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        固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測麗江瑪咖中41種有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留

        2020-08-26 03:50:12黃紹軍朱艷琴孫曉東邱麗莎崔秀明
        食品科學(xué) 2020年16期
        關(guān)鍵詞:有機氯菊酯乙腈

        黃紹軍,杜 萍,楊 俊,*,孫 卉,朱艷琴,孫曉東,邱麗莎,崔秀明,楊 野

        (1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500;2.昆明理工大學(xué)分析測試研究中心(云南省分析測試中心),云南 昆明 650093)

        瑪咖(Lepidium meyeniiWalp)原產(chǎn)于海拔3 500~4 500 m的秘魯安第斯高山地區(qū),為十字花科(Cruciferae)獨行菜屬(Lepidium)草本植物的新鮮或干燥塊根[1]。研究表明,瑪咖是世界上發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)成分最豐富的藥食兩用植物之一[2-3]。瑪咖中不僅含有多種氨基酸、多種維生素、蛋白質(zhì)、多糖、還原糖、脂肪酸和不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分[1,4-5],還含有芥子油苷、異硫氰酸芐酯、瑪咖酰胺、瑪咖烯、生物堿、?;撬?、甾醇、黃酮、礦物質(zhì)元素等生物活性物質(zhì)[1,6-8],具有提高生育力和改善性功能、抗衰老、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和緩解女性更年期綜合癥、抗抑郁、抗疲勞和耐缺氧、提高記憶力和增強學(xué)習(xí)能力、增強免疫力、抗癌、抗炎癥、抗病毒、抗貧血、降糖、降血脂、抑制骨質(zhì)疏松、抗前列腺增生等功效[4-7,9-11]。因此,瑪咖素有“秘魯人參”[12]和“瑪咖醫(yī)生”[13]的美稱,具有重要藥用價值和經(jīng)濟價值。我國于2003年在云南麗江引種瑪咖并栽培成功,并相繼在四川、西藏、新疆、青海、貴州、吉林等地區(qū)引種成功[7,14],2011年瑪咖被列入我國食品新資源目錄并開始大面積種植[4]。云南麗江與瑪咖原產(chǎn)地秘魯同處于高緯度、高海拔地區(qū),氣候類似,晝夜溫差大,特別適合瑪咖生長,成為我國瑪咖主產(chǎn)區(qū),2015年瑪咖種植面積突破9 333 hm2[14]。研究表明,云南麗江瑪咖品質(zhì)接近或優(yōu)于秘魯瑪咖[2]?,斂楦吆絽^(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、農(nóng)民脫貧致富提供了一條新途徑。

        近年來,農(nóng)藥已在農(nóng)作物和中藥材種植中廣泛應(yīng)用,造成了未加工原材料中的農(nóng)藥殘留。因此,在農(nóng)副產(chǎn)品和中藥材投入使用之前,很有必要進行農(nóng)藥殘留量的檢測,以提高在國際市場上的競爭力。廣譜性殺蟲劑如有機氯和菊酯類農(nóng)藥曾在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用。有機氯農(nóng)藥雖然早已被各國明令禁止使用,但由于其具有毒性大、性質(zhì)穩(wěn)定和降解緩慢等特點[15],能長期殘留于土壤和農(nóng)副產(chǎn)品中;菊酯類農(nóng)藥具有速效、低毒等特點而至今都被廣泛使用[16],但其大量使用也會導(dǎo)致在土壤和農(nóng)副產(chǎn)品中的積聚并通過生物鏈轉(zhuǎn)移和富集到動物和人體內(nèi),引起人畜中毒,對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成很大危害。鑒于有機氯和菊酯類農(nóng)藥都具有較大的神經(jīng)毒性[17],我國制定的2015年版《中國藥典》和多個農(nóng)藥殘留量國家標(biāo)準(zhǔn)[18]對中藥材和農(nóng)副產(chǎn)品中有機氯和菊酯類農(nóng)藥的最高殘留量進行了嚴(yán)格限制。目前,國內(nèi)多依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[19-20]以及食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)[21]測定農(nóng)副產(chǎn)品中的有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留量,但這些標(biāo)準(zhǔn)中的方法存在前處理繁瑣耗時,溶劑使用量大,農(nóng)藥需分成多組使用雙柱測試,廣譜性農(nóng)藥無法一次性檢測等問題。因此,很有必要建立一種簡單、快速、經(jīng)濟的能同時檢測多種有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留量的方法。

        有機氯和菊酯類農(nóng)藥含有鹵素、 氧等電負(fù)性較大的元素以及具有高溫可氣化特點,通常用氣相色譜(gas chromatography,GC)進行分離后,用電子捕獲檢測器(electronic capture detector,ECD)[22-23]或質(zhì)譜(mass spectrometry,MS)[24-25]進行定性/定量檢測。其中GC-MS方法中一般使用全掃模式定性,采用選擇離子掃描(selective ion monitoring,SIM)方式或多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式定量,而MS的MRM模式特異性強、抗干擾能力強、靈敏度高,是目前最靈敏的MS模式,尤其適合于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留的檢測。目前關(guān)于瑪咖的研究主要集中在活性組分或功能性成分、營養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分等化學(xué)成分的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定、功效等方面[2],而對于瑪咖中農(nóng)藥殘留量卻鮮有報道?,斂С煞謴?fù)雜,首先要建立合適的樣品前處理方法,使瑪咖中微量的農(nóng)藥成分被充分提取出來,然后通過選擇適當(dāng)?shù)膬艋椒ūM量消 除基質(zhì)的干擾。固相萃取柱是從層析柱發(fā)展起來的一種用于萃取、分離、濃縮的樣品前處理裝置,高效、高選擇性的固定相可實現(xiàn)對干擾雜質(zhì)的選擇性吸附,基于固相萃取的樣品前處理方法具有溶劑用量少、快速、操作簡單、費用低、污染少、回收率良好等優(yōu)點而受到廣大研究者們的青睞[26]。本實驗擬采用超聲波輔助提取、固相萃取凈化技術(shù)對瑪咖樣品進行前處理,用含中等極性固定相的毛細(xì)管單柱GC分離殘留農(nóng)藥,以MS的全掃模式、MRM模式聯(lián)合外標(biāo)法分別對41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥進行定性和定量,旨在建立一種簡單、快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟、適合大批量瑪咖樣品中有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的快速篩查和定量檢測方法,應(yīng)用推廣性強。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        樣品:瑪咖干樣,采樣地點為云南麗江市玉龍縣。

        石墨化碳/氨基復(fù)合型小柱(500 mg/500 mg/6 mL)天津博納艾杰爾科技有限公司;0.45 μm有機相濾膜天津市津騰實驗設(shè)備有限公司;氦氣(純度≥99.999%)四川梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司;氬氣(純度≥99.999%)梅塞爾格里斯海姆(昆明)氣體產(chǎn)品有限公司;乙腈、甲苯、正己烷、丙酮(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;標(biāo)準(zhǔn)品:百菌清(101.4 μg/mL)、聯(lián)苯菊酯(99.0 μg/mL)、25 種有機氯農(nóng)藥混合溶液(100 μg/mL)、23 種農(nóng)藥混合溶液(100 μg/mL)美國A ChemTek. Inc.公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        456-GC/SCION TQ GC-MS聯(lián)用儀(配置電子電離源和質(zhì)量分析器) 德國布魯克公司;TDL-40B離心機上海安亭科學(xué)儀器廠;SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 樣品前處理

        瑪咖干果經(jīng)粉碎后稱取5 g,加入去離子水20 mL,振蕩使混勻,加入乙腈25 mL,超聲提取30 min,過濾,濾液收集于預(yù)先放入8 g NaCl的50 mL塑料離心管中,超聲20 min促進NaCl溶解于水層并分層,靜置約10 min使之徹底分層,取上層(乙腈層)10 mL,旋蒸至近干,用A液體(乙腈-甲苯(3∶1,V/V))2 mL溶解,采用石墨化碳/氨基復(fù)合型小柱凈化,用6 mL A液體轉(zhuǎn)出樣液,再用2 次6 mL A液體洗脫,經(jīng)凈化后收集的液體約20 mL,濃縮至近干,用2 mL正己烷溶解,再經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾后上機測試。

        1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制及校準(zhǔn)曲線制作

        分別移取0.20 mL百菌清(101.4 μg/mL)、0.20 mL聯(lián)苯菊酯(99.0 μg/mL)、0.20 mL 25 種有機氯農(nóng)藥混合溶液(100 μg/mL)、0.20 mL 23 種農(nóng)藥混合溶液(100 μg/mL)于同一個2 mL容量瓶中,用丙酮定容至刻度,得到農(nóng)藥質(zhì)量濃度10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn) 溶液(α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的質(zhì)量濃度均為20 μg/mL);再采用逐級稀釋法,配制得到農(nóng)藥質(zhì)量濃度分別為4、2、0.5、0.1、0.05、0.02 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的質(zhì)量濃度為其他農(nóng)藥質(zhì)量濃度的2 倍),上機分析制作校準(zhǔn)曲線。

        1.3.3 儀器條件

        1.3.3.1 GC條件

        色譜柱Agilent J&W DB-17MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣He;載氣流速1.2 mL/min;進樣口溫度290 ℃;分流方式:不分流;柱溫(程序升溫):初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃/min升溫至130 ℃,保持1 min,然后以5 ℃/min升溫至250 ℃,保持1 min,再以8 ℃/min升溫至280 ℃,保持2 min,最后以20 ℃/min升溫至300 ℃,保持7 min;進樣量1 μL。

        1.3.3.2 MS條件

        電離方式:電子電離源;電離電壓:70 eV;燈絲電流:80 μA;碰撞氣(Ar)壓力:2.0 mTorr(相當(dāng)于0.27 Pa);離子源溫度:230 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲時間:15 min;定性:全掃描方式,質(zhì)量掃描范圍35~550 u;定量:MRM模式。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GC條件的優(yōu)化

        比較弱極性的HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.250 mm,0.2 5 μ m)和中等極性的D B-1 7 M S毛細(xì)管柱(30 m×0.250 mm,0.25 μm)對41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥的分離效果。結(jié)果表明,HP-5MS毛細(xì)管柱不能較好分離β-六六六與γ-六六六、乙烯菌核利與七氯、4,4’-滴滴滴與2,4’-滴滴涕、2,4’-滴滴伊與α-硫丹;DB-17MS毛細(xì)管柱能很好地分離前3 組,但在優(yōu)化條件下仍然不能有效地分離2,4’-滴滴伊與α-硫丹,不過2,4’-滴滴伊與α-硫丹的定性/定量離子都不相同,不影響離子的積分,因此選擇DB-17MS毛細(xì)管柱作為分離柱。

        2.2 MS條件的優(yōu)化

        圖1 41 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)的SIM總離子流(aa)和MRM(b)色譜圖Fig. 1 Total ion current (a) and multiple reaction monitoring (b)chromatograms of mixed solution 41 pesticide standards (at 10 μg/mL)

        表1 41 種農(nóng)藥的MS MS-MRM模式下檢測參數(shù)Table 1 MRM parameters for MS MS detection of the 41 pesticides

        采用SIM和MRM兩種模式對41 種農(nóng)藥進行檢測分析。通過比較發(fā)現(xiàn),采用MRM模式比采用SIM模式有更高的信噪比和靈敏度,并且MRM模式一方面能克服SIM模式中不同農(nóng)藥存在相同掃描離子而對定性/定量帶來的困擾,另一方面能有效提高多種農(nóng)藥同時檢測對分辨率的要求[27]。此外,MRM模式選擇性更好,抗干擾能力更強,更適合于復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留的檢測。因此,在MRM模式下,進行MS參數(shù)的優(yōu)化。從全掃描MS圖(圖1a)上選擇質(zhì)荷比(m/z)大及豐度高的離子定為母離子,設(shè)定不同的碰撞能量對母離子進行轟擊得到子離子MS/MS掃描圖,從中選擇響應(yīng)值最高的2~3 個碎片離子作為子離子,改變碰撞電壓優(yōu)化各組母離子和子離子[28]。最后選擇響應(yīng)最好的組合,確定了41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥MRM的最佳MS條件,MRM-MS圖見圖1b,詳細(xì)結(jié)果見表1。

        2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

        乙腈對大多數(shù)農(nóng)藥均有較好的溶解度且脂肪在乙腈中的溶解度較小[29],且乙腈具有極性大、穿透力強、提取率高等優(yōu)點[30],本實驗選擇乙腈作為提取溶劑;而通常的提取方式有機械振蕩、索氏提取、超聲波輔助提取等[31]。考慮到實驗室可行條件及 方法適合推廣的要求,本研究采用乙腈溶解超聲波輔助提取的方式?,斂Ц煞壑邢燃尤胍欢克菫榱耸宫斂С浞值亟?,一方面有利于乙腈更好地滲透到瑪咖顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)中去,另一方面水可以除去瑪咖中大部分多糖、還原糖、蛋白等水溶性成分[32]。提取液經(jīng)過濾后加入氯化鈉超聲助溶使水相形成氯化鈉飽和溶液,有利于水相與有機相的分離。

        用于有機氯和菊酯類農(nóng)藥多殘留樣品處理的最常用的凈化柱主要包括氨基固相萃取柱、弗羅里硅土柱、C18柱、石墨化碳黑柱、石墨化碳/氨基復(fù)合柱等[15,29,33]。一般認(rèn)為復(fù)合凈化劑比單一凈化劑效果好,而由于石墨化碳/氨基復(fù)合柱處理樣品較為干凈、干擾峰少,有較好的回收率,在農(nóng)殘樣品前處理方面的應(yīng)用日益廣泛[34]。因此,本研究選擇石墨化碳/氨基復(fù)合柱凈化處理 瑪咖樣品提取液,見圖2,而洗脫液選用乙腈-甲苯(3∶1,V/V)混合溶劑。石墨化碳經(jīng)過特殊表面處理,對平面結(jié)構(gòu)的化合物如色素有很強的吸附能力,可以去除色素的干擾[35],氨基鍵合硅膠則可以除去金屬離子、極性有機酸、酚類和某些糖類雜質(zhì)[15]。在保證良好回收率的前提下,本研究中的樣品前處理方法相對于目前大多數(shù)常見的樣品前處理方法具有更簡便省時、節(jié)省有機溶劑的優(yōu)點,見表2。

        圖2 石墨化碳/氨基復(fù)合柱凈化示意圖Fig. 2 Schematic of the Purification with graphite carbon/amino composite column

        表2 不同檢測方法和樣品前處理方法的特征參數(shù)比較Table 2 Comparison of characteristic parameters between different analytical methods with different sample pretreatments

        2.4 線性范圍和檢出限

        配制0.02、0.05、0.1、0.5、2、4、10 μg/mL 7 個質(zhì)量濃度(其中α-六六六、五氯硝基苯、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的各級質(zhì)量濃度皆為相應(yīng)質(zhì)量濃度的2 倍)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機測試,以農(nóng)藥定量離子的峰面積y為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性擬合,得到線性回歸方程,以3 倍信噪比(RSN)計算檢出限,結(jié)果見表3。41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥在0.02~10 μg/mL或0.04~20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99,檢出限為0.01~2.38 μg/kg,此值比采用ECD的GC法以及其他GC-MS聯(lián)用法檢測獲得的檢出限整體低1~3 個數(shù)量級(表2)。

        表3 41 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍、和檢出限Table 3 Standard curve equations, linear ranges, R2 and LODs for the 41 pesticides

        續(xù)表3

        2.5 方法的精密度和回收率

        在空白基質(zhì)中分別添加0.018、0.074、0.36 mg/kg三個水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液做回收率實驗,每個添加水平重復(fù)測定6 次。方法的精密度用6 次平行測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)表示。結(jié)果表明,41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為90.2%~108.8%,RSD為2.1%~10.9%,見表4。

        表4 41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥在空白基質(zhì)中的平均回收率及RSD( =6)Table 4 Average recoveries and precision of the 41 organochlorine and pyrethroid pesticides spiked into blank matrices (n = 6)

        續(xù)表4

        2.6 實際樣品檢測結(jié)果

        表5 瑪咖樣品信息Table 5 Levels of pesticide residues in real samples determined by the GGCC--MMSS/MS metthhoodd

        為驗證麗江瑪咖食用的安全性,本實驗測定了該產(chǎn)地10 種瑪咖中41 種農(nóng)藥殘留情況。由表5可知,在這10 種樣品中,5 種樣品未檢出任何農(nóng)藥殘留,另外5 個樣品中檢出了少量腐霉利、多效唑、氯菊酯、醚菊酯,但都明顯低于GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對于根莖類和薯芋類蔬菜的最大殘留限量。況且,腐霉利、多效唑、氯菊酯、醚菊酯等屬于低毒、高效、在哺乳動物體內(nèi)蓄積性很小的農(nóng)藥。由此可見,麗江瑪咖除了品質(zhì)高以外,食用安全性也很高。

        3 結(jié) 論

        由于瑪咖樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,瑪咖樣品中的農(nóng)藥殘留分析通常不容易獲得準(zhǔn)確而穩(wěn)定的結(jié)果。本實驗通過對GC條件、MS條件、樣品前處理方法等進行選擇和優(yōu)化,建立了超聲波輔助提取-固相萃取凈化-GC-MS/MS法同時測定瑪咖中41 種有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的分析方法。方法簡捷、快速、凈化效果好、靈敏度高、選擇性好、回收率好、重復(fù)性好,可滿足復(fù)雜基質(zhì)瑪咖樣品中有機氯和菊酯類農(nóng)藥殘留的快速篩查定性和定量分析要求。

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