吳少明，蔡小明，周 鵬，蔡慧欽，梁 敏，陳言凱，李燕平，馮麗鳳，林浩學(xué)，黃 媛

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，福建 福州 350002）

丁香酚類化合物，主要包括丁香酚與異丁香酚、甲基丁香酚與甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯與乙?；惗∠惴? 組同分異構(gòu)體，自20世紀70年代初被發(fā)現(xiàn)具有強烈的麻醉作用而被廣泛用于動物運輸過程[1]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)鮮活水產(chǎn)品在運輸、批發(fā)等環(huán)節(jié)添加丁香酚類物質(zhì)能夠有效地改變其生理狀態(tài)，進入類休眠狀態(tài)，大大降低生理代謝強度，有效提高在運輸途中的成活率，從而增加經(jīng)濟效益[2-3]。然而，研究表明丁香酚類物質(zhì)具有肝臟毒性[4-5]；美國國家毒理學(xué)計劃認為丁香酚是可疑致癌物[6]；世界癌癥研究機構(gòu)也將丁香酚列為第3類致癌物[7]；李付貴等[8]證明了丁香酚是一種強胚胎毒性化合物；孔曉軍等[9]對丁香酚進行毒理學(xué)實驗表明丁香酚會導(dǎo)致人體代謝性酸中毒，還可以導(dǎo)致嬰幼兒患低血糖和肝功能衰竭。不同國家對丁香酚類物質(zhì)的限量標準并不一致，新西蘭曾規(guī)定食品中丁香酚的最高殘留限量為0.1 mg/kg[10]，而后在2016年撤銷[11]，日本規(guī)定丁香酚最高殘留限量為0.05 mg/kg[12]，美國和加拿大則禁止丁香酚作為食品添加劑或者麻醉劑使用[13-14]，其他5 種丁香酚類物質(zhì)的限量值還未有相應(yīng)的規(guī)定。我國對丁香酚類的使用及限量值尚無明確規(guī)定。

目前，丁香酚的檢測方法主要有紫外分光光度法、薄層色譜法、毛細管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。向英等[15]采用分光光度法測定丁香油中丁香酚的含量，不僅溶劑消耗大且靈敏度較低；Pathak等[16]采用薄層色譜法建立了丁香中丁香酚的含量測定，但該法易受干擾導(dǎo)致定性定量不準確，且溶劑揮發(fā)對人體危害也較大；黃先敏等[17]建立了山茱萸中丁香酚的毛細管電泳法測定，該法靈敏度高，但重現(xiàn)性較差，無法準確定量；色譜法[18-21]具有高分離性、高選擇性以及高靈敏度成為水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)測定的主流檢測方法，但前處理仍相對復(fù)雜，步驟多，耗時長，效率低，且容易存在干擾，已無法滿足大批量樣品快速檢測的要求。近年來，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有前處理簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好、定性定量更準確等特點而被廣泛用于痕量分析[22-23]，已有研究者[24-28]將氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法成功應(yīng)用與水產(chǎn)品中6 種丁香酚類物質(zhì)的測定，以及倪崢飛[29]和趙東豪[30]等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法建立了丁香酚類物質(zhì)的測定方法，但目前報道的采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法針對的是丁香酚單一化合物或者幾種化合物，同時測定6 種（3 組同分異構(gòu)體）丁香酚類物質(zhì)（丁香酚與異丁香酚、甲基丁香酚與甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯與乙?；惗∠惴樱┑姆椒r見報道。因此，本研究采用UPLC-MS/MS建立同時測定水產(chǎn)品中6 種丁香酚類物質(zhì)的方法，并對市場上實際水產(chǎn)樣品中丁香酚類物質(zhì)殘留進行污染調(diào)查，以期為水產(chǎn)品中多種丁香酚類物質(zhì)殘留檢測提供技術(shù)支持，也為水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)的進一步研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丁香酚（CAS號97-53-0，純度98.95%）、異丁香酚（CAS號97-54-1，純度98.06%）、甲基丁香酚（CAS號93-15-2，純度98.06%）、乙酸丁香酚酯（CAS號93-28-7，純度99.4%）、甲基異丁香酚（CAS號93-16-3，純度99.1%）、乙?；惗∠惴樱–AS號93-29-8，純度98.2%） 美國Stanford公司；甲酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L C-3 0 A D U P L C儀、H L B固相萃取柱（3 mL/60 mg）、Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2 μm） 日本Shimadzu公司；5500三重四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX公司；Aanti J-E高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；Milli-Q超純水純化系統(tǒng) 美國Millipore公司；DS-8510 DTH超聲波振蕩器 上海分析超聲儀器有限公司；MS 3 basic旋渦混均器 德國IKA公司；C18固相萃取柱（3 mL/60 mg）、PEP固相萃取柱（3 mL/60 mg） 美國Agela公司；BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）、UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、BEH C8色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源：正負離子切換模式；多反應(yīng)監(jiān)測；離子化電壓：正離子掃描模式為5 500 V，負離子模式為－4 500 V；霧化氣60 psi；輔助氣55 psi；氣簾氣壓力30 psi；霧化溫度550 ℃；定性離子對、定量離子對及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2 μm）；柱溫40 ℃；進樣量2.0 μL；流速0.3 mL/min；流動相：水（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序：0～1.00 min，90% A、10% B；1.0～2.0 min，90%～45% A、10%～55% B；2.0～2.00 min，45% A、55% B；5.0～9.0 min，45%～5% A、55%～95% B；9.0～11.0 min，5% A、95% B；11.00～11.01 min，5%～90% A、95%～10% B；11.01～13.0 min，90% A、10% B。

1.3.3 標準溶液及標準曲線的配制

分別準確稱取適量6 種丁香酚類物質(zhì)標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容至刻度，充分混勻得到標準儲備液約1.0 mg/mL，于－18 ℃冰箱中避光保存。分別移取適量標準儲備液以乙腈稀釋成質(zhì)量濃度均為100 ng/mL的混合標準中間液，再分別移取適量混標中間液以體積分數(shù)10%乙腈溶液稀釋成1.00、2.00、5.00、20.0、50.0、100、500 ng/mL的混合標準系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 樣品前處理

先將魚、蝦、蟹等水產(chǎn)品洗凈，取可食肌肉部分樣品于組織勻漿機攪碎混勻，放入－18 ℃冰箱保存，備用。稱取勻漿后的待測樣品2.0 g于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入2 g無水硫酸鈉，渦旋混勻后加入5 mL乙腈，振蕩提取10 min后，于4 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至10 mL試管中，殘渣再加入5 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并2 次提取液，過HLB小柱凈化（使用前用3.0 mL乙腈活化），收集流出液于10 mL刻度試管中，再加入2 mL乙腈洗脫，并收集流出液，加入100 μL二甲亞砜后于50 ℃水浴下氮吹至近干，加入10%乙腈溶液溶解定容至1.0 mL，渦旋混勻后過0.22 μm PTFE濾膜，UPLC-MS/MS分析測試。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007軟件進行平均值、回收率及相對標準偏差計算，采用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 丁香酚類物質(zhì)產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖Fig. 1 Product ion scanning mass spectra of eugenols

分別取適量儲備液以50%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度約為200 ng/mL的單標使用液，采用針泵連續(xù)進樣模式進樣分析（針泵速率為10 μL/min）。根據(jù)目標物的性質(zhì)，丁香酚與異丁香酚含有酚羥基，較易失去一個質(zhì)子得到母離子m/z163 [M－H]－，其余4 種化合物采用正離子模式，分別得到一個質(zhì)子形成母離子[M－H]+，分別繼續(xù)進行產(chǎn)物離子掃描，并采用信號疊加模式，分別得到6 種化合物的主要碎片離子（圖1），并優(yōu)化各化合物相關(guān)檢測參數(shù)，選擇最優(yōu)定量定性離子對（表1）。從圖1可以看出，除丁香酚（m/z121.0）和異丁香酚（m/z119.0）的1 個碎片離子不同外，其余2 對同分異構(gòu)體的母離子和碎片離子均相同，一部分可能的質(zhì)譜解析見文獻[31]，因此無法單靠質(zhì)譜提取分離目標物進行定性，需要通過色譜條件將3 對同分異構(gòu)體完全分離，才能準確進行定性定量分析。

2.1.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 色譜柱的選擇

圖2 丁香酚類物質(zhì)的多反應(yīng)監(jiān)測模式色譜圖Fig. 2 Multiple response monitor chromatograms of 6 eugenols

文獻[27,32]報道測定多種丁香酚類物質(zhì)采用C18色譜柱，本研究選擇較常見的BEH C18、BEH C8、HSS T3、Shim-pack GIST C18色譜柱，以甲醇-水作為流動相進行梯度洗脫優(yōu)化實驗。結(jié)果表明Shim-pack GIST C18色譜柱效果最好，在7.5 min之前能將3 對丁香酚同分異構(gòu)體達到基線分離，且峰形較好（圖2），因此選擇Shim-pack GIST C18色譜柱作為分析柱。

2.1.2.2 流動相的選擇

先對甲醇-水和乙腈-水作為流動相的效果進行比較，結(jié)果表明，采用甲醇-水作為流動相時，6 種化合物的峰形及響應(yīng)均優(yōu)于乙腈-水作為流動相。此外，流動相的pH值以及離子強度的大小可能對目標物響應(yīng)有影響，于是對比了在水相中添加不同濃度的甲酸以及乙酸銨對結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，隨著乙酸銨濃度的增大，6 種丁香酚類物質(zhì)響應(yīng)均逐漸降低，說明流動相中加入乙酸銨會降低6 種丁香酚類物質(zhì)的響應(yīng)；而只要流動相中加入甲酸，丁香酚和異丁香酚則完全被抑制，且其余4 種化合物響應(yīng)沒有明顯變化，因此最終選擇甲醇-水作為流動相，而文獻[26,31]則認為采用甲醇-乙腈-0.01%甲酸作為流動相效果更佳。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

圖3 提取溶劑的選擇Fig. 3 Selection of extraction solvents

丁香酚類物質(zhì)屬于極性或者弱極性化合物，微溶于水，文獻中報道的提取溶劑有甲醇[32]、乙腈[24]、正己烷[27]、丙酮[18]等。本實驗選取空白明蝦樣品進行加標回收實驗，對比甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷、丙酮作為6 種丁香酚類物質(zhì)提取溶劑的效果，后續(xù)實驗按1.3.4節(jié)步驟進行，平行實驗3 次。如圖3所示，采用甲醇、乙腈提取時，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率均較好，分別為82.5%～95.1%、84.7%～94.7%，相對標準偏差分別為2.1%～5.2%、2.8%～4.1%；而其余3 種提取溶劑所得的回收率結(jié)果不理想；但甲醇作為提取溶劑時，溶液顏色較深；此外，在最后濃縮過程中乙腈的濃縮速度也較甲醇快，因此綜合考慮選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 提取溶劑體積的優(yōu)化

圖4 提取溶劑體積對丁香酚類物質(zhì)回收率的影響Fig. 4 Effect of extraction solution volume on recovery of eugenols

為進一步確定提取溶劑的體積，選擇陰性明蝦樣品進行加標回收實驗（加標水平為1.0 mg/kg），以20 mL乙腈分4 次進行提取，每次以5 mL乙腈提取，分別收集每次的提取溶液按1.3.4節(jié)方法進行后續(xù)實驗，平行實驗3 次。如圖4所示，一次5 mL乙腈提取時，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率僅為52.1%～72.1%；2 次5 mL乙腈提取時，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率在84.1%～94.5%之間，相對標準偏差在2.1%～4.5%之間；而超過2 次時，結(jié)果與2 次5 mL乙腈提取時并無明顯變化，綜合考慮后續(xù)濃縮效率以及節(jié)約溶劑方面，最終選擇采用2 次5 mL乙腈提取。

2.2.3 凈化條件的優(yōu)化

2.2.3.1 固相萃取柱的選擇

由于水產(chǎn)品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量脂溶性雜質(zhì)，若直接進樣會產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)以及對儀器造成一定程度的污染，因此需對提取后的溶液進行凈化處理。根據(jù)6 種丁香酚類物質(zhì)的性質(zhì)，比較HLB小柱（可吸附極性和非極性雜質(zhì)）、C18小柱（可吸附脂類等非極性雜質(zhì)）、PEP小柱（可吸附極性和非極性雜質(zhì)）的凈化效果，以陰性明蝦進行加標回收實驗（加標水平為20 μg/kg），上樣后再以5 mL乙腈洗脫固相萃取柱，其余步驟按1.3.4節(jié)進行，平行實驗3 次。結(jié)果表明，采用HLB柱凈化時，6 種丁香酚類物質(zhì)平均回收率均較好，在88.5%～95.1%之間，相對標準偏差在2.2%～5.1%之間，且基線噪音低；而采用C18柱凈化時，乙酸丁香酚酯平均回收率較低（67.5%）；采用PEP固相萃取柱凈化時，異丁香酚平均回收率較低（50.2%），因此，選擇HLB柱作為凈化小柱。

2.2.3.2 洗脫劑體積的優(yōu)化

圖5 洗脫劑體積對丁香酚類物質(zhì)回收率的影響Fig. 5 Effect of elution solvent volume on recovery of eugenols

由于采用乙腈作為提取溶劑，若經(jīng)固相萃取柱凈化后，溶液體積過大會影響濃縮效率，有必要進一步對洗脫劑體積進行優(yōu)化。以空白明蝦為基質(zhì)，進行加標回收實驗（加標水平為500 μg/kg），上樣后以5 mL乙腈分5 次洗脫固相萃取柱，每次1 mL，并分別收集每次的洗脫溶液按1.3.4節(jié)進行后續(xù)實驗，平行實驗3 次。如圖5所示，當洗脫溶劑達到2 mL時，6 種丁香酚類物質(zhì)基本洗脫下來，平均回收率在84.5%～97.2%之間；而當洗脫溶劑繼續(xù)增加時，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率與2 mL洗脫時并無明顯差異，因此，選擇洗脫體積為2 mL。

2.2.4 濃縮條件的優(yōu)化

2.2.4.1 濃縮溫度

丁香酚類物質(zhì)沸點均高于180 ℃，但文獻[27]認為在氮吹濃縮時，水浴溫度高于45 ℃時，丁香酚類物質(zhì)易揮發(fā)或者分解導(dǎo)致回收率降低。因此本實驗考察在乙腈溶劑中加入6 種丁香酚類物質(zhì)（質(zhì)量濃度均為20 ng/mL），分別在溫度30、40、50、60 ℃進行濃縮至近干（剩余約0.2 mL），加入10%乙腈溶液定容至1.0 mL，并渦旋混勻，過濾膜后上機測試。結(jié)果表明，濃縮溫度為30～60 ℃，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率均在97.5%以上，并不存在回收率降低現(xiàn)象。

2.2.4.2 濃縮至干的影響

在濃縮過程中濃縮至干時，一些化合物有可能會隨溶劑揮發(fā)被帶走一部分，或者被氧化成其他化合物。因此，在乙腈溶劑中加入6 種丁香酚類物質(zhì)，考察濃縮至干與濃縮至近干（剩余約0.2 mL）對6 種化合物回收率的影響。結(jié)果顯示當濃縮至近干時，6 種丁香酚類物質(zhì)的回收率均在97.2%以上；而濃縮至干時，6 種丁香酚類物質(zhì)回收率均有所下降，在69.8%～87.1%之間（表2）。因此，應(yīng)注意在濃縮過程中不能濃縮至干，但在實際操作過程較難控制，于是采用在濃縮前加入100 μL高沸點的二甲亞砜，從而有效避免濃縮至干對結(jié)果的影響。

表2 濃縮程度對丁香酚類物質(zhì)回收率的影響Table 2 Effect of concentration level on recovery of eugenols

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性范圍與定量限

以6 種丁香酚類物質(zhì)的峰面積作為Y軸，質(zhì)量濃度（ng/mL）作為X軸計算線性回歸方程。由表3可以看出，在1.0～500 ng/mL范圍內(nèi)，6 種丁香酚類物質(zhì)線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)（R）在0.99以上，檢出限為0.1～0.3 μg/kg之間，定量限在0.3～1.0 μg/kg之間，滿足分析需求。

表3 丁香酚類物質(zhì)的線性關(guān)系和定量限Table 3 Calibration curves and limits of quanti fication (LOQs) of eugenols

2.3.2 準確度與精密度

表4 丁香酚類物質(zhì)的準確度、精密度和回收率Table 4 Accuracies, precisions, and recoveries of eugenols

分別以陰性明蝦、鱸魚、蟹為基質(zhì)，進行添加水平為2.00、5.00、10.0 μg/kg的加標回收實驗，每種加標水平平行實驗6 次。如表4所示，6 種丁香酚類物質(zhì)在3 種基質(zhì)中平均回收率在83.9%～105.4%之間，相對標準偏差在1.8%～6.9%之間，表明該方法檢測水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)殘留量準確可靠，精密度好，符合痕量分析要求。2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

分別以陰性明蝦、鱸魚、蟹為基質(zhì)，得到3 種基質(zhì)的空白基質(zhì)溶液，分別加入混標中間液配制成質(zhì)量濃度均為4.00、10.0、20.0 ng/mL的基質(zhì)標準溶液，并與同質(zhì)量濃度的標準溶液（10%乙腈配制）一起上機測試，標準溶液所得的各物質(zhì)峰面積為A1，基質(zhì)標準溶液所得各物質(zhì)的峰面積為A2，基質(zhì)效應(yīng)/%=A2/A1×100，結(jié)果見表4，3 種基質(zhì)對丁香酚和異丁香酚均表現(xiàn)出基質(zhì)增強（基質(zhì)效應(yīng)＞100%），而對其余4 種化合物則表現(xiàn)出一定程度的基質(zhì)抑制（基質(zhì)效應(yīng)＜100%），6 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)在89.8%～111.6%之間，符合分析要求。

2.4 實際樣品測定結(jié)果

利用本方法調(diào)查了市場上明蝦、鱸魚、蟹、羅非魚、黃瓜魚、麗魚等共計68 份樣品中丁香酚類物質(zhì)的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15 份樣品檢出丁香酚，含量在1.2～4 574 μg/kg之間，檢出率為22.1%，其余5 種化合物均未檢出；按日本相關(guān)標準的限量值50 μg/kg計，有9 批次不合格，不合格率為13.2%；若按美國和加拿大相關(guān)標準計，則不合格率達到22.1%，可見我國水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)殘留問題的嚴重性。

3 結(jié) 論

本實驗采用UPLC-MS/MS法，結(jié)合固相萃取技術(shù)，建立水產(chǎn)品中6 種丁香酚類物質(zhì)的同時快速測定方法，外標法定量，并對相關(guān)條件進行優(yōu)化。該方法簡便、檢出限低、重復(fù)性好、準確度高，且將所建立的方法應(yīng)用于實際樣品的測定，發(fā)現(xiàn)丁香酚檢出率較高，國家相關(guān)部門應(yīng)對水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)殘留進行風(fēng)險監(jiān)測，對水產(chǎn)品中丁香酚類物質(zhì)殘留進行污染調(diào)查研究，并進一步對丁香酚的代謝周期以及毒理學(xué)進行研究。