董娟，馬龍，夏夢，孟慧，張園，蔡令波，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心，南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210029)

控制性促排卵是人類輔助生殖助孕過程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的是促進(jìn)多個(gè)卵泡發(fā)育，獲得數(shù)量適當(dāng)?shù)某墒炻涯讣?xì)胞，進(jìn)而獲得數(shù)量可觀的可用胚胎，從而提高妊娠率。在促排卵過程中，常規(guī)使用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)或使用促性腺激素釋放激素拮抗劑來直接抑制LH 峰，因此必須使用外源性絨毛膜促性腺激素來促進(jìn)卵泡的最后成熟和卵子減數(shù)分裂的恢復(fù)，我們把這個(gè)過程俗稱扳機(jī)[1]，扳機(jī)最常用的外源性激素是HCG。

目前常規(guī)取卵時(shí)間為HCG注射后36 h，但HCG注射后授精時(shí)間尚無統(tǒng)一意見。有研究認(rèn)為，常規(guī)體外受精的最佳授精時(shí)間在HCG注射后40～41 h，因?yàn)榇藭r(shí)間段的臨床妊娠率較高、早期流產(chǎn)率較低[2]。還有研究表明，卵子體外培養(yǎng)2～7 h甚至更長時(shí)間(HCG注射后35～45 h)行ICSI授精，臨床妊娠率無明顯差異[3-4]。有研究者認(rèn)為，ICSI周期中成熟卵母細(xì)胞最合適的孵育時(shí)間是5～6 h，此時(shí)具有較高的胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率[5]。本文采取回顧性分析的方法，探討HCG注射后不同授精時(shí)機(jī)對IVF-ET臨床結(jié)局的影響。

材料與方法

一、研究對象及分組

本研究數(shù)據(jù)來源于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(CCRM)，檢索并回顧性分析2014年1月至2019年4月進(jìn)行的IVF-ET助孕周期，均采用長方案和拮抗劑方案促排卵。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方因盆腔輸卵管因素不孕；(2)女方年齡≤38歲；(3)獲卵數(shù)在3～20枚之間；(4)夫婦雙方染色體正常；(5)男方精液各項(xiàng)指標(biāo)符合常規(guī)IVF標(biāo)準(zhǔn)；(6)第一周期促排卵；(7)行卵裂期胚胎移植。

最終有2 878個(gè)周期納入分析。根據(jù)HCG注射后授精時(shí)機(jī)的不同分為三組。A組：HCG注射后38～39 h(含38 h)授精(n=404)；B組：HCG注射后39～<40 h(含39 h)授精(n=1 293)；C組：HCG注射后40～<41 h(含40 h)授精(n=1 181)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：采用長方案和拮抗劑方案促排卵[6]。(1)卵泡期長方案：月經(jīng)周期第1～2天，陰道B 超監(jiān)測并記錄竇卵泡個(gè)數(shù)及大小，無直徑>10 mm卵泡時(shí)予長效GnRH-a(達(dá)菲林，益普生，法國)3.75 mg肌注，30～35 d后行性激素及B超檢查，F(xiàn)SH達(dá)到3.0 U/L左右后給予重組人卵泡刺激素(r-FSH，果納芬，默克雪蘭諾，德國)促進(jìn)卵泡發(fā)育，根據(jù)性激素及B超情況調(diào)整Gn用量；當(dāng)直徑≥18 mm卵泡數(shù)占直徑≥14 mm卵泡數(shù)的50%時(shí)，停止使用Gn，肌注HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)6 500 U，注射后36 h取卵。(2)拮抗劑方案：于月經(jīng)周期第3天，陰道B超監(jiān)測并記錄竇卵泡個(gè)數(shù)及大小，無直徑>10 mm卵泡時(shí)開始Gn促排卵，以果納芬100～225 U和(或)注射用尿促性素(HMG，樂寶得，珠海麗珠醫(yī)藥)75 U啟動(dòng)；Gn應(yīng)用4～5 d后經(jīng)性激素及B超檢查，在優(yōu)勢卵泡直徑≥12～13 mm或雌激素達(dá)3 000 pmol/L時(shí)開始注射醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，德國)0.25 mg/d至HCG日。HCG注射及取卵時(shí)間同卵泡期長方案。

2.體外授精和胚胎培養(yǎng)：按照本中心常規(guī)流程，HCG注射后36 h采用經(jīng)陰道后穹隆穿刺法獲取卵母細(xì)胞。獲取的卵泡抽吸液在體視顯微鏡下收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，于IVF液(Fertilization Medium，COOK，美國)中培養(yǎng)；取卵當(dāng)日男方手淫法采取精液，液化后的精液經(jīng)密度梯度離心法結(jié)合上游法獲得有效精子，精子質(zhì)量符合IVF授精要求。取卵獲得的卵子至少培養(yǎng)2 h后進(jìn)行IVF授精，精子濃度為3～5×105/ml。授精后4 h拆除顆粒細(xì)胞，將卵子轉(zhuǎn)移至卵裂培養(yǎng)液(Cleavage Medium，COOK，美國)中，授精后18 h左右觀察受精情況，出現(xiàn)雙原核的為正常受精，授精后第3天進(jìn)行卵裂期胚胎發(fā)育評(píng)估。

3.胚胎評(píng)分和胚胎移植：卵裂期胚胎評(píng)分方法參照文獻(xiàn)[7-8]。在400倍倒置顯微鏡下，根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)和碎片情況對第3天胚胎進(jìn)行評(píng)分，具體分為Ⅰ～I(xiàn)V級(jí)。評(píng)分為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎。根據(jù)第3天胚胎評(píng)分和患者雌激素水平及內(nèi)膜厚度，選擇1～2枚胚胎進(jìn)行移植，移植后常規(guī)黃體支持。對于移植后有剩余胚胎的患者，經(jīng)其知情同意后行囊胚培養(yǎng)或胚胎冷凍。

4.臨床結(jié)局判斷：移植后14 d檢測血β-HCG，若β-HCG值為陽性則移植后30 d行超聲檢查，超聲下見孕囊及胎心管搏動(dòng)判定為臨床妊娠。妊娠12周內(nèi)發(fā)生胚?；蛉焉镂锱懦鲈\斷為早期流產(chǎn)。妊娠滿28周且至少有1個(gè)存活新生兒分娩判定為活產(chǎn)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、三組患者基本臨床資料比較

三組患者間平均年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、抗苗勒管激素(AMH)等基礎(chǔ)指標(biāo)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者基本臨床資料比較(-±s)

二、三組患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

三組患者間正常受精率有顯著性差異，且隨著授精時(shí)間的延遲，正常受精率逐漸提高(P<0.05)；C組的多精受精率顯著低于A組和B組(P<0.05)；三組間卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

三、三組患者移植周期的臨床結(jié)局比較

三組患者間臨床妊娠率、胚胎種植率、流產(chǎn)率以及每移植周期活產(chǎn)率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表2 三組患者實(shí)驗(yàn)室結(jié)局比較[(-±s)，%]

表3 三組患者的臨床結(jié)局比較(%)

討 論

當(dāng)前，輔助生殖技術(shù)的最終目標(biāo)已由最初的追求成功妊娠轉(zhuǎn)變成希望患者擁有一個(gè)活產(chǎn)的健康的嬰兒，本研究對HCG注射后不同時(shí)間行IVF授精的臨床結(jié)局包括每移植周期活產(chǎn)率進(jìn)行了比較研究。結(jié)果提示，在一定時(shí)間范圍內(nèi)(38～41 h)，對于38歲及以下接受常規(guī)促排卵行IVF-ET的患者，HCG注射后的不同時(shí)間授精并不影響IVF-ET的臨床結(jié)局。

早期的IVF-ET技術(shù)是在自然周期進(jìn)行，獲卵數(shù)及可供移植的胚胎少，成功率相對低?？刂菩源倥怕训膽?yīng)用改善了IVF-ET的臨床妊娠率，對提高成功率和促進(jìn)輔助生殖衍生技術(shù)的發(fā)展發(fā)揮了重要作用[6]。生理?xiàng)l件下，卵母細(xì)胞的成熟包括核成熟和胞質(zhì)成熟，兩者精確同步并且相互協(xié)調(diào)，是卵母細(xì)胞正常受精和胚胎進(jìn)一步發(fā)育的保障。但是控制性促排卵獲得的同一批卵母細(xì)胞成熟狀態(tài)并非一致。有研究認(rèn)為促排卵獲得的卵母細(xì)胞中有15%處于第一次減數(shù)分裂中期和生發(fā)泡(GV)期[9]。不少研究認(rèn)為取卵后卵母細(xì)胞在體外的孵育時(shí)間會(huì)影響卵母細(xì)胞的成熟、受精及胚胎發(fā)育潛能[10-11]。若IVF授精過早，有一部分卵母細(xì)胞仍處于未成熟狀態(tài)，或者有部分卵母細(xì)胞核質(zhì)未成熟，紡錘體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及功能異常，易導(dǎo)致受精率低且胚胎發(fā)育潛能低下[12]。若授精過晚，卵母細(xì)胞可能老化，紡錘體結(jié)構(gòu)異常比率升高，可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而影響受精率和胚胎質(zhì)量。

目前有不少有關(guān)HCG注射后IVF或ICSI授精時(shí)機(jī)的研究，但是最佳授精時(shí)機(jī)尚無定論。對于ICSI授精來說，大多數(shù)研究的總體建議是在37～42 h之間進(jìn)行ICSI授精，可以獲得理想的實(shí)驗(yàn)室和臨床結(jié)局[13-17]。陳威等[18]的報(bào)道稱采用固定方案患者的ICSI周期中，授精時(shí)機(jī)在38～43 h的窗口期均能達(dá)到比較一致的胚胎質(zhì)量及臨床妊娠率。然而對于IVF授精時(shí)機(jī)的研究并不是很多。有研究認(rèn)為HCG注射后授精時(shí)間間隔對受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率及臨床結(jié)局沒有明顯影響[4，19]。但蔡慧中等[2]認(rèn)為最佳授精時(shí)間為HCG注射后40～41 h，認(rèn)為此時(shí)授精的患者有較高的臨床妊娠率和較低的早期流產(chǎn)率。對HCG注射后不同時(shí)間授精所得到的研究結(jié)論并非一致，而且只是停留在實(shí)驗(yàn)室或早期妊娠階段，并未對后續(xù)活產(chǎn)情況進(jìn)行追蹤報(bào)道。

有研究認(rèn)為，在促排卵過程中，當(dāng)卵泡大小發(fā)育到一定直徑后，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞有足夠的LH受體，成熟卵泡的排出將在HCG注射后38～40 h發(fā)生[20-21]。根據(jù)我中心臨床工作的時(shí)間安排，本研究將IVF授精時(shí)間段設(shè)定在HCG 注射后38～41 h。通過研究發(fā)現(xiàn)，隨著HCG注射后授精時(shí)間的延長，正常受精率顯著增加而多精受精率顯著降低。說明HCG注射后，在一定時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延長授精的時(shí)間，可以改善受精情況?？紤]可能原因是促排卵獲得的部分卵母細(xì)胞核質(zhì)不同步，延長其體外培養(yǎng)時(shí)間有利于卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的同步性，從而提高卵母細(xì)胞的質(zhì)量及成熟度并最終提高正常受精率，降低多精受精率。本研究中不同授精時(shí)間三組的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、胚胎種植率以及早期流產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與吳竺等[4]的研究結(jié)果相似。本研究還對患者后續(xù)的活產(chǎn)情況進(jìn)行了追蹤隨訪，發(fā)現(xiàn)三組間的每移植周期活產(chǎn)率也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究報(bào)道了HCG注射后不同時(shí)機(jī)授精對活產(chǎn)率的影響，對臨床工作有一定的指導(dǎo)意義。不足之處在于未對兩種促排卵方案進(jìn)行區(qū)分比較，亦未加入凍融胚胎移植周期細(xì)分研究。有研究認(rèn)為在授精時(shí)機(jī)的選擇上也要根據(jù)卵母細(xì)胞的成熟度和質(zhì)量來決定[22]。因此，在將來的研究中，應(yīng)加大樣本量并進(jìn)行細(xì)致分組，綜合促排卵方案、患者年齡、卵母細(xì)胞的成熟度和質(zhì)量等因素進(jìn)行更全面地分析，以期為臨床提供更準(zhǔn)確的參考數(shù)據(jù)，更好地提高IVF-ET助孕的臨床結(jié)局。

綜上，本研究結(jié)論提示，在一定時(shí)間范圍內(nèi)(38～41 h)，HCG注射后的授精時(shí)機(jī)并不影響38歲及以下患者的IVF-ET臨床結(jié)局。在此時(shí)間范圍內(nèi)適當(dāng)延遲授精時(shí)機(jī)，可以提高正常受精率，降低多精受精率。