)胞分裂素相關(guān)基因表達(dá)上升，有利于芽的分化。以上結(jié)果表明，揭示了水曲柳FmPHV在水曲柳植株生長過程中的表達(dá)模式以及FmPHV過表達(dá)對芽再生通路各關(guān)鍵基因的調(diào)控情況，為研究水曲柳FmPHV調(diào)控生長發(fā)育的分子機(jī)制以及其在生長素和細(xì)胞分裂素響應(yīng)通路中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水曲柳，PHV基因，生物信息學(xué)分析，瞬時(shí)侵染，形成層細(xì)胞

中圖分類號：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）07-0963-14

Abstract：?PHAVOLUTA（PHV）transcription?factor?is?one?of?the?most?important?members?of?homeodomain-leucine?zipper?Ⅲ?（HD-ZIP）?family，and?plays?an?important?role?in?the?regulation?of?formation?of?plant?stems?apical?and?germ?meristem.?In?this?research，the?PHV?gene?of?Fraxinus?mandshurica?was?acquired?by?gene?cloning?and?was?named?by?FmPHV.?Detailed?bioinformatics?analysis?showed?that?the?length?of?FmPHV?gene?was?2?112?bp，and?contained?a?complete?Open?Reading?Frame?（ORF）?which?encoded?a?protein?with?703?amino?acids.?The?FmPHV?gene?encoded?a?stable?hydrophilic?protein，the?subcellular?localization?prediction?of?FmPHV?protein?showed?the?FmPHV?was?mainly?present?in?the?chloroplast.?Conserved?domain?and?homology?analysis?of?FmPHV?protein?indicated?that，the?homology?of?FmPHV?between?the?homology?PHV?proteins?in?other?species，such?as?Olea?europaean，Sesamum?indicum?and?Nicotiana?tabacum，was?99%.?Under?4?℃?condition，with?the?treatment?of?50?mg·L-1?3-indolebutyric?acid（IBA）solution，we?obtained?the?cambium?callus?from?cambium?stem?cells?of?Fraxinus?mandshurica.?Analysis?of?the?gene?expression?pattern?of?FmPHV?showed?that?the?FmPHV?was?the?highest?expression?in?June.?Furthermore，the?expression?of?FmPHV?in?buds?was?stronger?than?which?in?any?other?tissues.?Compared?with?the?callus?from?different?sources，which?obtained?from?the?bark?of?F.?mandshurica，the?expression?level?of?FmPHV?gene?in?callus，derived?from?meristem?formation，was?significantly?higher?than?which?from?other?sources.?Moreover，overexpression?the?FmPHV?gene?in?F.?mandshurica?seedlings?will?reduce?the?expression?of?auxin-related?genes?and?increase?the?expression?of?cytokinin-related?genes.?This?phenomenon?indicated?that?the?function?of?FmPHV?gene?was?more?beneficial?to?the?process?of?plant?shoot?differentiation?and?regeneration.?In?summary，this?research?revealed?the?expression?pattern?of?FmPHV?gene?during?the?growth?and?development?in?F.?mandshurica.?And?revealed?the?expression?pattern?of?key?genes?in?plant?shoot?regeneration?pathway，which?were?regulated?by?FmPHV?gene.?Our?research?reveals?the?potential?value?of?the?molecular?characteristic?of?FmPHV?gene?in?the?response?of?auxin?and?cytokinin?pathways?during?the?process?of?the?formation?of?plant?callus?generation.

1?材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料來源與處理

水曲柳材料取自東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場，以成熟水曲柳植株樹皮以及種子萌發(fā)所獲得的30?d幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，根、莖、葉取自水曲柳3年生盆栽苗，5月—9月水曲柳全株（包括根，莖，葉）及雄花雌花取自野生水曲柳用于基因定量測定。對水曲柳樹皮進(jìn)行消毒后，置于4?℃中，使用50?mg·L-1IBA高滲溶液進(jìn)行20?h處理后，放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周后，獲得水曲柳形成層愈傷組織。將材料至于液氮中冷凍保存。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?FmPHV基因編碼區(qū)全長的克隆?使用CTAB方法提取水曲柳組培苗總RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。實(shí)驗(yàn)前期對水曲柳轉(zhuǎn)錄組測序獲得水曲柳轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。應(yīng)用BioEdit?軟件中Local?blast?功能中的blastn?和?blastx?功能，比對分析確認(rèn)PHV基因序列并設(shè)計(jì)引物，對PHV編碼區(qū)全長序列進(jìn)行克?。ㄒ锶绫?所示）。使用Omega膠回收試劑盒對特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，使用pEASY-T5載體連接特異產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)入Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中。送至生工生物工程（上海）公司測序。

1.2.2?FmPHV基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析?用NCBI在線工具中的Open?Reading?Frame?（ORF）?Finder預(yù)測FmPHV基因的編碼區(qū)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）。使用SignalP5.0在線分析軟件對FmPHV蛋白進(jìn)行信號肽的預(yù)測和分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）。利用ExPASy中ProtParam工具對該蛋白理論等電點(diǎn)pI（isoelectric?point）值、親水性/疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析（https：//web.expasy.org/protparam/、https：//web.expasy.org/protscale/）。使用在線分析軟件對FmPHV蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（https：//embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html）。利用WOLF-PSORT在線軟件對FmPHV蛋白的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測分析（https：//wolfpsort.hgc.jp/）。利用?NCBI數(shù)據(jù)庫Conserved?Domain?Search?Service（CD?Search）在線分析軟件分析FmPHV的保守結(jié)構(gòu)域。使用MEGA7.0.2軟件的Neighbor-Joining（NJ）算法對其他物種中同源性較高的PHV蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用在線多序列比對軟件PRALINE對不同物種的PHV結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多重序列比對。

1.2.3?水曲柳外植體無菌材料的獲得?選擇并收集一年生或多年生水曲柳莖條。截剪長度為4～6?cm的莖段在流水下沖洗2～4?h，將清洗過的組織放無菌燒瓶中，75%乙醇以及5%的次氯酸鈉（日本Junsei）對外植體消毒。材料接種于MD201培養(yǎng)基（WPM+4.0?g·L-1瓊脂+20?g·L-1蔗糖+1?mg·L-1毒莠定+1?mg·L-16-BA），并于黑暗條件培養(yǎng)7?d。

1.2.4?實(shí)時(shí)熒光定量對水曲柳不同部位及瞬時(shí)侵染植株中FmPHV和相關(guān)基因表達(dá)量分析?以水曲柳微管蛋白基因Tu作為內(nèi)參基因（Livak?et?al.，2001），引物見表2。PCR反應(yīng)體系如下：10?μL?Master?Mix，2?μL模板cDNA，10?μmol·L-1的正反向引物各1?μL，用ddH2O補(bǔ)足至20?μL。擴(kuò)增反應(yīng)利用Applied?Biosystems7500熒光定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)程序：95??℃30?s、95??℃5?s、60??℃?34?s（共40個(gè)循環(huán)）、95??℃15?s、60??℃1?min、95??℃15?s。每份樣品進(jìn)行3次重復(fù)。目標(biāo)基因表達(dá)水平運(yùn)用相對定量的2-ΔΔCt（Livak?et?al.，2001）進(jìn)行計(jì)算，式中：Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強(qiáng)度值。

2?結(jié)果與分析

2.1?FmPHV基因全長克隆與序列分析

以水曲柳實(shí)生苗全株的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，獲得一條大小為2?100?bp左右的片段，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。經(jīng)測序，通過NCBI數(shù)據(jù)庫blastn比對，確定獲得水曲柳PHV基因序列，并命名為FmPHV。FmPHV基因的開放閱讀框全長為2?112?bp，編碼了703個(gè)氨基酸（圖2）。經(jīng)過比對，與油橄欖（Olea?europaea）OeATHB14基因核苷酸序列（XM_023011038.1）的一致性為99%;與芝麻（Sesamum?indicum）SiATHB14基因核苷酸序列（XM_011098376.2）?的一致性為99%;與煙草（Nicotiana?tabacum）?NtPHV基因核苷酸序列?（JQ686932.1）的一致性為94%。所以我們確定水曲柳中該基因?yàn)镠D-ZIP?Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子家族成員PHV，并命名為FmPHV。

2.2?FmPHV蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

2.2.1?FmPHV蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析?利用ProtParam工具在線分析，F(xiàn)mPHV編碼703個(gè)氨基酸，相對分子質(zhì)量為76.89?kD，等電點(diǎn)（pI）為6.27，不穩(wěn)定系數(shù)為55.08，確定為不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)大于40時(shí)，預(yù)測蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反之則穩(wěn)定）。FmPHV蛋白的親水/疏水性分析結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV蛋白平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.182，為親水蛋白。此外，F(xiàn)mPHV蛋白親疏水性圖譜顯示，F(xiàn)mPHV蛋白共有47個(gè)疏水區(qū)和59個(gè)親水區(qū)（圖3：A）（>0.5區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)，<-0.5區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，介于+0.5～-0.5之間主要為兩性區(qū)域）?？缒そY(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV存在兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，分別在453～471?bp氨基酸序列片段上存在從里到外的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，以及445～467?bp氨基酸序列片段上存在的從外到里的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，分?jǐn)?shù)分別為889和515（分?jǐn)?shù)>500為顯著跨膜結(jié)構(gòu)），由內(nèi)到外與由外到內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域基本重合，并且都有強(qiáng)烈的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，由此可推斷，F(xiàn)mPHV蛋白既可以具有由外到內(nèi)的跨膜能力，也具有由內(nèi)到外的跨膜能力（圖3：B）。信號肽預(yù)測結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV蛋白可能不存在信號肽，我們認(rèn)為該蛋白為非分泌蛋白。利用WOLFPSORT預(yù)測FmPHV亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV主要分布在葉綠體中，占57.14%，其次分布在細(xì)胞核中，占28.57%，少部分分布于囊泡中，占4.28%。

2.2.2?FmPHV蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測?利用SOPMA在線工具分析FmPHV蛋白的二級結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果顯示蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由43.67%（307?aa）的無規(guī)卷曲（random?coil）、36.84%（259?aa）的α螺旋結(jié)構(gòu)（alpha?helix）、14.51%（102?aa）的擴(kuò)展長鏈（extended?chain）、4.98%（35?aa）的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（beta?turn）構(gòu)成（圖4）。

2.2.3?FmPHV蛋白氨基酸序列比對及保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測?分別以FmPHV蛋白的氨基酸序列為基礎(chǔ)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索與水曲柳FmPHV蛋白同源性較高的其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對。包括油橄欖（Olea?europaea）、可可（Theobroma?cacao）、木薯（Manihot?esculenta）、胡桃（Juglans?regia）、煙草（Nicotiana?tabacum）、芝麻（Sesamum?indicum）、紫花風(fēng)鈴（Handroanthus?impetiginosus）、紫瓶子草（Sarracenia?purpurea）、細(xì)葉石竹（Nicotiana?sylvestris）、牽牛（Ipomoea?nil）、綠豆（Vigna?radiata?var.?radiata）、大豆（Glycine?max）、水蜜桃（Prunus?persica）、甜櫻桃（Prunus?avium）、馬鈴薯（Solanum?tuberosum）、長蒴黃麻（Corchorus?olitorius）、亮葉樺（Betula?luminifera）、土瓶草（Cephalotus?follicularis）、柑橘（Citrus?sinensis）、中粒咖啡（Coffea?canephora）。采用MEGA7.0.2中的NJ方法構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示進(jìn)化樹聚為兩組，其中水曲柳FmPHV與同屬木犀科的油橄欖OeATHB14親緣關(guān)系最為緊密（圖5）。

利用在線多序列比對軟件PRALINE對FmPHV蛋白序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中一些其他物種的PHV蛋白序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV與其他PHV（ATHB14）蛋白序列的保守區(qū)主要集中在3個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為HD、b-ZIP和START結(jié)構(gòu)域（圖6）。包括油橄欖（Olea?europaea）（XP_022866806.1）、野生煙草（Nicotiana?attenuata）（XP_009612342.1）、可可（Theobroma?cacao）（EOY25496.1）、芝麻（Sesamum?indicum）（XP_020554026.1）、?中?？Х?（Coffea?canephora）灰色陰影區(qū)域?yàn)镠D結(jié)構(gòu)域;下橫線區(qū)域?yàn)閎-ZIP結(jié)構(gòu)域;直角框內(nèi)為START結(jié)構(gòu)域;“*”代表終止密碼子。

Gray?shadow?region?is?the?HD?domain;?the?lower?horizontal?line?is?the?b-ZIP?domain;right?angle?box?is?the?START?domain;“*”?represents?the?stop?codon.（CDP17314.1）、葡萄（Vitis?vinifera）（RVW23993.1）的PHV（ATHB14）氨基酸序列蛋白高度一致。

2.3?水曲柳形成層愈傷組織的獲得及培養(yǎng)

2.3.1水曲柳形成層愈傷組織的獲得?獲得水曲柳無菌莖段外植體后，為達(dá)到分離韌皮部和形成層的目的，使用50?mg·L-1的高濃度IBA（indole-3-butytric?acid）溶液，在4??℃條件下對已與木質(zhì)部分離的其他部分處理20?h后，將材料放入0.5?mg·L-1IBA低滲溶液中處理15?min。之后將莖段置于MD201培養(yǎng)基（WPM+4.0?g·L-1瓊脂+20?g·L-1蔗糖+1?mg·L-1毒莠定+1?mg·L-16-BA）中暗培養(yǎng)7?d后，取出，將木質(zhì)部完全去除后將靠近韌皮部一側(cè)置于MD201培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)7?d后即獲得水曲柳形成層愈傷組織，如圖7所示。從左至右分別為一年生樹皮形成層愈傷組織（部分整齊排列的致密白色松散細(xì)胞團(tuán)）、一年生樹皮韌皮部愈傷組織（隨機(jī)分布的偏綠色松散細(xì)胞團(tuán)）、多年生樹皮形成層愈傷組織（整齊排列的致密白色松散細(xì)胞團(tuán)）、二年生樹皮韌皮部愈傷組織（不啟動(dòng)）。

2.3.2水曲柳形成層愈傷組織的培養(yǎng)?實(shí)驗(yàn)為形成層愈傷組織繼代培養(yǎng)選擇了WPM、B5、MSB5三種培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)基優(yōu)化，同時(shí)對形成層愈傷組織和普通皮層愈傷組織的生長量進(jìn)行了比較（圖8）。

實(shí)驗(yàn)選取WPM、1/2?WPM、B5、MSB5四種培養(yǎng)基對水曲柳形成層愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其中B5培養(yǎng)基中材料出現(xiàn)不同程度的褐化，兩次繼代后材料死亡，在1/2?WPM培養(yǎng)基中材料長勢緩慢，在褐化情況出現(xiàn)之前死亡。MSB5培養(yǎng)基中材料長勢迅速升高，但隨即材料排出大量多酚，2～3?d后死亡。我們初步判斷，水曲柳形成層愈傷組織不適應(yīng)富含豐富有機(jī)物質(zhì)的培養(yǎng)基。WPM培養(yǎng)基中材料生長勢雖然不如MSB5培養(yǎng)基，但是生長狀態(tài)良好，顯微鏡下觀察到松散細(xì)胞團(tuán)，繼代周期為21?d（圖8：A，C）。

在對形成層愈傷組織和樹皮愈傷組織在WPM培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代20?d左右后，觀察到極少數(shù)樹皮邊緣處出現(xiàn)與形成層愈傷組織完全不同的乳黃色團(tuán)狀緊密愈傷組織（圖8：B）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對兩種愈傷組織的生長量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖8：C）。結(jié)果表明，形成層愈傷組織的啟動(dòng)周期顯著優(yōu)于樹皮愈傷組織，并且前者的生長量是后者的4倍之多。

由于水曲柳形成層愈傷組織具有生長迅速，細(xì)胞團(tuán)處于松散易分離狀態(tài)等類似于胚性細(xì)胞的優(yōu)良特性，我們決定通過探究芽再生關(guān)鍵基因FmPHV在其中的表達(dá)情況，為水曲柳芽再生體系的建立奠定基礎(chǔ)。

2.4?FmPHV基因的表達(dá)分析

2.4.1?FmPHV基因在水曲柳中表達(dá)分析?分別取實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的水曲柳愈傷組織和水曲柳種子組培培養(yǎng)30?d的幼苗。根、莖、葉取自水曲柳3年生盆栽苗。5月—9月混合樣（包括根，莖，葉）及雄花雌花取自野生多年生水曲柳，以及以形成層為來源的形成層愈傷組織（圖9：A，B，C）。

對水曲柳FmPHV基因在不同部位中定量表達(dá)分析結(jié)果表明（圖9：B），該基因在芽中高度表達(dá)，而在其他組織中根、莖、葉、花以及種子中的表達(dá)量普遍不高。形成層愈傷組織中FmPHV基因的表達(dá)量是普通培養(yǎng)愈傷組織表達(dá)量的22.35倍，說明FmPHV對調(diào)控形成層的愈傷組織形成起到了重要作用。

水曲柳快速生長期為每年的5月—9月，5月復(fù)蘇，6月萌芽，同時(shí)FmPHV表達(dá)量在6月達(dá)到最高，在9月表達(dá)量最低，6月表達(dá)量是9月的29.738倍（圖9：A）。可以推測該基因在水曲柳芽發(fā)生階段發(fā)揮著正調(diào)控作用。同時(shí)形成層愈傷組織中該基因特異性高表達(dá)，推測該種愈傷組織具有芽再生潛力，可以作為水曲柳再生體系建立材料的來源。

為進(jìn)一步證明FmPHV在芽再生過程中的正向作用，分別選取水曲柳種子萌發(fā)過程中0、2、4、6、8、10、12以及14?d的實(shí)生苗作為實(shí)驗(yàn)材料，對水曲柳種子萌發(fā)過程中的FmPHV表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（圖9：C）。結(jié)果表明，在種子萌發(fā)過程中，F(xiàn)mPHV在第2天和第8天分別達(dá)到兩個(gè)峰值，分別是第0天的11.379倍和10.236倍。在芽再生過程中，關(guān)鍵基因的表達(dá)模式被發(fā)現(xiàn)為兩次峰值出現(xiàn)的現(xiàn)象，而這兩次峰值分別與水曲柳種子芽的發(fā)生階段和芽伸長階段相互對應(yīng)。FmPHV基因的表達(dá)與水曲柳，進(jìn)一步說明該基因在芽再生過程中的重要作用。

2.4.2?FmPHV瞬時(shí)侵染水曲柳對芽再生通路基因表達(dá)的影響?前人的研究表明，PHV（ATHB14）受到包括WOX5，細(xì)胞分裂素通路相關(guān)的AHP6和生長素通路相關(guān)的YUC5等生長素以及細(xì)胞分裂素多個(gè)通路的關(guān)鍵基因的調(diào)控，此外，PHV能夠進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞維持與芽再生過程的重要基因，包括ARR1，ARR2，WIND1，ESR2以及WUS等（圖10：A）。為了揭示水曲柳中FmPHV對下游基因的調(diào)控關(guān)系，我們應(yīng)用35S：PHV-GFP過表達(dá)載體，對水曲柳實(shí)生苗進(jìn)行瞬時(shí)過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果表明，瞬時(shí)過表達(dá)后，F(xiàn)mPHV表達(dá)量顯著提高，而FmPHV下游基因AHP6，ZPR3和MP呈現(xiàn)出顯著的下調(diào)表達(dá)，與之對應(yīng)的是，包括ARR2，WOX5，ESR2，YUC和WUS?等基因表達(dá)量呈現(xiàn)出不同程度的升高（圖10：B）。值得注意的是通路中受PHV直接抑制的YUC表達(dá)量輕微上調(diào)現(xiàn)象，我們認(rèn)為PHV可能分別通過不同通路直接或間接地抑制生長素的積累。同樣引起我們注意的還有，與HD-ZIP?Ⅲ轉(zhuǎn)錄因子家族存在共同作用的B型ARRs家族成員ARR2的高表達(dá)情況，HD-ZIP?Ⅲ-B型ARRs復(fù)合物與WUS啟動(dòng)子結(jié)合，并起到進(jìn)一步激活WUS啟動(dòng)的重要作用。同時(shí)受PHV直接負(fù)調(diào)控和通過細(xì)胞分裂素間接調(diào)控等多種通路同時(shí)抑制的AHP6的低表達(dá)，以及受生長素直接調(diào)控的MP的低表達(dá)，我們認(rèn)為這表明在PHV高表達(dá)后，存在生長素表達(dá)水平下降，細(xì)胞分裂素表達(dá)水平上升的現(xiàn)象，這種變化在細(xì)胞微環(huán)境中更利于芽分化。

3?討論與結(jié)論

本研究通過生物軟件，對FmPHV蛋白進(jìn)行了預(yù)測和生物信息學(xué)分析。經(jīng)預(yù)測分析結(jié)果表明FmPHV蛋白為穩(wěn)定親水蛋白，亞細(xì)胞分析表明，其可能主要存在于葉綠體中。通過對?FmPHV蛋白進(jìn)行的結(jié)構(gòu)域分析，表明了FmPHV蛋白有一個(gè)保守START結(jié)構(gòu)域以及C末端序列高度保守氨基酸序列。與Ursache?et?al.（2014）的研究結(jié)果類似，

PHV基因編碼植物特有的b-ZIP類轉(zhuǎn)錄因子，通過接受相關(guān)靶基因的調(diào)控或者蛋白之間的互作而發(fā)揮著重要的調(diào)控功能。

將FmPHV的氨基酸序列應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的Blastp進(jìn)行比對，比對結(jié)果表明，F(xiàn)mPHV蛋白與油橄欖、芝麻、煙草、馬鈴薯、番茄、葡萄、毛果楊、蓖麻、可可、擬南芥等物種的對應(yīng)蛋白的同源性較高。同時(shí)應(yīng)用比對結(jié)果構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹表明，水曲柳FmPHV?蛋白與同科同屬植物油橄欖中的同源蛋白在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。

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（責(zé)任編輯?周翠鳴）