衡雪源,左志文,朱德全,劉江濤,張 磊,王立坤,彭善鑫,朱曉松,王善超
(1.山東省臨沂市人民醫(yī)院多重耐藥菌與真菌感染控制研究所,山東臨沂 276000;2.山東省臨沂市人民醫(yī)院肛腸科,山東臨沂 276000;3.北京航空航天大學醫(yī)工交叉創(chuàng)新研究院/北航大數(shù)據(jù)精準醫(yī)療高精尖創(chuàng)新中心,北京 100191)
肛腸疾病屬于臨床多發(fā)病,其發(fā)病率高達59%,手術治療是常用方式,而由于肛門位置的特殊性,條件致病菌極易導致創(chuàng)面感染,不僅降低手術成功率,還嚴重影響患者術后康復效果[1]。李敏皓等[2]通過分析220例肛腸手術患者切口周圍分泌物的菌群變化,發(fā)現(xiàn)全部患者檢出的細菌包括大腸埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌等,而E.coli占比超過50%。E.coli是臨床中常見的條件致病菌,可能引起尿路感染、血行感染和腸道感染等,在近10年的檢測標本中,E.coli的檢出數(shù)量歷年均居前5位[3]。產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是一種主要由質粒介導的能水解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)類抗菌藥物的β-內酰胺酶[4]。ESBLs對抗菌藥物的選擇要求較高,極易引起新的耐藥株產生,隨著臨床抗菌藥物的大量使用和不合理使用,產ESBLs的E.coli(ESBLs+E.coli)的檢出率呈逐年上升的趨勢,給臨床抗感染診療帶來極大的挑戰(zhàn)[5]。因此,進行延緩或逆轉細菌耐藥性的相關研究具有重要意義。在肛腸疾病手術后,除了傳統(tǒng)的抗菌藥物治療,常采用復方黃柏洗劑進行坐浴輔助治療,其效果明顯優(yōu)于單純抗菌藥物治療。本研究主要探討復方黃柏洗劑改良方“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli的體外抗菌效果及其逆轉細菌耐藥的部分機制,以期為臨床中藥與抗菌藥物聯(lián)合使用治療感染性疾病提供參考。
1.1菌株來源 依據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的抗菌藥物藥敏試驗操作方法和判斷標準[6],從2018年12月至2019年6月山東省臨沂市人民醫(yī)院多重耐藥菌與真菌感染控制研究所分離的菌株中篩選出20株ESBLs+E.coli作為實驗菌株。銅綠假單胞菌(ATCC25873)為本研究所保存的質控標準菌株,作為生物膜檢測的陽性對照。
1.2試劑 頭孢噻肟(CTX,30 μg)、頭孢曲松(CRO,30 μg)、頭孢吡肟(FEP,30 μg)藥敏紙片購自英國Oxoid公司;頭孢噻肟(CTX)粉末購自中國藥品生物制品檢定所。三氯乙酸(TCA)購自北京索萊寶科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂購自杭州濱和微生物試劑有限公司;蛋白檢測試劑盒購自天根生化科技有限公司;結晶紫染液購自法國生物梅里埃公司。
1.3方法
1.3.1中藥“黃金洗劑”的制備 復方黃柏洗劑應用于各類痔瘡及肛門疼痛、術后的治療等有較好的療效[7],山東省臨沂市人民醫(yī)院肛腸科在復方黃柏洗劑經典方的基礎上進一步改良,得到“黃金洗劑”,效果甚佳,本研究探討其對ESBLs+E.coli耐藥性的逆轉效果。“黃金洗劑”的配方如下:黃柏20 g,金銀花20 g,苦參20 g,荊芥20 g,荔枝草30 g,白礬20 g,玄明粉 10 g,川椒30 g,經醫(yī)院制劑室自動煎藥機濃煎,最終原藥材質量與煎液體積比為1.0 g/mL,瓶裝備用。
1.3.2中藥“黃金洗劑”最低抑菌濃度(MIC)檢測 采用試管稀釋培養(yǎng)法檢測MIC。接種ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL,分別置于含不同濃度“黃金洗劑”的肉湯中培養(yǎng),以無中藥的肉湯培養(yǎng)基為對照,24、48、168 h時觀察試管的渾濁程度,結果判定標準:肉湯完全清亮表示無細菌生長,記為-;肉湯渾濁表示有細菌生長,記為+。以肉眼觀察無細菌生長試管中的最低藥物濃度為MIC值[8]。
1.3.3藥敏檢測 將中藥“黃金洗劑”配制成低于MIC的肉湯(含藥0.5 g/mL和0.1 g/mL),以無中藥肉湯為對照(中藥未處理組),接種ESBLs+E.coli 1×106cfu/mL,分別培養(yǎng)24、48、168 h后(中藥處理組),采用改良Kirby-Bailer法,參照CLSI推薦的方法判定結果[6]。測量并比較中藥處理前后抑菌圈直徑(單位:mm)。中藥方劑逆轉耐藥菌株的逆轉率計算公式:逆轉率=(D2-D1)/D1×100%(D1為干預前的藥敏直徑,D2為干預后的藥敏直徑)。實驗重復3次,結果取平均值。
1.3.4生物膜抑菌率的檢測 將菌液加入96孔板中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,無菌生理鹽水清洗數(shù)次后,在超凈工作臺上完全風干。加入結晶紫染液,室溫染色,無菌雙蒸水清洗數(shù)次,自然完全風干。加入33%冰醋酸,脫色10 min后于575 nm處檢測吸光度(A)值。分別以新鮮培養(yǎng)基、ATCC25873菌液作為陰性對照組和陽性對照組,做3個平行重復實驗。生物膜的抑制率(BIR)=(A0-A1)/A0×100%(A0為中藥未處理組的A值,A1為中藥處理組的A值)。
1.3.5細菌粗酶提取與ESBLs酶活性的檢測 取等量ESBLs+E.coli于無菌小管中,離心后留菌備用。磷酸鹽(PBS)緩沖液重懸細菌,反復凍融8~10次,4 ℃ 8 000 r/min離心10 min,留取上清。將60 μL的0.01 mol/L PBS、60 μL的100 μg/mL CTX溶液和30 μL的粗酶提取液分別加入96孔板中,于37 ℃孵育,精確計時,加入終止液60 μL的5%三氯乙酸終止反應,于235 nm檢測A值。60 μL CTX作為空白對照,做3個平行重復實驗。
酶活性單位:在37 ℃,pH值為7.0時,每1 mL酶液內每1 mg活性蛋白質每1 min內水解底物的量。酶活性單位(U)=△A/0.03×T;公式中△A為37 ℃,235 nm下的AN-A0,AN為測試后數(shù)值,A0為空白值;0.03是將酶液體積換算成1 mL;T是酶與底物的反應時間。
2.1中藥“黃金洗劑”MIC的檢測結果 通過試管稀釋培養(yǎng)法檢測“黃金洗劑”的MIC發(fā)現(xiàn),中藥處理ESBLs+E.coli 24、48、168 h都能夠抑制細菌的生長,“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli具有一定的抑菌作用,其MIC為0.6 g/mL。見表1。
表1 不同濃度“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli的抑菌效果
2.2中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli耐藥性的逆轉效果 通過檢測中藥處理后的細菌對抗菌藥物的抑菌圈直徑發(fā)現(xiàn),與中藥未處理組相比,經中藥處理24 h的ESBLs+E.coli對FEP抑菌圈直徑明顯變大,而對CTX和CRO的抑菌圈直徑大小變化并不大,見圖1。根據(jù)測得的抑菌圈直徑計算逆轉率,0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”作用于ESBLs+E.coli 24 h,能夠逆轉細菌對第四代頭孢菌素FEP的耐藥性,逆轉率為(13.9±1.2)%,而對第三代頭孢菌素CTX和CRO的影響不大。0.1 g/mL的中藥對FEP、CTX和CRO無明顯影響。見表2。
圖1 中藥“黃金洗劑”處理前后ESBLs+E.coli分離株對抗菌藥物的耐藥性變化
表2 中藥“黃金洗劑”逆轉ESBLs+E.coli耐藥的逆轉率
2.3中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli生物膜形成的影響 通過結晶紫染色法分析中藥對細菌生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn),與中藥未處理組相比,中藥處理組能夠明顯抑制生物膜的形成,0.5 g/mL的中藥處理24 h時,生物膜抑制效果最佳,生物膜抑制率可以達到63%,見圖2。
2.4中藥“黃金洗劑”對ESBLs酶活性的影響 通過分析中藥對ESBLs活性的影響發(fā)現(xiàn),與中藥未處理組相比,0.5 g/mL的中藥處理細菌24 h能夠明顯抑制ESBLs的活性,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),酶活性單位從0.50 U降到0.35 U,見圖3。另外,0.5 g/mL和0.1 g/mL的中藥處理細菌48 h,也能夠略微抑制ESBLs的酶活性,與中藥未處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。
圖2 中藥“黃金洗劑”對ESBLs+E.coli生物膜形成的抑制作用
注:與中藥未處理組比較,*P<0.05。
肛腸疾病患者的機體免疫功能減退,極易發(fā)生條件致病菌感染,尤其是E.coli的感染。同時,ESBLs+E.coli的臨床分離率逐年升高,情況越來越嚴重,給抗感染治療帶來了極大的困難。單純使用抗菌藥物治療E.coli感染極易產生新的耐藥菌,因此,除了常規(guī)的抗菌藥物治療感染性肛腸疾病,常通過中藥坐浴或者外敷進行輔助治療。一方面,中藥坐浴可以達到消腫止痛的目的;另一方面,清熱燥濕或瀉火解毒等功效的中草藥不僅具有廣譜抗菌作用,同時也具有降低細菌耐藥性的功能[9-11]。
復方黃柏洗劑改良方中藥“黃金洗劑”的主藥是黃柏、苦參、金銀花,黃柏具有清熱燥濕、抑菌消炎、瀉火解毒的功效,苦參可清熱解毒,金銀花能消腫燥濕、清熱解毒,在肛腸疾病抗感染治療中效果甚佳[9,12]。黃柏提取液對耐青霉素細菌產生的β-內酰胺酶有不同程度的抑制作用,金銀花水煎劑對質粒的消除率較高[13]。
本研究發(fā)現(xiàn),外用中藥“黃金洗劑”能夠有效抑制ESBLs+E.coli的生長,測得中藥“黃金洗劑”的MIC為0.6 g/mL。同時,本研究發(fā)現(xiàn),0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”處理ESBLs+E.coli 24 h,能夠有效逆轉ESBLs+E.coli對FEP的耐藥性。以上研究結果提示在肛腸疾病抗感染治療中輔以中藥“黃金洗劑”治療,能夠減少耐藥菌的出現(xiàn),提高治愈率??紤]到中藥可以通過改變生物膜形成、影響酶活性等途徑逆轉細菌的耐藥性[9],本研究進行了進一步機制研究,結果發(fā)現(xiàn)0.5 g/mL中藥“黃金洗劑”處理細菌24 h時對生物膜形成的抑制率能達到63%,而此時只表現(xiàn)出對FEP耐藥性的明顯改變,對CTX、CRO的效果并不明顯,這可能與3種抗菌藥物本身的生物膜穿透能力與穿透方式有關,需要進一步深入探討。另外,檢測中藥“黃金洗劑”處理對酶活性的影響,結果發(fā)現(xiàn)0.5 g/mL的中藥“黃金洗劑”作用細菌24 h對ESBLs活性的影響最大,可見中藥“黃金洗劑”能夠部分逆轉細菌對FEP的耐藥性,而沒有逆轉其對CTX、CRO的耐藥性,也可能與中藥對酶的影響有關,中藥改變了ESBLs對第四代頭孢菌素的耐藥性,而沒能改變對第三代頭孢菌素的耐藥性。在進行機制探討的過程中,本研究發(fā)現(xiàn)中藥“黃金洗劑”作用ESBLs+E.coli 24 h效果最好,并沒有呈現(xiàn)“隨著作用時間延長效果提高”的現(xiàn)象,這可能與中藥有效成分被細菌消耗有關,也可能與細菌應對外界不利條件產生群體感應有關[14],具體原因有待進一步研究。以上結果提示中藥作用時間并不是越長越好,而是存在最佳的作用時間,中藥在最佳作用時間才能夠有效地抑制生物膜的形成和ESBLs的酶活性。
鑒于合成藥物可能存在一定的不良反應,中草藥在感染性疾病的治療中發(fā)揮的作用越來越大。有研究發(fā)現(xiàn),藥用草本植物的水提物或者醇提物都具有抑制腸桿菌科細菌生長的功效,這為中草藥在抗感染治療中的應用提供了理論依據(jù)[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)中藥“黃金洗劑”能夠抑制細菌生長、逆轉耐藥菌的耐藥性,這為抗菌藥物聯(lián)合中藥治療耐藥菌感染提供了依據(jù)。但本研究仍有不足,需要進一步探討分析真正起到逆轉耐藥作用的成分,為耐藥菌的防治提供更加有利的指導。
綜上所述,中藥“黃金洗劑”能夠有效抑制ESBLs+E.coli的生長,還能通過改變細菌生物膜形成,影響ESBLs活性,從而發(fā)揮逆轉耐藥菌耐藥性的作用,在臨床抗感染治療中可與抗菌藥物配伍更好地發(fā)揮其作用。