刁保忠,靳維榮,周德剛
(聊城市人民醫(yī)院制劑科,山東 聊城 252000)
丹參是唇形科鼠尾草屬植物,性苦,微寒,歸心、肝經(jīng),功效以祛瘀止痛、活血通經(jīng)等為主,是當(dāng)下治療心血管疾病的傳統(tǒng)中藥之一?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究指出,丹參的有效成分以酚酸類及黃酮類為主,酚酸類是一類含有酚羥基的有機(jī)酸類化合物,屬于丹參莖葉與丹參藥用部位類似的成分[1]。本次研究基于前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,將丹參莖葉內(nèi)酚酸類及黃酮類成分設(shè)為研究對(duì)象,對(duì)其提取純化工藝作出如下研究。
Agilent 1200型液相色譜儀,Agilent TC C18色譜柱與保護(hù)柱;玻璃層析柱。藥用乙醇,
高純水(自制),丹參素鈉等。丹參取自天士力商洛GAP種植基地。樣品在48℃條件下熱風(fēng)烘干,干燥后經(jīng)粉碎處理后過40目篩,于常溫下密封干燥、保存以備用。
(1)確定色譜條件:色譜柱是Agilent TC C18;柱溫、流動(dòng)相、流動(dòng)相、體積流量、進(jìn)樣量依次為35℃,乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.4 ml/min、2 μL。用于檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm(丹酚酸類)與254 nm(黃酮類)。
(2)制取對(duì)照品溶液:精確稱取丹參素、原兒茶酸、蘆丁、異槲皮苷,放置于棕色量瓶?jī)?nèi),加入90%甲醇以制備含丹參素0.155 mg/mL、原兒茶酸0.115 mg/mL、蘆丁 0.123 mg/mL、異槲皮苷 0.122 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。
(3)制取供試品溶液:具體是取適量溶液,定容處理到相應(yīng)容積,充分混合,濾過,12500 r/min離心處理12 min,提取上層清液,采用0.22 μm微孔濾膜濾過處理后即可獲得。
(4)考察線性關(guān)系:提取混合對(duì)照組溶液,分別稀釋到2、10、100倍,用0.22 μm微孔濾膜濾過處理,依照“(1)”中的色譜條件依次分析,將對(duì)照樣品的質(zhì)量濃度、峰面積分別設(shè)為橫坐標(biāo)(X)、縱坐標(biāo)(Y),勾畫標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算出相應(yīng)的回歸方程。
(5)精密性試驗(yàn):量取混合對(duì)照品溶液持續(xù)進(jìn)樣5次,記錄各對(duì)照品對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積。若各對(duì)照品色譜峰峰面積的RSD均<1.34%,則提示儀器精密性優(yōu)良。
(1)考察提取方法:①超聲提?。喝〉⑶o葉藥材適量,粉碎處理后過40目篩,精確量取5 g粉末,采用料液比為1∶8、乙醇超聲(300 W,50 kHz)連續(xù)提取2次,每次對(duì)應(yīng)的提取時(shí)間均為30 min,檢測(cè)指標(biāo)成分的含量。②乙醇回流:取材適量,粉碎后依然過40目篩,稱取5 g粉末,料液比為18,乙醇回流進(jìn)行2次提取,每次對(duì)應(yīng)的提取時(shí)間為60min,定量檢測(cè)。結(jié)果表明,在指標(biāo)成分提取率比較上,進(jìn)行單因素與正交試驗(yàn)考察。
(2)提取時(shí)間:取材適量,粉碎處理后過40目篩,稱取粉末5 g,利用60%乙醇,料液比1:8,提取1次,考察不同的提取時(shí)間點(diǎn)(1.0、1.5、2.0、2.5 h)對(duì)提起成分總量形成的影響。結(jié)果提示,伴隨時(shí)間的推延,丹參莖葉酚酸類及黃酮類成分含量有上升趨勢(shì),且在2.0 h時(shí)達(dá)到峰值,隨后有降低趨勢(shì)。提取時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5 h時(shí),黃酮類成分含量分別為3.95、4.06、3.98、3.82,酚酸類依次為36.47、36.83、39.60、37.76,總量分別為40.44、40.88、43.58、41.61(單位㎎/g)。因?yàn)榈し铀酈穩(wěn)定性偏差,不適合長(zhǎng)時(shí)間加熱,故而選擇1.0、2.0 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。
(3)提取頻次:伴隨提取頻次的增加,成分總量有不斷上升的趨勢(shì),提取3次后總量不再上升。
(4)正交試驗(yàn):取材適量,粉碎后過40目篩,精確量取6份藥材,每份均5 g,依照L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。依照單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(C)及提取頻次(D)3個(gè)因素,考察最優(yōu)的提取工藝條件。試驗(yàn)結(jié)果表明,各因素作用主次為D>C>A。見表1。
表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與直觀分析
利用靜態(tài)吸附法,篩選出丹參莖葉純化對(duì)應(yīng)的最適樹脂。精確量取 D101、HDP-100、X-5、AB-8濕樹脂各1.0 g,分別放置在50 mL三角燒瓶?jī)?nèi),依次加入最佳工藝參莖葉濃縮提取液(10 mL),混合搖勻。對(duì)靜態(tài)飽和吸附的樹脂進(jìn)行過濾處理,加入10ml 50%乙醇,再次混合搖勻,檢測(cè)吸液內(nèi)黃酮類與酚酸類成分量,測(cè)算各樹脂對(duì)應(yīng)的解吸率。結(jié)果表明,X-5、AB-8兩者的吸附效果無(wú)顯著差異。
用AB-8 型大孔吸附樹脂予以純化,40%乙醇洗脫,洗脫用量為3BV是最佳純化工藝,酚酸類及黃酮類成分總純度能達(dá)到42.17%
采用AB-8型大孔吸附樹脂予以純化,40%乙醇洗脫,洗脫用量為3BV是最佳純化工藝[2],酚酸類及黃酮類成分總純度能達(dá)到42.17%。由此可見,選擇最優(yōu)提取工藝,能提高丹參莖葉酚酮的提取純化效率,為資源開發(fā)提供支撐。