魏詠新，馬 丹，李 丹，徐蕾蕊，魏海燕，張西萌，劉 莉，曾 靜*

（北京海關(guān)技 術(shù)中心，北京 100026）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）O157:H7是一種重要的人獸共患傳染病原菌[1-2]，是腸道出血性E. coli中對(duì)人致病性最強(qiáng)的血清型之一，以食物為主要的傳播途徑，牛、羊、豬 和雞等家畜家禽為主要宿主[3]，其產(chǎn)生的細(xì)菌毒素，可引起出血性結(jié)腸炎，可發(fā)展成溶血性尿毒綜合癥和血小板減少性紫癜，嚴(yán)重者可致死亡[4]。世界上多個(gè)國(guó)家都曾有過(guò)不同規(guī)模的E. coli致病事件爆發(fā)和流行，1982年美國(guó)首次報(bào)道了由E. coliO157:H7引發(fā)的出血性腸炎，緊隨其后加拿大、日本、英國(guó)等國(guó)也接連報(bào)道了E. coliO157:H7的爆發(fā)[5-7]。我國(guó)江蘇、安徽省也曾經(jīng)在1999年爆發(fā)E. coliO157:H7感染性腹瀉，超過(guò)2萬(wàn) 例患者，死亡177 例，流行時(shí)間達(dá)7 個(gè)月之久[8]。

因?yàn)橹虏【L(zhǎng)期與人類(lèi)共存，國(guó)內(nèi)關(guān)于食品中致病菌存在和計(jì)數(shù)要采用危險(xiǎn)性評(píng)估的方法代替零容許值的問(wèn)題正引起日益激烈的爭(zhēng)論，在這種情況下致病菌定量檢測(cè)方法尤為重要[9]。致病菌定量快速檢測(cè)對(duì)于執(zhí)行食品微生物限量標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)食品中的致病微生物進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估更具有實(shí)際的意義[10]。GB 4789.36—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗(yàn)》[11]采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法（或免疫磁珠捕獲法）、生化確認(rèn)與血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合的檢測(cè)方法，檢測(cè)周期長(zhǎng)，操作復(fù)雜且只能實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)。目前我國(guó)還沒(méi)有制定E. coliO157:H7定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，因此本研究旨在建立食品中E. coliO157:H7的絕對(duì)定量檢測(cè)方法，對(duì)E. coliO157:H7的污染水平提供數(shù)據(jù)依據(jù)，為食品安全檢測(cè)、開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等工作提供有效的思路和借鑒。

現(xiàn)有常用的致病菌定量檢測(cè)方法包括平板法、最大可能數(shù)（maximum probable number，MPN）法[12]和分子生物學(xué)檢測(cè)方法等。平板法是常用的活菌計(jì)數(shù)方法，操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、誤差大[13]，不同分離平板對(duì)致病菌計(jì)數(shù)有一定的影響[14]。MPN法屬于半定量檢測(cè)方法[15-16]，為提高檢測(cè)速度及敏感性，多與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法結(jié)合應(yīng)用[17-18]。平板法和MPN方法在涉及大量樣本的情況下需要大量人力[19]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在微生物的檢測(cè)中發(fā)揮了巨大的作用[20]。近年來(lái)，以real-time PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸被廣泛應(yīng)用到致病菌的定量檢測(cè)中。相比較于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，real-time PCR法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異[21]，但該方法屬于相對(duì)定量，結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性在很大程度上依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量及擴(kuò)增效率，并且需要具備已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)品。新興的微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被認(rèn)為是第3代核酸擴(kuò)增技術(shù)[22]，通過(guò)把稀釋到一定濃度的DNA分子分布于10 000～20 000 個(gè)微滴中，使大部分微滴中DNA分子的數(shù)量為1或0，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增和陽(yáng)性信號(hào)的累積讀取陽(yáng)性反應(yīng)單元數(shù)，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出樣本中的DNA分子數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的絕對(duì)定量[23-24]。針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足，本研究擬采用ddPCR技術(shù)建立食品中E. coliO157:H7的快速準(zhǔn)確絕對(duì)定量方法，為制訂食品微生物定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供思路和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Table 1 List of experimental strains

86 株菌（表1），其中包括4 株E. coliO157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株（CICC 24187、CICC 21530、CICC 10669、FEPAS O157），實(shí)驗(yàn)室保存的1 株E. coliO157:H7，1 株產(chǎn)腸毒素（Enterotoxigenic）E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，1 株腸道致病性（Enteropathogenic）E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，1 株腸道侵襲性（Enteroinvasive）E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，1 株腸道集聚性（Enteroaggregative）E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，2 株其他E. coli標(biāo)準(zhǔn)菌株，55 株實(shí)驗(yàn)室分離E. coli，以及18 株其他常見(jiàn)的食源性致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。所有菌株分別在BHI瓊脂平板或2% TSA瓊脂平板（活化弧菌）上活化3 代后，挑取單菌落分別接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)基或10 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水（弧菌培養(yǎng)）中，37 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，取1 mL菌液進(jìn)行10 倍梯度稀釋至10－8，用于細(xì)菌基因組DNA的提取。

1.2 儀器與設(shè)備

培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（貨號(hào)：DP302） 天根生化科技有限公司；THZ-C-1臺(tái)式全溫振蕩器 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Stomacher 400高效拍打式勻漿器 英國(guó)Seward公司；5424小型高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Fr-1io cell恒溫培養(yǎng)箱 德國(guó)MMM公司；Nanodrop2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；QX200 ddPCR系統(tǒng) 美國(guó)伯樂(lè)公司；7900HT Fast real-time PCR儀、GeneAmp 9700 PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物探針設(shè)計(jì)、合成與篩選

參考國(guó)內(nèi)外研究[1,25-26]，選取E. coliO157:H7具有種屬特異性且高度保守的單拷貝溶血素前體蛋白基因hlyA（GenBank EU118026.1）作為靶序列，通過(guò)NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，利用Prime Express軟件V3.0（ABI, Foster City, CA, USA）設(shè)計(jì)出引物/探針1 套，序列見(jiàn)表2。探針5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記BHQ。

表2 ddPCR引物探針序列Table 2 Primer and probe sequences used for ddPCR

首先，利用該引物/探針通過(guò)real-time PCR對(duì)表1中所有菌株進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而通過(guò)ddPCR對(duì)表1中E. coliO157:H7菌株和其他致瀉大腸標(biāo)準(zhǔn)菌株及其他近源菌進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該引物探針的有效性和特異性。

1.3.2E. coliO157:H7純培養(yǎng)液的DNA濃度、平板計(jì)數(shù)及PCR檢測(cè)

1.3.2.1 基因組DNA提取與超微量分光光度計(jì)測(cè)定

E. coliO157:H7 CICC 21530的10 mL BHI過(guò)夜培養(yǎng)物（160 r/min、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h），取1 mL以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）進(jìn)行10 倍梯度稀釋。取過(guò)夜培養(yǎng)物原液至10－8稀釋度菌液各1 mL采用試劑盒法提取DNA，按照試劑盒說(shuō)明將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中。對(duì)提取的純培養(yǎng)液核酸用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定，確保提取核酸的A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，并按下式[19]計(jì)算提取E. coliO157:H7基因組DNA濃度：

式中：m為超微量分光光度計(jì)測(cè)得的核酸質(zhì)量濃度/（ng/μL）；n為細(xì)菌基因組的長(zhǎng)度/bp；根據(jù)NCBI上已經(jīng)發(fā)布的E. coliO157:H7基因組的測(cè)序數(shù)據(jù)，其平均長(zhǎng)度為5.144×106bp。

1.3.2.2 平板計(jì)數(shù)

取1.3.2.1節(jié)中10 倍梯度稀釋的E. coliO157:H7 CICC 21530純培養(yǎng)液10－6、10－7、10－8稀釋度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，吸取1 mL各稀釋度的菌懸液分別加于2 個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。及時(shí)將15～20 mL冷卻至46 ℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，36 ℃倒置培養(yǎng)（24±2）h。選取菌落數(shù)在30～300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，每個(gè)稀釋度菌落數(shù)取兩個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值。

1.3.2.3 real-time PCR檢測(cè)

取1.3.2.1節(jié)中過(guò)夜培養(yǎng)物原液至10－8稀釋度菌液各1 mL提取的DNA進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。real-time PCR體系中上下游引物hlyA-F、hlyA-R和探針hlyA-P濃度均為500 nmol/L，然后加入10 μL 2×PCR master mix，DNA模板2 μL，用去離子水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)體系置于real-time PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為50 ℃酶激活2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火及延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用SDS 3.2軟件進(jìn)行分析。

經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)得純培養(yǎng)液核酸濃度，代入1.3.2.1節(jié)公式算得提取到的目標(biāo)菌基因組DNA濃度（拷貝數(shù)/μL），根據(jù)體積算得試劑盒法提取的50 μL中目標(biāo)菌基因組濃度（拷貝數(shù)/50 μL），也就是1 mL菌液中的濃度（拷貝數(shù)/mL），設(shè)計(jì)引物探針的hlyA基因?yàn)閱慰截惢颍?拷貝基因組對(duì)應(yīng)1 個(gè)CFU菌落，可得到1 mL菌液中的細(xì)菌個(gè)數(shù)（CFU/mL）。

1.3.2.4 ddPCR檢測(cè)

表3 ddPPCCRR體系Table 3 Composition of ddPCR reaction system

取1.3.2.1節(jié)過(guò)夜培養(yǎng)物原液至10－8稀釋度菌液提取的DNA同時(shí)進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。將20 μL的ddPCR預(yù)混液（表3）和70 μL微滴生成油分別加入到8 孔微滴生成卡中，置于微滴生成儀中生成微滴。將生成的油包水的微滴（40 μL）緩慢轉(zhuǎn)移至96 孔板中，封膜后置于PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)（升降溫速率≤2.5 ℃/s）：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火及延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)；98 ℃固化微滴10 min；4 ℃反應(yīng)結(jié)束。將擴(kuò)增后的96 孔板置于微滴讀取儀中，利用QuantaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。

ddPCR可直接測(cè)得每反應(yīng)的目標(biāo)基因濃度（拷貝數(shù)/反應(yīng)），即試劑盒法提取的DNA中2 μL的目標(biāo)基因濃度，計(jì)算可得50 μL中的目標(biāo)基因濃度（拷貝數(shù)/50 μL），即1 mL菌液中的目標(biāo)基因濃度（拷貝數(shù)/mL），1拷貝基因?qū)?yīng)1 個(gè)CFU菌落，也就是1 mL菌液中的細(xì)菌個(gè)數(shù)（CFU/mL）。

1.3.3 人工污染三文魚(yú)樣品的平板計(jì)數(shù)、real-time PCR、ddPCR定量檢測(cè)

選擇GB 4789.36—2016[11]驗(yàn)證無(wú)E. coli O157:H7的三文魚(yú)樣品作為食品添加基質(zhì)。取E. coli O157:H7 CICC 21530過(guò)夜培養(yǎng)菌懸液的10－3、10－4、10－5、10－6、10－7稀釋度菌液各25 mL分別添加到盛有無(wú)菌稱(chēng)樣25 g三文魚(yú)肉樣品的均質(zhì)袋中，各添加水平分別設(shè)3 個(gè)樣品重復(fù)，另無(wú)菌稱(chēng)取1 份25 g三文魚(yú)肉樣品加入25 mL PBS代替添加菌液作為陰性對(duì)照，用拍擊式勻漿器拍擊2 min，制成系列1∶1含有不同添加水平E. coli O157:H7的污染樣品。對(duì)以上5 個(gè)添加水平的每份人工污染三文魚(yú)樣品分別梯度稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

取以上5 個(gè)添加水平的每份人工污染三文魚(yú)樣品勻漿液各2 mL（含1 g三文魚(yú)樣品）用試劑盒法提取DNA，最終將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中，分別進(jìn)行real-time PCR和ddPCR檢測(cè)。real-time PCR以1.3.2.1節(jié)梯度稀釋的純培養(yǎng)液DNA作為標(biāo)準(zhǔn)品，以檢測(cè)Ct值為縱坐標(biāo)，核酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將人工污染三文魚(yú)樣品勻漿液中提取DNA檢測(cè)Ct值代入回歸公式，得到其核酸濃度，代入1.3.2.1節(jié)公式得到目標(biāo)菌基因組DNA的拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/μL），按照1.3.2.3節(jié)計(jì)算可得2 mL勻漿液中的細(xì)菌個(gè)數(shù)，即1 g三文魚(yú)肉樣品中的細(xì)菌個(gè)數(shù)（CFU/g）。

ddPCR直接測(cè)得每反應(yīng)的目標(biāo)基因拷貝數(shù)（拷貝數(shù)/反應(yīng)），按照1.3.2.4節(jié)計(jì)算可得2 mL勻漿液中的細(xì)菌個(gè)數(shù)，也就是1 g三文魚(yú)肉樣品中的細(xì)菌個(gè)數(shù)（CFU/g），從而得到平板計(jì)數(shù)、real-time PCR及ddPCR 3 種測(cè)定方法統(tǒng)一的測(cè)定值計(jì)算單位，比較平板計(jì)數(shù)、real-time PCR及ddPCR的測(cè)定值效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法特異性分析

real-time PCR方法驗(yàn)證引物和探針的特異性。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取表1中所列菌株純培養(yǎng)物的基因組DNA，結(jié)果表明，7 株E. coli O157:H7菌株（CICC 24187、CICC 10669、實(shí)驗(yàn)室自存E. coli O157:H7菌3 株、FEPAS O157、CICC 21530）均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，而其他E. coli及常見(jiàn)的食源性致病菌檢測(cè)均呈陰性（圖1A）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ddPCR方法的特異性，梯度稀釋7 株E. coli O157:H7菌株（CICC 24187、CICC 10669、實(shí)驗(yàn)室自存E. coli O157:H7菌3 株、FEPAS O157、CICC 21530）及8 株近源菌株（Enterotoxigenic E. coli CICC 24190、Enteropathogenic E. coli CICC 24189、Enteroinvasive E. coli CICC 24188、Enteroaggregative E. coli CICC 24186、E. coli CICC 10003、E. coli ATCC 25922、實(shí)驗(yàn)室自存E. coli 2 株、S. flexneri ATCC 12022）的各基因組DNA稀釋至10－4，用于ddPCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)平行重復(fù)，同時(shí)以無(wú)菌水代替模板作為陰性對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7 株E. coli O157:H7菌株均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，而其他E. coli及常見(jiàn)的食源性致病菌檢測(cè)均呈陰性，無(wú)陽(yáng)性微滴（圖1B），證明該組引物探針在ddPCR擴(kuò)增體系中具有良好的特異性。

圖1 hhllyyAA引物探針real-time PCR（A）和ddPCR（B）特異性結(jié)果Fig. 1 Comparison of speci ficity for hlyA between real-time PCR (A)and ddPCR (B)

2.2 E. coli O157:H7 CICC 21530純培養(yǎng)液的3 種檢測(cè)方法測(cè)定值

2.2.1 real-time PCR測(cè)定值

取E. coli O157:H7 CICC 21530過(guò)夜培養(yǎng)物1 mL，提取基因組DNA經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)量濃度為671 ng/μL，代入1.3.2.1節(jié)公式算得提取到的基因組DNA濃度為1.19×108拷貝數(shù)/μL，按照1拷貝基因組對(duì)應(yīng)1 個(gè)CFU菌落，則原始菌液菌落數(shù)為9.77（lg（CFU/mL））。

2.2.2 平板計(jì)數(shù)測(cè)定值

E. coliO157:H7 CICC 21530過(guò)夜培養(yǎng)菌液經(jīng)10 倍梯度稀釋后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，測(cè)得原始菌液濃度為2.0×109CFU/mL，即菌落數(shù)為9.30（lg（CFU/mL））。

2.2.3 ddPCR測(cè)定值及3 種檢測(cè)方法測(cè)定值對(duì)比

ddPCR在10－2稀釋度達(dá)到檢測(cè)上限，陽(yáng)性微滴的比率達(dá)100%，10－3～10－7稀釋度菌液的測(cè)定值結(jié)果變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均小于20%（表4），根據(jù)10－3～10－7稀釋度菌液的ddPCR結(jié)果計(jì)算出原菌液中E. coliO157:H7菌落數(shù)在8.93～9.11（lg（CFU/mL））范圍內(nèi)（表4）。ddPCR定量限為105 CFU/mL（相當(dāng)于4.2 拷貝數(shù)/反應(yīng)），檢出限為25 CFU/mL（相當(dāng)于1 拷貝/反應(yīng)）（圖2、表4）。

表4 梯度稀釋的E. coollii O157:H7 CICC 21530純菌液ddPCR定量檢測(cè)結(jié)果Table 4 ddPCR quantitative results of gradient dilutions of pure E. ccoollii O157:H7 CICC 21530 culture

圖2 梯度稀釋的E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液的ddPCR擴(kuò)增微滴分布Fig. 2 ddPCR microdroplet distribution of gradient dilutions of pure E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

圖3 梯度稀釋的E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液的real-time PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 3 Real-time PCR ampli fication patterns of gradient dilutions of pure E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

對(duì)各稀釋度菌液提取到的DNA同時(shí)進(jìn)行real-time PCR和ddPCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均可檢測(cè)到10－7稀釋度（圖2、3）。real-time PCR在10－1～10－7稀釋度范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果呈良好的線性關(guān)系（Y=－3.54X+36.91，R2=0.999 8），標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率－3.54。ddPCR在測(cè)定值范圍（10－3～10－7稀釋度）內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，不同稀釋度菌液計(jì)算出原菌液中目標(biāo)菌lg值的CV僅0.9%，平均值為9.01（lg（CFU/mL）），比real-time PCR和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定值分別低0.76、0.29（lg（CFU/mL））（圖4）。

圖4 E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液中基因組濃度測(cè)定值比較Fig. 4 Comparison of measured genomic DNA concentrations of gradient dilutions of E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

2.3 人工污染三文魚(yú)樣品的3 種檢測(cè)方法測(cè)定值及分析

2.3.1 平板計(jì)數(shù)測(cè)定值

表5 人工污染三文魚(yú)樣品中E. coli O157:H7 CICC 21530的ddPCR、real-time PCR測(cè)定值及平板計(jì)數(shù)結(jié)果Table 5 ddPCR, real-time PCR and plate counting results of E. coli O157:H7 CICC 21530 in artifificially contaminated salmon samples

對(duì)各個(gè)添加水平的人工污染三文魚(yú)樣品分別梯度稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果，10－3～10－7菌液污染樣品中目標(biāo)菌E. coliCICC 21530菌落數(shù)測(cè)定結(jié)果分別為1 126 667、85 667、9 000、980、130 CFU/g（表5）。

2.3.2 real-time PCR測(cè)定值結(jié)果

在進(jìn)行real-time PCR時(shí)，以10 倍梯度稀釋的CICC 21530基因組DNA（經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定其原液濃度為1.19×108拷貝數(shù)/μL）作為標(biāo)準(zhǔn)品，同人工污染樣品中提取的DNA一起進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 個(gè)不同污染水平（10－3～10－7）的三文魚(yú)樣品均呈陽(yáng)性擴(kuò)增，real-time PCR擴(kuò)增曲線如圖5所示，根據(jù)檢測(cè)Ct值和得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算污染樣品中E. coliO157:H7平均含量分別為4 933 333、613 333、48 667、7 233、575 CFU/g（表5）。

圖5 人工污染三文魚(yú)樣品real-time PCR檢測(cè)擴(kuò)增曲線圖Fig. 5 Real-time PCR ampli fication curves of arti ficially contaminated salmon samples

2.3.3 ddPCR測(cè)定值結(jié)果及3 種定量檢測(cè)方法比較分析

圖6 人工污染三文魚(yú)樣品的ddPCR擴(kuò)增微滴分布Fig. 6 ddPCR microdroplet distribution of arti ficially contaminated salmon samples

圖6 顯示，隨著污染水平的下降，出現(xiàn)的陽(yáng)性微滴數(shù)量逐漸減少，根據(jù)陽(yáng)性微滴數(shù)量和泊松分布原理，由QuantaSoft軟件測(cè)定并根據(jù)計(jì)算得到E. coliCICC 21530菌落數(shù)分別為917 000、80 200、8 330、943、110 CFU/g（表5）?？傮w而言，real-time PCR和ddPCR的測(cè)定結(jié)果同平板計(jì)數(shù)測(cè)定值間均存在良好的相關(guān)性，但是realtime PCR的測(cè)定值結(jié)果明顯高于ddPCR及平板計(jì)數(shù)測(cè)定值。t檢驗(yàn)結(jié)果表明ddPCR和平板計(jì)數(shù)兩種方法對(duì)稀釋度10－4～10－7菌液污染樣品的定量結(jié)果均無(wú)顯著性差異（P＞0.05，表5）；在10－3～10－7菌液污染水平上，realtime PCR的測(cè)定結(jié)果明顯偏高，與ddPCR測(cè)定值結(jié)果和平板計(jì)數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05，表5）?？梢?jiàn)ddPCR對(duì)于人工污染樣品的測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，在不經(jīng)增菌培養(yǎng)的條件下，其檢出限為110 CFU/g。

2.4 重復(fù)性分析

針對(duì)E. coliCICC 21530純培養(yǎng)液和人工污染三文魚(yú)的ddPCR檢測(cè)結(jié)果均可用來(lái)分析整體檢測(cè)的重復(fù)性。由表4和表5可見(jiàn)，在整個(gè)定量檢測(cè)有效動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，針對(duì)E. coliCICC 21530hlyA基因的測(cè)定結(jié)果CV均小于20%，證明該方法用于E. coliCICC 21530定量檢測(cè)時(shí)具有良好的重復(fù)性[27]。而且在對(duì)人工污染三文魚(yú)樣品的檢測(cè)中，ddPCR定量結(jié)果的CV普遍小于real-time PCR，說(shuō)明ddPCR具有更好的定量重復(fù)性，特別是對(duì)于低污染水平樣品這種優(yōu)勢(shì)更加明顯（表5）。

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外已有應(yīng)用ddPCR技術(shù)定量檢測(cè)致病菌的相關(guān)研究，但食品基質(zhì)多富含蛋白、脂肪、果膠等核酸擴(kuò)增抑制成分，背景菌構(gòu)成復(fù)雜且濃度較高，因此，對(duì)食品基質(zhì)中食源性致病菌的定量檢測(cè)研究尚不多見(jiàn)。董蓮華等[3]以E. coliO157:H7的rfbE基因?yàn)榘谢?，建立了可?duì)其準(zhǔn)確定量的ddPCR方法。Verhaegen等[28]比較ddPCR及real-time PCR方法定量檢測(cè)牛糞中產(chǎn)志賀毒素E. coli得出，在不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，ddPCR方法相對(duì)realtime PCR在農(nóng)場(chǎng)絕對(duì)定量檢測(cè)產(chǎn)志賀毒素E. coli中有優(yōu)勢(shì)。周巍等[29]以金黃色葡萄球菌nuc基因?yàn)榘袠?biāo)基因，建立了發(fā)酵乳中ddPCR技術(shù)定量檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。方佩佩等[30]采用ddPCR技術(shù)建立副溶血性弧菌快速定量檢測(cè)，以鱈魚(yú)為樣品進(jìn)行陽(yáng)性添加，研究表明ddPCR定量檢測(cè)技術(shù)特異性良好、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確。Gobert等[31]研究表明ddPCR對(duì)較低數(shù)量的活細(xì)胞的定量效果最好，ddPCR在干擾菌背景下，無(wú)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以對(duì)少量活菌細(xì)胞進(jìn)行特異性定量。本研究根據(jù)高保守特異性序列設(shè)計(jì)篩選了一套特異性良好的引物探針，利用純菌液檢測(cè)建立食品中E. coliO157:H7的ddPCR快速定量檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)人工污染食品樣品的檢測(cè)驗(yàn)證該方法的實(shí)際應(yīng)用性。通過(guò)純菌液及人工污染樣品檢測(cè)的ddPCR定量結(jié)果與平板計(jì)數(shù)及real-time PCR的定量結(jié)果的特異性、靈敏度和重復(fù)性比較，認(rèn)為建立的ddPCR技術(shù)可以應(yīng)用到實(shí)際食品的定量檢測(cè)中。

本研究結(jié)果顯示平板計(jì)數(shù)定量結(jié)果與ddPCR定量結(jié)果接近，real-time PCR定量結(jié)果偏高。ddPCR屬于絕對(duì)定量，具有無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線、不受PCR擴(kuò)增效率影響、對(duì)PCR抑制劑不敏感等特點(diǎn)，real-time PCR屬于相對(duì)定量，結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性在很大程度上依賴于所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量及擴(kuò)增效率。目前沒(méi)有官方權(quán)威機(jī)構(gòu)可以提供具有明確量值（即核酸拷貝數(shù)或質(zhì)量濃度）的E. coli O157:H7核酸標(biāo)準(zhǔn)品，本研究采用超微量分光光度計(jì)測(cè)量核酸分子在260 nm波長(zhǎng)處吸光度，根據(jù)1.3.2.1節(jié)公式計(jì)算定量值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品/樣品基質(zhì)中其他DNA或RNA分子以及蛋白等雜質(zhì)成分可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，樣品中也可能存在核酸擴(kuò)增抑制成分導(dǎo)致擴(kuò)增效率的差異，導(dǎo)致real-time PCR定量結(jié)果偏高。

本研究建立的ddPCR檢測(cè)技術(shù)的定量限為105 CFU/mL（相當(dāng)于4.2 拷貝數(shù)/反應(yīng)），檢出限為25 CFU/mL，人工污染食品樣品檢出限為110 CFU/g，適用于食品中高污染E. coli O157:H7的定量檢測(cè)應(yīng)用。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.36—2016檢測(cè)周期為3～5 d，本研究建立的檢測(cè)方法從提取DNA到ddPCR檢測(cè)僅需1 d，大幅縮短檢測(cè)周期，為E. coli O157:H7的防控和監(jiān)管工作提供技術(shù)支持，對(duì)食品安全檢測(cè)、開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測(cè)、控制疫情擴(kuò)散、提高病原菌檢出效率等均有重要意義[32]。

本研究的目標(biāo)菌液是經(jīng)過(guò)18 h搖菌培養(yǎng)后細(xì)菌活性較好的對(duì)數(shù)期菌液，但是不能保證菌液中沒(méi)有死菌體，即游離DNA，ddPCR屬于分子檢測(cè)手段，本實(shí)驗(yàn)使用的DNA提取試劑盒并不能有效去除死菌體的DNA，暫時(shí)不清楚是否會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生決定性影響。選取添加的食品基質(zhì)是經(jīng)過(guò)篩選的未含有目標(biāo)菌的三文魚(yú)水產(chǎn)品，但食品類(lèi)別豐富，基質(zhì)復(fù)雜多樣，尤其部分生食食品還可能有多種近源微生物干擾，故提取DNA前有效去除菌液中的游離DNA，進(jìn)一步降低定量限，擴(kuò)大檢測(cè)對(duì)象，針對(duì)多種食品基質(zhì)的ddPCR定量檢測(cè)為以后研究的方向及重點(diǎn)。