田建軍，張開屏，趙艷紅，李權(quán)威，馬牧然，馬俊杰，曹凱慧，靳 燁,*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院食品工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

乳酸菌是一種在自然界廣泛存在的無(wú)芽孢、厭氧或兼性厭氧、主要用于發(fā)酵各種生食和飼料、代謝產(chǎn)物主要以乳酸為主的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1-3]。由于其在發(fā)酵食品生產(chǎn)中的作用和作為益生菌的用途，是食品微生物學(xué)研究中最重要的細(xì)菌之一[4-5]。瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）是具有良好益生特性的一種乳酸菌，在發(fā)酵牛奶的過程中可產(chǎn)生抗高血壓的肽[6]，已被廣泛用于發(fā)酵和功能性食品當(dāng)中[7-10]。

傳統(tǒng)風(fēng)干肉是以牛、羊、馬等反芻動(dòng)物新鮮肉為主要原料，在適宜溫度和通風(fēng)良好的條件下，將牛羊肉割成小條，掛在陰涼處，自然晾曬、風(fēng)干，去除肉中部分水分而形成的風(fēng)味獨(dú)特的肉制品，它屬于自然條件下，依靠?jī)?nèi)源酶和有益微生物的作用，發(fā)生一系列生化變化而制成的一類發(fā)酵肉制品[11]。發(fā)酵肉制品中含有豐富的微生物資源，且具有高度的微生物群落多樣性[12]。乳酸菌是最早從發(fā)酵肉制品中分離出來(lái)的微生物，是傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中重要的優(yōu)勢(shì)菌群，與產(chǎn)品品質(zhì)密切相關(guān)[13-14]。近幾年也有一些從發(fā)酵肉制品中篩選肉用乳酸菌發(fā)酵劑的相關(guān)報(bào)道[15-17]。脂肪酶能夠使發(fā)酵肉制品產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味。Fernández等[18]發(fā)現(xiàn)將脂肪酶添加到中式香腸中能夠有效加速香腸中脂肪降解，促進(jìn)香腸中脂質(zhì)來(lái)源的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成、減少成熟時(shí)間。Zalacain等[19]在發(fā)酵香腸中添加外源脂酶，發(fā)現(xiàn)脂 酶可促進(jìn)飽和脂肪酸釋放，改變游離脂肪酸組成且不飽和脂肪酸含量顯著增加。Horchani等[20]將1 株產(chǎn)脂肪酶的葡萄球菌用作香腸發(fā)酵劑以此來(lái)改善風(fēng)味品質(zhì)。Lorenzo等[21]把產(chǎn)脂肪酶的4 種不同商業(yè)發(fā)酵劑添加到發(fā)酵香腸中，對(duì)其游離脂肪酸含量和種類進(jìn)行分，發(fā)現(xiàn)加工過程中脂肪酸有顯著的逐漸釋放的現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)脂肪酶微生物菌株不僅僅可改善風(fēng)味成分的變化，對(duì)其肉中油脂的特性也產(chǎn)生了一定的影響。

全基因組測(cè)序技術(shù)可以將細(xì)菌DNA（完整基因組序列）全部檢測(cè)出來(lái)，便于揭示生物體的完整DNA組成，通過序列分析及其功能注釋，能夠更好地理解物種內(nèi)部和物種之間的變異。嗜血流感桿菌（Haemophilus influenzae）是世界上第1個(gè)測(cè)序完成全基因組序列的細(xì)菌[22]。Callanan等[23]完成了第1株L. helveticus DPC 4571的全基因組測(cè)序。Schmid等[24]對(duì)3 株L. helveticus進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析。盡管完整的基因組序列在準(zhǔn)確描述核心基因組、鑒定特異基因以及作為功能基因組學(xué)研究方面具有特殊的價(jià)值，但它們?cè)诠矓?shù)據(jù)庫(kù)中的代表性仍然很低。NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse#!/eukaryotes/）數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，截止2019年9月，乳桿菌屬（Lactobacillus）全基因組測(cè)序菌株為2 531 株，其中L. helveticus測(cè)序菌株僅有57 株，含有質(zhì)粒的L. helveticus有14 株。到目前為止，就L. helveticus而言，國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在其發(fā)酵產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對(duì)機(jī)體健康的促進(jìn)作用以及對(duì)腸道菌群的影響[25-26]，有關(guān)L. helveticus全基因組測(cè)序分析為主題的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)及研究報(bào)道較少。

本課題組從自然風(fēng)干羊肉中篩選到1 株L. helveticus TR13，前期研究表明，該菌株產(chǎn)脂肪酶能力較強(qiáng)且發(fā)酵特性良好，接種量2%、36 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h，酶活性為10.89 U/mL，所產(chǎn)脂肪酶對(duì)中短鏈及長(zhǎng)鏈底物均有降解作用，且對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯（C16）降解效果較好。為深入研究TR13的代謝機(jī)制，采用PacBio Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)細(xì)菌TR13進(jìn)行全基因組測(cè)序分析和GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)基因組基本功能注釋，以期為深入了解TR13在羊肉發(fā)酵香腸生成過程中代謝機(jī)理的研究提供生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L. helveticus TR13，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院肉品科學(xué)技術(shù)團(tuán)隊(duì)前期從自然風(fēng)干肉制品中分離、篩選獲得。

DNA抽提試劑盒（細(xì)菌）Wizard?Genomic DNA Purification Kit 美國(guó)Promega公司；DNA純化試劑盒DNA Clean Beads 中國(guó)諾唯贊公司；AP151-03 TransStart TopTaq DNA Polymerase 中國(guó)TransGene公司；二代建庫(kù)試劑盒NEXTflex? Rapid DNA-Seq Kit美國(guó)Biooscientific公司；三代建庫(kù)試劑盒SMRTbell Sample and Template Preparation Reagent Kits 美國(guó)Pacbio公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MISEQ測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司；Pacbio RSII測(cè)序儀 美國(guó)Pacific Biosciences公司；GeneAmp?9700聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司；5424R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；TBS-380熒光儀 中國(guó)Sunnyvale公司；Covaris M220超聲 波破碎儀 中國(guó)Gene Company Limited。

1.3 方法

1.3.1L. helveticusTR13基因組DNA的提取

用M R S固體培養(yǎng)基（含1 5%瓊脂粉）活化L. helveticusTR13，挑取單菌落接種于10 mL滅菌MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%接種量接種于500 mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，24 h后8 000 r/min離心8 min收集菌體，根據(jù)Bacterial Genomic DNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書，提取菌體基因組，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組質(zhì)量，保證進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DNA質(zhì)量足夠高。純化的基因組DNA采用TBS-380熒光儀進(jìn)行定量。高質(zhì)量的DNA（OD260nm/OD280nm=1.8～2.0，DNA總量≥15 μg，質(zhì)量濃度≥50 ng/μL）用于后面的建庫(kù)測(cè)序。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建

基因組測(cè)序使用PacBio RS II單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（SMRT）和Illumina測(cè)序平臺(tái)組合，Illumina的數(shù)據(jù)被用來(lái)評(píng)估基因組雜合度、基因組重復(fù)度、基因組大小、是否存在質(zhì)粒及污染，同時(shí)保證更完整更精確的組裝。

Illumina文庫(kù)構(gòu)建：取至少1 μg基因組DNA，利用超聲波破碎儀進(jìn)行基因組DNA片段化，將DNA樣本剪切成小于400 bp的片段。使用NEXT flex?Rapid DNA-Seq試劑盒進(jìn)行文庫(kù)制備。具體步驟如下：連接A&B接頭；篩選去除接頭自連片段；瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，保留一端是A接頭、一端是B接頭的片段；氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段；橋式PCR擴(kuò)增。

單分子文庫(kù)建庫(kù)：取至少15 μg基因組DNA，利用超聲波破碎儀將基因組DNA處理成0～10 kb的片段，然后根據(jù)PacBio說(shuō)明書進(jìn)行片段純化，末端補(bǔ)平，兩端分別連接SMRT bell測(cè)序接頭。

1.3.3 Illumina預(yù)測(cè)

制備的文庫(kù)在Illumina HiSeq X Ten儀器上進(jìn)行雙端測(cè)序（2×150 bp），利用PacBio RS II和Illumina平臺(tái)生成的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。經(jīng)過一系列的質(zhì)量剪切之后得到的高質(zhì)量reads，稱之為clean data。利用canu及HGAP軟件進(jìn)行PacBio數(shù)據(jù)組裝，將reads組裝成contigs，然后人工判斷成環(huán)，得到完整的染色體和質(zhì)?；蚪M。最后利用Illumina測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行校正。本次測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.4 基因預(yù)測(cè)與注釋

利用Glimmer對(duì)基因組中的編碼序列（coding sequence，CDS）進(jìn)行預(yù)測(cè)，質(zhì)?；虿捎肎eneMarkS軟件預(yù)測(cè)，tRNAscan-SE進(jìn)行tRNA預(yù)測(cè)，Barrnap進(jìn)行rRNA預(yù)測(cè)。利用BLAST、Diamond、HMMER等序列比對(duì)工具，將獲得的基因提交COG[27]、GO[28]、KEGG[29-30]數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得功能注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組組裝與預(yù)測(cè)

采用PacBio和Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)細(xì)菌TR13進(jìn)行完成圖測(cè)序，測(cè)序及預(yù)測(cè)結(jié)果如表1所示。TR13染色體基因組為環(huán)狀分子，染色體總數(shù)為1，基因組序列總長(zhǎng)度為2 172 224 bp，GeneMarkS軟件預(yù)測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)質(zhì)?；颉Ｆ骄鵊C含量為36.82%。對(duì)細(xì)菌的編碼基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，獲得編碼基因（CDS數(shù)）2 356 個(gè)，編碼基因總長(zhǎng)度為1 883 532 bp，平均長(zhǎng)度為799.46 bp，基因密度（即基因組中每1 kb的堿基中所對(duì)應(yīng)的基因數(shù)目）為1.08 個(gè)/kb，占基因組百分比為86.71%，編碼基因GC含量為37.47%，基因間區(qū)長(zhǎng)度為288 692 bp，基因間區(qū)GC含量為32.57%，基因間區(qū)占基因百分比為13.29%。

表1 基因組統(tǒng)計(jì)及預(yù)測(cè)Table 1 Genome statistics and prediction

表2 編碼基因長(zhǎng)度分布Table 2 Length distribution of protein-coding genes

如表2所示，序列長(zhǎng)度分布在1 000 bp以上的基因數(shù)最多，數(shù)值為678，占全部編碼基因的28.78%。其中最小基因序列長(zhǎng)度為114 bp，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為37 aa；最大基因序列長(zhǎng)度為5 184 bp，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為1 727 aa。對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)平均序列長(zhǎng)度為265 aa。TR13基因組中含串聯(lián)重復(fù)序列36 個(gè)，重復(fù)序列占基因組的總長(zhǎng)度5 249 bp，占基因組百分比為0.28%。重復(fù)序列長(zhǎng)度最小為40 bp，最大為702 bp，36 個(gè)重復(fù)序列平均長(zhǎng)度為145.8 bp。

2 356 個(gè)編碼基因中，有1 891 個(gè)基因的起始密碼子為ATG，其中有1 286 個(gè)基因的終止密碼子為TAA、385 個(gè)為TAG、220 個(gè)為TGA；154 個(gè)基因的起始密碼子為GTG，其中有97 個(gè)基因的終止密碼子為TAA、42 個(gè)為TAG、15 個(gè)為TGA；311 個(gè)基因的起始密碼子為TTG，其中有175 個(gè)基因的終止密碼子為TAA、84 個(gè)為TAG、52 個(gè)為TGA。

TR13基因組中含有15 個(gè)rRNA操縱子基因，分別由5 個(gè)5S rRNA、5 個(gè)16S rRNA、5 個(gè)23S rRNA組成，其中3 個(gè)分布于負(fù)義鏈，5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA各1 個(gè)。TR13基因組中含有63 個(gè)tRNA基因，tRNA類型及其數(shù)量如表3所示。

表3 tRNA預(yù)測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of tRNA prediction

由表3可知，tRNA基因分別轉(zhuǎn)運(yùn)Arg、Gly、Leu、Ser等20 種不同的氨基酸，其中轉(zhuǎn)運(yùn)Arg、Gly、Leu、Ser的基因數(shù)最多，均為5 個(gè)，轉(zhuǎn) 運(yùn)Cys和Trp的基因最少僅有1 個(gè)。

2.2 基因組圈圖分析

基因組圈圖可以全面展示基因組的特征，如基因在正、反義鏈上的分布情況、基因的COG功能分類情況、GC含量、基因組島、同源基因等。通過CGView軟件繪制基因組圈圖，如圖1所示。

CGView圈圖最外面一圈為基因組大小的標(biāo)識(shí)，L. helveticusTR13基因組為1 套環(huán)狀無(wú)質(zhì)粒分子，基因總長(zhǎng)度為2 172 224 bp。第2圈和第5圈為正鏈、負(fù)鏈上的CDS，不同的顏色表示不同的COG功能分類，編碼基因的數(shù)量為2 356 個(gè)，其中COG注釋的基因?yàn)? 942 個(gè)，占編碼基因的82.43%，分別從新陳代謝、信息存儲(chǔ)與處理、細(xì)胞作用與信號(hào)傳遞和無(wú)明顯特征4 大分類，復(fù)制、重組和修復(fù)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生，碳水化合物運(yùn)輸和代謝等18 個(gè)類型上得到了注釋。第3圈和第4圈分別為正鏈負(fù)鏈上的CDS、tRNA、rRNA，TR13細(xì)菌基因組中含有15 個(gè)rRNA操縱子，分別由5 個(gè)5S rRNA、5 個(gè)16S rRNA、5 個(gè)23S rRNA組成，含有63 個(gè)tRNA基因，分別轉(zhuǎn)運(yùn)Arg、Gly、Leu、Ser等20 種不同的氨基酸。第6圈為GC含量，向外的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，峰值越高表示與平均GC含量差值越大，向內(nèi)的部分表示該區(qū)域GC含量低于全基因組平均GC含量，峰值越高表示與平均GC含量差值越大，基因組平均GC含量為36.82%。第7圈為GC-skew值，具體算法為（G－C）/（G+C），在生物意義上該值為正值時(shí)正鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄CDS，為負(fù)值時(shí)負(fù)鏈更傾向于轉(zhuǎn)錄CDS；最內(nèi)一圈為基因組大小標(biāo)識(shí)。基因組圈圖可以使研究者對(duì)菌株基因組的特征有更全面、更直觀的認(rèn)識(shí)。

圖1 基因組CGViieeww圈圖Fig. 1 Graphical representation of the genome of strain TR13

2.3 基因組的功能注釋

對(duì)預(yù)測(cè)得到的編碼基因進(jìn)行基礎(chǔ)的功能注釋，通過與COG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行功能注釋。TR13基因組中所有基因能夠注釋到GO信息的基因數(shù)目為1 972 個(gè)，能夠注釋到COG信息的基因數(shù)目為1 942 個(gè)，與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)能夠定位到具體Pathway的基因數(shù)目有1 143 個(gè)。

2.3.1 GO注 釋結(jié)果

根據(jù)對(duì)比結(jié)果，采用BLAST2go對(duì)比軟件，在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)TR13進(jìn)行GO注釋，如 圖2所示。TR13基因組中含細(xì)胞組成、生物過程、分子功能3大類型，在GO分類中共有1 792 個(gè)基因得到了功能注釋，占所有編碼基因（2 356 個(gè)）的百分比為76.06%。其中：細(xì)胞組成相關(guān)的基因數(shù)量878 個(gè)；生物過程相關(guān)的基因數(shù)量1 295 個(gè)；分子功能相關(guān)的基因數(shù)量1 478 個(gè)。1 792 個(gè)基因共注釋了40 種功能特性。

在生物過程這一層面分別得到代謝過程、細(xì)胞過程和單一生物過程等18 種功能注釋，其中和代謝有關(guān)基因數(shù)量最多為1 019 個(gè)，與細(xì)胞過程相關(guān)基因855 個(gè)，與單一生物過程相關(guān)基因609 個(gè)。

在細(xì)胞組成層面得到10 種功能注釋，其中細(xì)胞膜和細(xì)胞膜組分功能相關(guān)的基因最多。在分子功能層面分共得到12 種功能注釋，其中與催化活性有關(guān)的基因最多為1 083 個(gè)，其次為細(xì)胞附著相關(guān)基因861 個(gè)。功能基因中與抗氧化活性相關(guān)的基因有硫氧還原蛋白-二硫鍵還原酶、谷胱甘肽還原酶、NAD（FAD）依賴性脫氫酶等7 個(gè)基因，信息如表4所示。

2.3.2 COG注釋結(jié)果

采用Diamond軟件，參數(shù)設(shè)置為E-value 10－5，在數(shù)據(jù)庫(kù)eggNOG（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）中對(duì)TR13進(jìn)行COG注釋，如表5所示。

表5 COG注釋結(jié)果詳情Table 5 COG annotation results

TR13編碼基因在COG中的分類數(shù)量為4，COG的類型數(shù)量為18，編碼基因組中共有1 942 個(gè)基因在COG數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋，注釋基因占比為82.43%。

COG分類分別為新陳代謝、信息存儲(chǔ)與處理、細(xì)胞作用與信號(hào)傳遞和無(wú)明顯特征4 種類型，其中和新陳代謝有關(guān)的基因數(shù)為615 個(gè)，分為8 種類型。信息存儲(chǔ)與處理相關(guān)基因565 個(gè)，分為3 種類型。細(xì)胞作用與信號(hào)傳遞相關(guān)基因261 個(gè)，分為6 種類型，特征較弱的未知功能基因有512 個(gè)，歸為1 種類型。

表6 脂質(zhì)的運(yùn)輸與代謝相關(guān)基因Table 6 Lipid transport- and metabolism-related genes

新陳代謝COG聚類主要集中于碳水化合物的運(yùn)輸與代謝（相關(guān)基因146 個(gè)）、氨基酸的運(yùn)輸與代謝（相關(guān)基因143 個(gè)）、核苷酸的運(yùn)輸與代謝（相關(guān)基因90 個(gè)）、無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸與代謝（相關(guān)基因82 個(gè)）、脂質(zhì)的運(yùn)輸與代謝（相關(guān)基因44 個(gè)）。其中脂質(zhì)的運(yùn)輸與代謝如表6所示，gene0183、gene0428、gene2011分別為3 種不同酯酶的編碼基因，gene0893作為三酰甘油脂肪酶基因具有分解脂肪的作用。gene1050（mvaK2）、gene1052（mvaK1）、gene1915（dagK）為3 種不同的激酶基因，是一類可以從高能供體分子（如ATP）轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)到特定靶分子（底物） 的酶，此過程為磷酸化。gene0547（bcrC）為磷酸酶基因，與激酶的作用相反。gene0301（acpS）為holo-?；d體蛋白合成酶基因，gene0931（acpP）和gene2286（acpP）為?；d體蛋白質(zhì)基因，具有合成脂肪酸的作用。

2.3.3 KEGG注釋結(jié)果

KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）是基因組研究方面的公共數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)是系統(tǒng)分析基因功能，聯(lián)系基因組信息和功能信息的大型知識(shí)庫(kù)。采用Diamond對(duì)比軟件，參數(shù)設(shè)置為E-value 10－5，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)TR13進(jìn)行KEGG注釋。

L. helveticusTR13在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有1 144 個(gè)基因分別在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病6大功能35 個(gè)通路上得到功能注釋，結(jié)果如圖3所示。樣本中涉及的代謝通路總數(shù)以及參與每個(gè)代謝通路的基因組數(shù)目，分析發(fā)現(xiàn)在代謝途徑層面特別是碳水化合物代謝、核苷酸代謝和氨基酸代謝得到較多的基因功能注釋。其中634 個(gè)基因在代謝通路上得到注釋，占KEGG中全部注釋基因的55.42%，12 個(gè)代謝通路中，碳水化合物代謝相關(guān)的基因?yàn)?32 個(gè)，占代謝通路注釋基因（634 個(gè)）的20.82%，與脂質(zhì)代謝通路有關(guān)的基因有48 個(gè)。110 個(gè)基因在環(huán)境信息處理層面得到注釋，其中與膜運(yùn)輸有關(guān)的基因?yàn)?6 個(gè)，與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的基因24 個(gè)。

圖3 L. helveticus TR13的KEGG功能分類圖Fig. 3 KEGG functional classification of L. helveticus TR13

表7 脂質(zhì)代謝通路及其相關(guān)基因Table 7 Lipid metabolism pathways and related genes

如表7所示，TR13基因組中主要包含了脂肪酸合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸合成、初級(jí)膽汁酸生物合成、次生膽汁酸生物合成、酮體的合成與降解、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝共9 條通路信息。其中ko00061通路為脂肪酸合成通路，TR13基因組序列分析共獲得gene0428、gene0931、gene1746等15 個(gè)相關(guān)基因，ko00071為脂肪酸生物降解通路，在TR13基因組中包含gene1800和gene1984相關(guān)基因2 個(gè)。

表8 脂肪酸生物合成與降解通路信息Table 8 Information about fatty acid biosynthesis and degradation pathways

如表8所示，ko0061為脂肪酸合成代謝通路，包含gene0428、gene0931、gene1746等15 個(gè)基因，基因大小分布于243～1 380 bp之間，其中g(shù)ene0931和gene2286為酰基載體蛋白質(zhì)acpP基因，?；d體蛋白是脂肪酸合成中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，作為脂?；妮d體將脂?；鶑囊粋€(gè)酶反應(yīng)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)酶反應(yīng)。Ko00071為脂肪酸分解代謝通路，TR13基因組中包含了與其相關(guān)的基因有g(shù)ene1800乙酰CoA?；D(zhuǎn)移酶和乙醛脫氫酶/乙醇脫氫酶gene1984。ko01040為不飽和脂肪酸的生物合成代謝通路，TR13基因組中包含了gene1746和gene2284，均為?；d體蛋白還原酶基因（fabG）。

2.3.4 毒力基因預(yù)測(cè)結(jié)果

來(lái)源于微生物并對(duì)微生物自身侵染和引起特定宿主疾病具有促進(jìn)作用的物質(zhì)稱為毒力因子，主要包括細(xì)菌毒素、調(diào)節(jié)細(xì)菌黏附作用的細(xì)胞表面蛋白、對(duì)細(xì)菌本身具有保護(hù)作用的蛋白、細(xì)胞表面碳水化合物以及具有細(xì)菌致病性的水解酶等。毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB，是一個(gè)全面一體化的病原菌毒力因子信息管理網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)。利用軟件Diamond比對(duì)VFDB核心數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得毒力因子基因注釋概況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表9所示。L. helveticusTR13有對(duì)病毒相關(guān)基因的調(diào)控、防守毒力因子、進(jìn)攻毒力因子和非特異性毒性因子4 個(gè)類型的毒力基因，其中鐵吸收系統(tǒng)毒力因子基因數(shù)最多為24 個(gè)，其次為黏附毒力基因17 個(gè)，共預(yù)測(cè)到可能的毒力基因共75 個(gè)。

表9 毒力基因預(yù)測(cè)分類統(tǒng)計(jì)Table 9 Classi fication statistics of the predicted virulence genes

2.3.5 耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果

利用軟件Diamond，通過CARD數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，獲得每個(gè)基因組中包含的耐藥基因的信息。L. helveticusTR13共預(yù)測(cè)到150 個(gè)耐藥基因，耐藥基因預(yù)測(cè)分類統(tǒng)計(jì)如圖4所示。主要有抗生素耐藥基因、變異或突變體耐藥基因、糖肽耐藥基因、通過分子旁路作用產(chǎn)生抗生素耐藥性的基因、調(diào)節(jié)抗生素外排的基因、四環(huán)素抗性基因、氨基糖苷類耐藥基因、內(nèi)酰胺耐藥基因等。

圖4 耐藥基因預(yù)測(cè)分類統(tǒng)計(jì)Fig. 4 Classi fication statistics of the predicted drug resistance genes

3 結(jié) 論

L. helveticus TR13基因組為1 套環(huán)狀無(wú)質(zhì)粒分子，總長(zhǎng)度為2 172 224 bp。GC含量為36.82%，預(yù)測(cè)到2 536個(gè)編碼基因，其中編碼基因總長(zhǎng)度為1 883 532 bp，平均長(zhǎng)度為799.46 bp，平均密度為1.08 個(gè)/kb，對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)平均序列長(zhǎng)度為265 aa，占基因組百分比為86.71%，基因中包含15 個(gè)rRNA操縱子和63 個(gè)tRNA。

TR13基因組中能夠注釋到GO信息的基因數(shù)目為1 972 個(gè)，包含了40 種功能特性，占所有編碼基因（2 356 個(gè)）的76.1%。能夠注釋到COG信息的基因數(shù)目為1 942 個(gè)，注釋基因占比為82.43%。在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有1 144 個(gè)基因分別在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病6 大功能35 個(gè)通路上得到功能注釋。預(yù)測(cè)到可能的毒力基因75 個(gè)，耐藥基因150 個(gè)。

脂質(zhì)代謝的通路信息分析顯示，TR13基因組中主要包含了脂肪酸合成、脂肪酸降解、不飽和脂肪酸合成、初級(jí)膽汁酸生物合成、次生膽汁酸生物合成、酮體的合成與降解、甘油脂類代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝共9 條通路信息。TR13基因組中包含了ko00061脂肪酸合成通路相關(guān)的15 個(gè)基因，ko00071脂肪酸生物降解通路相關(guān)的gene1800和gene1984基因2 個(gè)。