邢 爽，方頌平，姚洪禮*，冉景春，張志祥，童夢茹，閔 慧，

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.亳州學(xué)院 配制酒工程技術(shù)研究中心，安徽 亳州 236800)

苔干，又稱貢菜，一年生草本植物，是安徽亳州渦陽縣義門鎮(zhèn)的名貴特產(chǎn)，其富含蛋白質(zhì)、果膠及多種氨基酸、維生素和人體必須的微量元素及碳水化合物，有“天然保健品，植物營養(yǎng)素”之美稱[1]。多糖是一類普遍存在于生物體中且含量較多的天然高分子聚合物，由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的[2]。研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖不僅是植物生物膜及其他細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的必不可少的組成成分，同時具有多重功效如抗腫瘤、降血糖、降血脂、抑菌、抗氧化性等，且毒副作用均小[3-4]。多糖的抗氧化性是其抗腫瘤、降血壓、降血脂的作用機制之一[5-6]，研究表明人類的多種疾病和氧化應(yīng)激、免疫力息息相關(guān)，如多糖的抗腫瘤功能是通過增強機體免疫功能間接發(fā)揮抗腫瘤作用，而幾乎人體系統(tǒng)的疾病與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，多糖則可以發(fā)揮抗氧化作用降低氧化應(yīng)激水平[7-8]，目前對植物多糖抗氧化性的研究主要關(guān)注在多糖清除自由基的能力上[9-10]。

本文主要研究苔干多糖的提取工藝、除蛋白純化工藝及其抗氧化性，采用單因素結(jié)合響應(yīng)面的實驗方法優(yōu)化苔干多糖的提取、除蛋白純化工藝，探討苔干多糖清除DPPH·自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的能力，以期為充分開發(fā)苔干的營養(yǎng)價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苔干產(chǎn)地為安徽亳州渦陽縣義門鎮(zhèn)苔干種植基地。

無水乙醇、三氯乙酸、苯酚、正丁醇、七水合硫酸亞鐵、Tris-HCl 緩沖液、水楊酸、濃硫酸、氯仿等均為分析純，購于國藥試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超微粉碎機，可見分光光度計，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，JK-500B超聲波儀，恒溫干燥箱等均為國產(chǎn)常規(guī)儀器設(shè)備。

1.3 實驗方法

1.3.1 苔干的預(yù)處理 選取質(zhì)量佳的苔干，80 ℃烘干，得到苔干的干物質(zhì)，粉碎，過80目篩網(wǎng)，得到苔干粉，密封保存至干燥器中。

1.3.2 苔干多糖提取工藝研究

1.3.2.1 料液比對苔干多糖提取率的影響 采用超聲波輔助水提醇沉法提取苔干中的多糖。準(zhǔn)確稱取苔干粉末5.0 g，加入到250 mL錐形瓶中，分別按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)加入80 ℃的蒸餾水，置于超聲波中輔助浸提，超聲功率設(shè)置為350 W，提取溫度為80 ℃，提取時間為120 min，提取次數(shù)為1次。提取完畢后過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，其中水浴溫度設(shè)置為60～70 ℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，最終使?jié)饪s液的體積為原濾液體積的20%。在強烈攪拌的狀態(tài)下向濃縮的提取物中緩慢加入4倍體積乙醇(95%)，4 ℃下靜置12 h[11]，抽濾，得沉淀，烘干，得到粗多糖，稱重并測定多糖的含量，計算提取率。

1.3.2.2 提取時間對苔干多糖提取率的影響 選擇最佳的料液比，提取時間分別設(shè)置為60、90、120、150、180 min，其他實驗條件同1.3.1.1，考察提取時間對苔干多糖得率的影響。

1.3.2.3 提取溫度對苔干多糖提取率的影響 選擇最佳的料液比及提取時間，提取溫度與加入的蒸餾水溫度分別設(shè)置為50、60、70、80、90 ℃，其他實驗條件同1.3.2.1，考察提取溫度對苔干多糖得率的影響。

1.3.2.4 提取次數(shù)對苔干多糖提取率的影響 選擇最佳的料液比、提取時間及提取溫度，提取次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4 次，其他實驗條件同1.3.2.1，考察提取次數(shù)對苔干多糖提取率的影響。

1.3.2.5 超聲功率對苔干多糖提取率的影響 選擇最佳的料液比、提取時間、提取溫度及提取次數(shù)，超聲功率分被設(shè)置為100、150、200、250、300、350、400 W，其他實驗條件同1.3.2.1節(jié)所述，考察超聲功率對苔干多糖提取率的影響。

1.3.2.6 苔干多糖提取的響應(yīng)面實驗 結(jié)合單因素的實驗結(jié)果，設(shè)計優(yōu)化苔干多糖提取率的響應(yīng)面實驗。根據(jù) Design-Expert 8.0 中 Box-Behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理[12]，進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，實驗因素及水平設(shè)計見表1，以苔干多糖提取率為響應(yīng)值。對各因素及響應(yīng)值進行多元線性回歸和二項式擬合，通過對回歸方程的分析及各因素交互作用的響應(yīng)面圖形分析，尋求最優(yōu)苔干多糖的提取工藝。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平設(shè)計表

1.3.3 苔干多糖除蛋白純化方法的研究 為獲得多糖提取率較高的苔干多糖，以苔干粗多糖為研究對象，比較 Sevage 法、TCA 法、木瓜蛋白酶法的除蛋白效果。

1.3.3.1 Sevage 法除蛋白 取一定量苔干粗多糖溶液，分別按多糖與Sevage試劑的比例為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1)，震蕩30 min，然后以4000 r/min離心10 min，棄去有機層和蛋白質(zhì)沉淀層，重復(fù)上述操作，直至無變性蛋白質(zhì)出現(xiàn)，測定上清液的多糖含量，計算多糖的保留率[13]。

1.3.3.2 TCA 法除蛋白 取一定量的苔干粗多糖溶液，分別加入20%三氯乙酸(TCA)至終濃度為1%、3%、6%、9%、12%、15%，震蕩搖勻，在4 ℃條件下靜置2 h后，4000 r/min離心15 min，棄去沉淀，將上清液用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至中性，測定上清液中多糖含量，計算多糖的保留率[14]。

1.3.3.3 木瓜蛋白酶法除蛋白 取一定量的苔干粗多糖溶液，木瓜蛋白酶溶液添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，調(diào)節(jié)溶液pH為6，酶解溫度設(shè)置為50 ℃，酶解2 h，酶解后糖液放入沸水浴滅酶5 min，冷卻至室溫。4000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上層清液測定多糖含量，計算多糖的保留率[15]。

1.3.4 苔干多糖的抗氧化性研究 測定苔干多糖對DPPH·、羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力[16-18]。

1.4 多糖提取率、純化率的測定

采用苯酚-硫酸法測定苔干多糖的含量。

多糖提取率的計算方法：多糖提取率=粗多糖質(zhì)量×多糖含量/苔干粉質(zhì)量×100%；

多糖保留率的計算方法：多糖保留率=脫蛋白后多糖含量/脫蛋白前多糖含量×100%。

1.5 多糖抗氧化性的測定

1.5.1 DPPH·清除率計算公式 DPPH·清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%(A0為空白對照液的吸光度；Ax為待測溶液的吸光度)。

1.5.2 羥自由基清除率計算公式 羥自由基清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%(A0為空白對照液的吸光度；Ax為待測溶液的吸光度)。

1.5.3 超氧陰離子自由基清除率的計算公式 超氧陰離子自由基清除率=[(A0-Ax)/A0]×100%。(A0為空白對照液的吸光度；AX為待測溶液的吸光度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚-硫酸法測得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.0519x+0.028，R2=0.9931。

2.2 苔干多糖提取工藝研究

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 料液比對苔干多糖提取率的影響 料液比對苔干多糖提取率的的影響見圖1。從結(jié)果來看，料液比對苔干多糖的提取率有一定影響，隨著料液比的升高，苔干多糖的提取率先升高后降低，其中料液比1∶30時，提取率最高，為5.26%。在一定范圍內(nèi)料液比升高，有利于苔干多糖的溶出，但料液比升高會影響超聲輔助提取多糖的效率，導(dǎo)致提取率降低。

圖1 料液比對苔干多糖提取率的影響

2.2.1.2 提取時間對苔干多糖提取率的影響 選取最佳的料液比，提取時間對苔干多糖提取率的影響如圖2所示。隨著提取時間的增加，苔干多糖的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中90 min時提取率最高，為5.46%。多糖是活性物質(zhì)，采用超聲輔助提取時，時間對多糖的提取是累加效應(yīng)，時間延長，超聲波對多糖的破壞程度增加，導(dǎo)致多糖破壞，提取率降低。

圖2 提取時間對苔干多糖提取率的影響

2.2.1.3 提取溫度對苔干多糖提取率的影響 選取最佳的料液比及提取時間，提取溫度對苔干多糖提取率的影響如圖3所示，可以看出，提取溫度的升高有利于苔干多糖的溶出，提取溫度為80 ℃時苔干多糖的提取率最高，為5.52%。溫度繼續(xù)升高，加之超聲波的作用，有可能破壞多糖，導(dǎo)致提取率降低。

圖3 提取溫度對苔干多糖提取率的影響

2.2.1.4 提取次數(shù)對苔干多糖提取率的影響 提取次數(shù)對苔干多糖的提取率具有一定的影響(圖4)，從圖中可以看出，提取次數(shù)越高，苔干多糖的提取率升高，提取4次時提取率最高，為6.12%，提取3～4次時提取率升高的不顯著，考慮到時間、能耗及后續(xù)濃縮、醇沉?xí)r間及成本，苔干多糖提取2次較佳。

圖4 提取次數(shù)對苔干多糖提取率的影響

2.2.1.5 超聲功率對苔干多糖提取率的影響 超聲功率對苔干多糖提取率的影響如圖5所示，可以看出，超聲功率對苔干多糖的提取有一定影響，隨著超聲功率的增加，苔干多糖的提取率先升高后降低，超聲功率為200 W時苔干多糖的提取率最高為6.21%，一定程度的超聲有助于苔干多糖的提取，但是超聲功率過大對多糖的破壞作用增強，造成苔干多糖提取率有所下降。

圖5 超聲功率對苔干多糖提取率的影響

2.2.2 響應(yīng)面實驗 采用 Design-Expert.V8.0.6軟件，對苔干多糖提取率的響應(yīng)面實驗條件設(shè)計及結(jié)果見表2。根據(jù)各因素對實驗結(jié)果的影響進行二次回歸模型的擬合，擬合后得到下式：Y=6.3+0.24A-0.025B-0.31C-0.12AB+0.28AC-0.34BC-0.72A2-0.12B2-0.57C2，其中Y為苔干多糖的提取率，A、B、C分別是液料比、提取溫度、提取時間的編碼。

對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果如表3所示。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸方程各項的方差分析

響應(yīng)面各因素交互作用分析結(jié)果如圖6所示。

圖6 響應(yīng)面各因素交互作用圖

由 Design-Expert.V8.0.6軟件分析，苔干多糖的最佳提取條件為料液比為1∶30.70、提取溫度83.57 ℃，提取時間79.21 min，苔干多糖的提取率為6.56%。結(jié)合實際實驗條件，設(shè)置料液比為1∶31、提取溫度為84 ℃、提取時間為80 min，提取次數(shù)為2次，進行驗證實驗(平行3次)，在此實驗條件下，苔干多糖的提取率為6.41%±0.11%，實際測定值與理論值相近，說明擬合模型擬合良好。

2.3 苔干多糖脫蛋白純化方法研究

圖7表示采用 Sevage 法對苔干多糖脫蛋白純化的研究。從圖7可以看出，隨著 Sevage 試劑添加量升高苔干多糖的保留率降低，其中 Sevage 試劑添加量為4:1時多糖保留率最高，為80.34%。

圖7 Sevage 試劑添加量對苔干多糖保留率的影響

采用TCA法對苔干多糖脫蛋白純化的研究結(jié)果如圖8所示，隨著加入的三氯乙酸濃度的升高，苔干多糖的保留率先升后降，TCA濃度為9%時苔干多糖的保留率最高，為83.41%。

圖8 三氯乙酸濃度對苔干多糖保留率的影響

采用木瓜蛋白酶法對苔干多糖脫蛋白純化的研究結(jié)果如圖9所示，可以看出，隨著酶液添加量的增加探桿多糖保留率升高，其中酶液添加量為5%時多糖保留率最高，為85.98%。

圖9 木瓜蛋白酶添加量對苔干多糖保留率的影響

以苔干多糖保留率為指標(biāo)，3種脫蛋白方法的研究相比較而言，采用木瓜蛋白酶除蛋白的效果最佳。

2.4 苔干多糖的抗氧化性研究

圖11 苔干多糖濃度對羥基自由基的清除能力的影響

圖12 苔干多糖濃度對超氧陰離子自由基的清除能力的影響

圖10～12分別表示苔干多糖對DPPH·、羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力。可以看出，隨著多糖濃度的升高，多糖對DPPH·、羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力均增強，其中苔干多糖對DPPH·的最大清除率為59.65%，對羥基自由基最大的清除率為49.31%，對超氧陰離子自由基最大的清除率為63.93%。結(jié)果表明苔干多糖具有一定的抗氧化性，但與Vc清除DPPH·、羥基自由基及超氧陰離子自由基能力相比，苔干多糖的抗氧化性不如Vc。

圖10 苔干多糖濃度對DPPH·的清除能力的影響

3 結(jié)論

本文對苔干多糖的研究，主要從以下幾個方面進行。

(1)首先，采用超聲波輔助水提法提取苔干多糖，分別進行了單因素實驗和響應(yīng)面實驗分析，得出了苔干多糖的最佳提取工藝：料液比為1∶30.07、提取溫度83.57 ℃，提取時間79.22 min，提取次數(shù)2次，超聲功率為200 W；此外，因素影響程度的大小順序為提取時間>水料比>提取溫度。根據(jù)實際情況，苔干多糖的提取條件可選擇為料液比為1∶31、提取溫度84 ℃，提取時間80 min，提取次數(shù)2次，超聲功率200 W。

(2)其次，以苔干多糖保留率為指標(biāo)，選取Sevage 法、TCA法、木瓜蛋白酶法對苔干多糖的進行除蛋白，發(fā)現(xiàn)相比 Sevage 法、TCA法除蛋白，采用木瓜蛋白酶除蛋白的效果最佳。

(3)最后，研究苔干多糖的抗氧化性，并與Vc進行對比，發(fā)現(xiàn)苔干多糖具有一定的抗氧化能力，苔干多糖在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的升高，苔干多糖對DPPH·、羥基自由基及超氧陰離子自由基的清除能力增強，其中苔干多糖對DPPH·的最大清除率為59.65%，對羥基自由基最大的清除率為49.31%，對超氧陰離子自由基最大的清除率為63.93%。