馬 寧，王 杰，裴 斐，方 勇，楊文建，胡秋輝*

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

中國(guó)是豬肉消費(fèi)大國(guó)，年消耗量接近全球總量一半，是人民日常飲食中必不可少的組成部分[1]。近年來，接連曝出“瘦肉精”、“病死豬肉”等事件引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注，肉制品監(jiān)管成為了民眾熱切關(guān)心的話題?？咕愃幓谄鋸V譜抗菌性和廉價(jià)性是目前最為常用的獸藥，其中根據(jù)合成方式可分為微生物分泌的天然抗生素（以四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類為代表）和合成抗生素（以磺胺類、喹諾酮類為代表）。隨著 政府部門的監(jiān)督管理的加強(qiáng)，鹽酸克侖特羅等禁用藥物正在逐漸減少，而抗菌類藥物由于其規(guī)定的最高殘留限量值較為寬松，其檢出率近年來有增加的趨勢(shì)，養(yǎng)殖戶如果未能嚴(yán)格遵守休藥期規(guī)定則會(huì)容易引起殘 留量檢出或超標(biāo)[2-4]。養(yǎng)殖過程中使用獸藥無法避免，但是非法使用禁用藥、過量使用限量藥、不遵守休藥期規(guī)定、屠宰前用藥的情況普遍存在。研究表明，抗菌類獸藥具有致癌、致畸、致突變性，長(zhǎng)期食用超過每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的食品，會(huì)導(dǎo)致各種急慢性中毒。此外，畜禽長(zhǎng)期過量服用某類獸藥會(huì)產(chǎn)生耐藥菌株，影響其臨床效果[5-7]。因此對(duì)豬肉產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估十分必要。

QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe）方法是在分散固相萃取技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)的一種前處理技術(shù)[8-10]。該方法一般以乙腈或酸化乙腈作為提取劑，NaCl、無水Na2SO4等無機(jī)鹽作為吸水劑，C18、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）等聚合物作為吸附劑吸附干擾物[11-13]。Martínez-Villalba等[14]使用甲醇-乙腈提取，MgSO4-PSA凈化，檢測(cè)了飼料和動(dòng)物源性食品中抗寄生蟲藥殘留，回收率為65%～95%。León等[15]使用0.1%乙酸-乙腈作為提取劑，NaCl、MgSO4、磁性吸附劑作為凈化劑，檢測(cè)了飼料中77 種獸藥殘留，回收率達(dá)80%～120%的良好效果。QuEChERS方法省時(shí)、操作簡(jiǎn)便、提取效果好，但是該方法研發(fā)之初是以果蔬為目標(biāo)基質(zhì)，對(duì)于脂含量較高的動(dòng)物源性食品的應(yīng)用還需要進(jìn)一步探索優(yōu)化。目前由安捷倫公司推出的一款新型萃取鹽包作為增強(qiáng)型脂質(zhì)去除技術(shù)（enhanced matrix removal lipid，EMR-L）改進(jìn)QuEChERS方法的去脂能力。Anumol等[16]在三重四極桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)上比較E MR-L與分散固相萃取技術(shù)，結(jié)果顯示EMR-L不論處理不同樣品還是在不同質(zhì)譜平臺(tái)檢測(cè)，都具有明顯優(yōu)勢(shì)。Zhao Limian等[17]對(duì)EMR-L進(jìn)行優(yōu)化，提出兩步萃取法對(duì)豬肉中獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示有90%以上的藥物回收率在60%～120%之間。

國(guó)內(nèi)外對(duì)食品安全評(píng)估方法的研究大多遵循以下4 個(gè)步驟：危害識(shí)別、危害特征描述、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)特征描述[18-20]。其中暴露評(píng)估是食品安全評(píng)估的關(guān)鍵，包括物理、化學(xué)和生物性危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[21]。決策評(píng)估法是歐洲評(píng)估膳食化學(xué)物風(fēng)險(xiǎn)的常用方法，尤其適用于單一殺蟲劑，但是不適合用于整體人群的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[22]。相對(duì)潛力因子評(píng)估是對(duì)膳食化合物的暴露評(píng)估、特別是殺蟲劑的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法。Sharma等[23]對(duì)有機(jī)磷酯、氨基甲酸酯等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，認(rèn)為該方法只能在具有劑量累計(jì)效應(yīng)時(shí)使用。本研究采用Thomas等[24]的食品安全指數(shù)（food safety index，IFS）評(píng)估模型，通過比較人體污染物實(shí)際攝入量與安全攝入量評(píng)估食品中某種化學(xué)殘留對(duì)消費(fèi)者健康影響。張聞娟等[25]使用IFS模型對(duì)雞肉中磺胺類藥物進(jìn)行積累性暴露評(píng)估，研究表明該模型適用于整體人群的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

目前，對(duì)動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的研究主要集中在檢測(cè)技術(shù)手段，生豬從屠宰—預(yù)冷—物流銷售環(huán)節(jié)中的磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類等獸藥殘留分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估尚屬空白。本研究選取江蘇南京為研究區(qū)域，隨機(jī)抽檢 某屠宰 場(chǎng)屠宰、預(yù)冷階段肌肉、內(nèi)臟等樣本240 份，及南京市4 個(gè)地區(qū)480 份市售豬肉樣品，采用EMR-L方法提取凈化，超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-Q-TOF/MS）分析檢測(cè)，并使用IFS模型評(píng)估南京市豬肉中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類藥物殘留水平和風(fēng)險(xiǎn)水平，旨在為相關(guān)部門執(zhí)法和監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸、正己烷（均為色譜純）德國(guó)Merck公司；EMR-Lipid QuEChERS萃取鹽包美國(guó)Agilent公司。

43 種標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噻唑、磺胺喹惡啉、磺胺氯噠嗪、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺苯酰、磺胺醋酰、磺胺苯吡唑、環(huán)丙沙星、克林沙星、恩諾沙星、氟甲喹、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、惡喹酸、培氟沙星、依諾沙星、萘啶酸、西諾沙星、二氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、吉他霉素、泰樂霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、青霉素V、阿莫西林、氨芐西林、頭孢拉定美國(guó)Sigma公司（純度≥99%）。分別準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解稀釋，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于－20 ℃冰箱中貯存，保存期限為1 個(gè)月。根據(jù)需要將上述儲(chǔ)備液混合稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600+飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI）及Analyst1.7數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)AB公司；Nexer系列UPLC儀（包括DGU-20A5R脫氣機(jī)、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、SPDM-20A紫外檢測(cè)器、CTO-30A柱溫箱及LC-30AD溶液輸送單元） 日本島津公司；Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm） 美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millipore公司；DL-5C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；T18均質(zhì)機(jī)德國(guó)IKA公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠；Quintix125D-1CN十萬分之一天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

選擇某屠宰場(chǎng)作為屠宰和預(yù)冷階段豬肉樣本采集場(chǎng)所，該屠宰場(chǎng)豬肉商品長(zhǎng)期銷往南京各區(qū)，日均屠宰量約為1 500 頭。根據(jù)NY/T 1897—2010《動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范》屠宰動(dòng)物計(jì)算抽樣的方法，屠宰量為501～2 000 頭時(shí)，抽樣個(gè)數(shù)為10 份，不同部位在屠宰和預(yù)冷階段隨機(jī)抽樣，抽樣部位如圖1所示（肌肉組織代表性內(nèi)臟：豬肝、豬腎），現(xiàn)取現(xiàn)測(cè)。

圖1 豬肉組織樣品抽樣分布圖Fig. 1 Picture for sampling distribution of porcine carcass

本實(shí)驗(yàn)將南京市分為4 個(gè)地區(qū)進(jìn)行抽樣分析，根據(jù)上述抽樣部位，每個(gè)地區(qū)抽樣10 份共480 份樣品。具體抽樣地區(qū)為：A棲霞區(qū)；B浦口區(qū)；C南京市區(qū)包括建鄴區(qū)、雨花臺(tái)區(qū)、白下區(qū)、玄武區(qū)、鼓樓區(qū)和秦淮區(qū)；D江寧區(qū)。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取方法

分別稱取2 g（精確至0.1 g）均質(zhì)后的豬肉、豬肝和豬腎加入至含有10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液的50 mL離心管中。渦旋混勻5 min后40 ℃超聲水浴10 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.3.2.2 凈化方法

將5 mL超純水加入EMR-L dSPE管中，渦旋15 s使其充分活化。取5 mL上清液立即加入活化后的EMR-L dSPE管中，渦旋5 min，40 ℃超聲水浴10 min，以4 000 r/min離心5 min，收集5 mL上清液加入EMR-L Polish管中，重復(fù)上述渦旋、超聲及離心步驟，取上層清液過0.22 μm濾膜待測(cè)。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～2.5 min，95%～45% A，5%～55% B；2.5～5 min，45%～10% A，55%～90% B；5～7 min，10%～95% A，90%～5% B。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子模式，離子源溫度550 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣流速40 μL/min；輔助加熱氣流速40 μL/min；氣簾氣流速20 μL/min；去簇電壓100 V；離子富集時(shí)間0.05 s；掃描范圍m/z100～1 000質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 43 種獸藥的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Parameters for UHPLC-MS MS analysis of the 43 veterinary drugs

續(xù)表1

1.3.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

由于化學(xué)污染物的毒害作用與其進(jìn)入人體的絕對(duì)量有關(guān)，所以采用IFS評(píng)價(jià)某種食品是否安全應(yīng)以人體對(duì)污染物的實(shí)際攝入量與其安全攝入量比較更為科學(xué)合理[26-28]。在全面考慮研究的消費(fèi)者人群飲食習(xí)慣及各種食品和化學(xué)物質(zhì)的殘留情況下，IFS值具備加和性。因此本研究采用IFS值評(píng)估豬肉在屠宰加工過程中磺胺類和喹諾酮類藥物對(duì)人群的危害程度，采用平均值評(píng)估消費(fèi)人群的安全狀態(tài)[29]。計(jì)算如式（1）～（3）所示：

式中：EDIC為目標(biāo)化合物實(shí)際攝入量的估算值；Ri為樣品i中目標(biāo)化合物殘留量/（μg/kg）；Fi為樣品i估計(jì)日攝入量/（kg/（人·d））；Ei為樣品i的可食用部分因子；Pi為樣品i的加工處理因子；SIC為目標(biāo)化合物的每日允許攝入量；bw為人體平均質(zhì)量/kg；f為校正因子；n為檢出獸藥種類。根據(jù)國(guó)際食物政策研究所2017年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示2016年中國(guó)人均豬肉消費(fèi)量約為56 kg，因此，本實(shí)驗(yàn)中Fi值按0.15 kg/（人·d）計(jì)算（56/365=0.153 kg），人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，f、Ei和Pi按1計(jì)算。

IFSC大于1表示目標(biāo)化合物對(duì)食品安全的風(fēng)險(xiǎn)較高不可接受，必須采取相應(yīng)預(yù)防措施；IFSC小于等于1表示目標(biāo)化合物對(duì)食品安全的風(fēng)險(xiǎn)可接受；IFSC遠(yuǎn)小于1表示目標(biāo)化合物對(duì)食品安全沒有影響。大于1表示消費(fèi)人群的安全狀態(tài)不可接受；小于等于1表示消費(fèi)人群的安全狀態(tài)可接受；遠(yuǎn)小于1表示消費(fèi)人群的安全狀態(tài)良好[30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的溶 劑標(biāo)準(zhǔn)曲線（加標(biāo)量1、5、10、20、50、100 μg/kg）。以定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)軸，質(zhì)量濃度（x，μg/L）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得到豬肉產(chǎn)品中線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，表明經(jīng)過3 種方法處理過的43 種獸藥在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 檢出限和定量限

以3 倍信噪比計(jì)算得到檢出限為0.25～1.5 μg/kg，10 倍信噪比算得定量限為0.5～6.0 μg/kg，證明本方法滿足對(duì)實(shí)際樣品痕量分析。

2.1.3 回收率和精密度

取空白樣品加入43 種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成5、10、20 μg/kg三個(gè)水平的添加樣品各6 份，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，平均回收率為69.8%～112.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～14.9%，均滿足殘留限量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 屠宰和預(yù)冷階段豬肉產(chǎn)品中43 種獸藥殘留水平

屠宰過程豬肉產(chǎn)品中43 種獸藥的檢出情況如表2所示。240 份豬肉產(chǎn)品中有4 份磺胺二甲嘧啶檢出，殘留量為15.91 μg/kg和3.98 μg/kg（預(yù)冷：14.87、3.16 μg/kg），未超過國(guó)家規(guī)定的最高殘留限量25 μg/kg。此外有2 份二氟沙星在豬肝中檢出，殘留量為19.03 μg/kg（預(yù)冷：15.26 μg/kg），未超過國(guó)家規(guī)定的最高殘留限量800 μg/kg。在豬肉及內(nèi)臟樣品中，有6 份恩諾沙星檢出，殘留量分別為14.84、3.87 μg/kg和19.94 μg/kg（預(yù)冷：13.61、2.43 μg/kg和18.71 μg/kg），均未超過國(guó)家規(guī)定的最高殘留限量100 μg/kg。本次采樣中43 種獸藥檢出率為5%。

表2 43 種獸藥檢出情況Table 2 Detection rates of 43 veterinary drugs during slaughter and pre-cooling

2.3 屠宰和預(yù)冷階段豬肉產(chǎn)品中43 種獸藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

通過IFS進(jìn)行殘留評(píng)估，如表3所示?；前范奏奏DI分別為2.39、0.60 μg/（人·d）（預(yù)冷：2.23、0.47 μg/（人·d））；二氟沙星EDI為2.85 μg/（人·d）（預(yù)冷：2.29 μg/（人·d））；恩諾沙星EDI分別為2.23、0.58 μg/（人·d）和2.99 μg/（人·d）（預(yù)冷：2.04、0.36 μg/（人·d）和2.81 μg/（人·d））。其中有2 份恩諾沙星檢出樣品的EDI大于最大攝入量（2 μg/（人·d））。IFS范圍為9.00×10－4～4.83×10－2，均遠(yuǎn)小于1，表明本實(shí)驗(yàn)研究的43 種獸藥殘留對(duì)南京市地區(qū)豬肉的食品安全沒有影響。

表3 3 種獸藥的ADI、EDI及IFSTable 3 ADIs, EDIs and IFS for three veterinary drugs

2.4 南京市售豬肉產(chǎn)品43 種獸藥殘留與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

為了系統(tǒng)評(píng)估豬肉產(chǎn)品中43 種獸藥對(duì)消費(fèi)人群的影響，本實(shí)驗(yàn)選取南京市4 個(gè)地區(qū)的各大超市作為采樣地點(diǎn)，按1.3.1節(jié)抽樣分布圖，每個(gè)區(qū)分別抽取12 種不同部位豬肉樣品各10 份，共抽樣480 份。如表4所示，在本次抽樣中，共有磺胺二甲嘧啶、二氟沙星、氟甲喹、恩諾沙星、沙拉沙星5 種藥物檢出，均未超過國(guó)家規(guī)定的最高殘留限量，檢出率為4.4%。按1.3.3節(jié)方法計(jì)算EDI與IFS值（表5），結(jié)果顯示，IFS為1.6×10－3～5.94×10－2，為4.08×10－3～1.27×10－2，均遠(yuǎn)小于1，表明南京市4 個(gè)區(qū)市售豬肉中43 種獸藥殘留的安全狀態(tài)可以接受。值得注意的是，對(duì)于恩諾沙星和沙拉沙星這類ADI值較低的物質(zhì)，在A（棲霞區(qū)）、C（市區(qū)）和D（江寧區(qū)）檢出樣品中低于其EDI值。

表4 南京市售豬肉檢出情況Table 4 Detection rates of 43 veterinary drugs in pork samples sold in Nanjing

表5 南京市售豬肉殘留的ADI、EDII及IIFFSSTable 5 ADIs, EDIs and IFS for pork residues in pork samples sold in Nanjing

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)NY/T 1897—2010隨機(jī)抽取240 件樣品，抽樣部位包括肌肉組織和內(nèi)臟組織等12 種。運(yùn)用EMR-L方法提取凈化，UHPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)屠宰和預(yù)冷階段43 種磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類獸藥殘留，并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果表明，43 種獸藥中有磺胺二甲嘧啶、二氟沙星和恩諾沙星檢出，檢出率為5%，含量為2.43～19.94 μg/kg。其中，1 份后腿肉及1 份豬腎樣品中恩諾沙星每日暴露量大于最大攝入 量。本實(shí)驗(yàn)采用IFS評(píng)價(jià)43 種獸藥對(duì)消費(fèi)人群健康的影響，IFS值均遠(yuǎn)小于1，表明南京市豬肉產(chǎn)品中43 種獸藥殘留的安全狀態(tài)可以接受。通過追蹤抽檢預(yù)冷樣品發(fā)現(xiàn)，檢出樣品經(jīng)尸僵、成熟后檢測(cè)結(jié)果與屠宰時(shí)差異不明顯，說明在屠宰和預(yù)冷階段中沒有43 種獸藥的二次污染。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)南京市4 個(gè)地區(qū)市售豬肉進(jìn)行抽樣檢測(cè)，總計(jì)480 份，檢出率為4.4%，IFS與值均遠(yuǎn)小于1，表明南京市售豬肉產(chǎn)品中磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)脂類和β-內(nèi)酰胺類藥物殘留量對(duì)人群健康不會(huì)造成危害效應(yīng)，監(jiān)管部門不必采取風(fēng)險(xiǎn)管理程序。但值得注意的是，豬耳及后腿肉中藥物檢出率較高，這是由于肉豬給藥方式一般為臀部肌肉注射和耳靜脈注射。與此同時(shí)，恩諾沙星和沙拉沙星此類ADI較低的藥物，其EDI值易高于ADI值，反映出養(yǎng)殖戶需要進(jìn)一步嚴(yán)格執(zhí)行休藥期規(guī)定，以及本市食品監(jiān)管存在一定安全隱患，政府部門需要加強(qiáng)對(duì)此類藥物監(jiān)管。