耿正瑋，樊林娟，張?jiān)伱?，程艷芬，馮翠萍，*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中030801；2.臨汾市國有企業(yè)監(jiān)事會(huì)，山西臨汾041000）

杏鮑菇又名刺芹側(cè)耳，是歐洲南部、非洲北部以及中亞地區(qū)高山、草原、沙漠地帶的一種品質(zhì)優(yōu)良的大型肉質(zhì)傘菌，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，對(duì)人體具有抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗腫瘤[4]等生理功效。杏鮑菇中的蛋白質(zhì)含量約12.4%～35%，8種必需氨基酸齊全，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食用菌[5]。魏君慧等[6]采用Osborne法分離杏鮑菇中的主要蛋白組分，并研究其理化性質(zhì)和功能特性。陳雪洋等[7]通過干燥、粉碎、堿提、酸沉、回調(diào)、凍干等工藝提取杏鮑菇蛋白質(zhì)，并對(duì)其功能特性進(jìn)行了分析。本課題組前期試驗(yàn)結(jié)果表明：杏鮑菇中谷蛋白含量占總蛋白含量的30.71%，關(guān)于谷蛋白的理化性質(zhì)和功能特性鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以杏鮑菇粉為原料，采用Osborne法分離出杏鮑菇谷蛋白，對(duì)其分子量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、巰基含量、變性溫度及氨基酸組成進(jìn)行測(cè)定，并研究離子強(qiáng)度、溫度、pH值、蔗糖濃度對(duì)其功能特性的影響，為杏鮑菇谷蛋白質(zhì)在食品加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇粉：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌中心提供；考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：上海源葉生物科技有限公司；5，5，-二硫雙（2-硝基苯甲酸）[5，5'-dithiobis（2-nitrobenzoic acid），DTNB]、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：美國 sigma 公司；色拉油：市售；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-2型電子恒溫水浴鍋：天津市賽得利斯有限公司；ST3100型酸度計(jì)、AR224型電子分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；LD5-2B型高速離心機(jī)：北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；UV-120型紫外-可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；GZX-G型漩渦振動(dòng)儀器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；Tensor傅里葉紅外變換光譜儀：Bruker；Lab Sys同步熱分析儀：法國SE TARAM；Biochro氨基酸自動(dòng)分析儀：英國百康。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 杏鮑菇谷蛋白的提取

稱取一定量的杏鮑菇粉，以蒸餾水為提取劑，先提取清蛋白，將提取清蛋白后的沉淀用3%NaCl浸提球蛋白，將提取球蛋白后的沉淀用70%乙醇浸提醇溶蛋白，將提取醇溶蛋白后的沉淀用1%NaOH浸提得到谷蛋白。

1.3.2 杏鮑菇谷蛋白理化性質(zhì)研究

1.3.2.1 等電點(diǎn)的測(cè)定

將提取醇溶蛋白后的沉淀按一定的料液比加入0.01 mol/L NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值提取谷蛋白，離心后分別吸取10.0 mL上清液于9個(gè)離心管中，調(diào)節(jié)各上清液的pH值，以pH4.1開始按照0.1的梯度進(jìn)行調(diào)節(jié)最終至5.0，在4500r/min離心20min，取上清液1.0mL，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量最低時(shí)的pH值即為等電點(diǎn)。

1.3.2.2 巰基含量的測(cè)定

1）二硫鍵的測(cè)定：

式中：A412為412 nm條件的吸光值；ε為分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D為稀釋倍數(shù)。

2）自由巰基的測(cè)定：

式中：A412為412 nm條件的吸光值；ε為分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D為稀釋倍數(shù)。

3）總巰基的測(cè)定：

式中：A412為412 nm條件的吸光值；ε為分子吸光度13 900[（mol×cm）/L]；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

取谷蛋白固體樣品2.0mg、光譜醇KBr約200.0mg，在瑪瑙研缽中研磨至細(xì)膩的粉末狀，取適量樣品分散系置于壓片模具中，將壓片模具置于壓片機(jī)上，在一定的壓力下壓制成薄片，在光譜儀中做全波長(zhǎng)掃描。

1.3.2.4 變性溫度的測(cè)定

采用示差量熱掃描（differential scanning calorimetry，DSC）儀測(cè)定杏鮑菇谷蛋白變性溫度，稱取谷蛋白固體樣品10.0 mg于樣品皿中，用壓樣機(jī)封樣，進(jìn)行掃描。

1.3.2.5 氨基酸組成的測(cè)定

參照GB/T 5009.124-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》方法，準(zhǔn)確稱取杏鮑菇谷蛋白凍干粉，將蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成游離氨基酸，利用氨基酸分析儀對(duì)杏鮑菇谷蛋白氨基酸進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 杏鮑菇谷蛋白功能特性研究

1.3.3.1 離子強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響因素

配制濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的NaCl溶液，分別測(cè)定不同濃度的NaCl溶液對(duì)谷蛋白的溶解性（solubility，S），持水性（water holding capacity，WA），持油性（oil holding capacity，F(xiàn)A），起泡性（foam capability，F(xiàn)C）及起泡穩(wěn)定性（foam stability，F(xiàn)S），乳化性（emulsion capability，EC）及其乳化穩(wěn)定性（emulsification stability，ES）的影響。

1.3.3.2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響因素

將處理好蛋白液置于溫度分別置于以30℃開始按照10℃梯度遞增到70℃的水浴鍋中，加熱10 min后取出，待其冷卻至25℃后，分別測(cè)定不同溫度對(duì)杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。

1.3.3.3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響因素

將處理好的蛋白液，用0.01 mol/L的HCl或者NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值，以pH 3.0開始按照0.5梯度遞增到5.0，分別測(cè)定不同pH值對(duì)杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。

1.3.3.4 蔗糖濃度對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響因素

分別配制濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的蔗糖溶液，測(cè)定不同濃度的蔗糖溶液對(duì)杏鮑菇谷蛋白S、WA、FA、FC及FS、EC及其ES的影響。

1.3.3.5 功能特性指標(biāo)測(cè)定

1）蛋白含量的測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中蛋白含量（g）。

2）溶解性：參照馮笑笑[8]的方法，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白含量，按下式計(jì)算溶解性（S）。

3）持水性：參照龐庭才等[9]的方法，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)持水性（WA）。

式中：m為蛋白樣品質(zhì)量，g；m1為離心管和蛋白樣品的質(zhì)量，g；m2為離心管和沉淀物的質(zhì)量，g。

4）持油性：參照張艷榮等[10]的方法，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)持油性（FA）。

式中：m為蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量，g；m1為離心管和蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量，g；m2為離心管和沉淀物的質(zhì)量，g。

5）起泡性及起泡穩(wěn)定性：照楊華連等[11]的方法，按下式計(jì)算其起泡性（FA）及起泡穩(wěn)定性（FS）。

式中：V初始溶液體積，mL；V0為剪切后0 min的泡沫體積，mL；V30為剪切后30 min的泡沫體積，mL。

6）乳化性：參照林洋[12]方法，按下式計(jì)算蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性（ES）及乳化穩(wěn)定性（ES）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每份樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，使用OriginPro8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏鮑菇谷蛋白理化性質(zhì)

2.1.1 等電點(diǎn)

杏鮑菇谷蛋白等電點(diǎn)見圖1。

圖1 杏鮑菇谷蛋白等電點(diǎn)Fig.1 The protein isoelectric point of Pleurotus eryngii gluten

由圖1可知，隨著蛋白液pH值的增加，溶液中蛋白含量先迅速減小，在pH值為4.3時(shí)蛋白含量達(dá)到最小，隨著pH值的增加，溶液中蛋白質(zhì)含量趨于穩(wěn)步的增長(zhǎng)趨勢(shì)。

2.1.2 分子量

杏鮑菇谷蛋白分子量見圖2。

圖2 杏鮑菇谷蛋白SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE diagram of Pleurotus eryngii albumin and glutelin

由圖2可知，谷蛋白分布在30.28、25.39 kDa附近。

2.1.3 巰基含量

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是通過巰基和二硫鍵維持的，二硫鍵和巰基可通過氧化還原進(jìn)行相互的轉(zhuǎn)化，杏鮑菇谷蛋白巰基和二硫鍵含量見表1。

表1 谷蛋白的巰基和二硫鍵含量Table 1 Sulfhydryl and disulfide bond contents of glutenin

由表1可知，杏鮑菇谷蛋白總巰基含量為67.06 μmol/g，易與水結(jié)合。二硫鍵是一種共價(jià)鍵，它的形成使蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)更加緊密，其可通過還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化形成巰基，二硫鍵的減少使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)松散。杏鮑菇谷蛋白二硫鍵含量相對(duì)較高，說明谷蛋白具有很好的熱穩(wěn)定性，在加工過程中熱穩(wěn)定性高。

2.1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

杏鮑菇谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量見圖3、表2。

圖3 杏鮑菇谷蛋白紅外光譜圖Fig.3 DSC scans of the Pleurotus eryngii glutenin

表2 杏鮑菇谷蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structure contents of glutenin in Pleurotus eryngii

由圖3可見，2 000 cm-1～1 500 cm-1為雙鍵伸縮振動(dòng)區(qū)，1 659、1 661 cm-1附近的峰說明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶有α螺旋；在1631cm-1附近出現(xiàn)的峰說明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶存在β折疊；在1 668、1 674 cm-1的峰證明杏鮑菇谷蛋白在酰胺Ⅰ帶存在β轉(zhuǎn)角，由表2可知，α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角含量分別為31.41%、55.15%、13.45%。

2.1.5 熱變性溫度

杏鮑菇谷蛋白熱變性溫度見圖4。

圖4 杏鮑菇谷蛋白DSC掃描圖Fig.4 DSC scan of glutenin in Pleurotus eryngii

由圖4可知，谷蛋白的變性溫度為73.59℃。不同結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對(duì)溫度的敏感性不同，在加工過程中，溫度的控制及其重要。

2.1.6 氨基酸分析

杏鮑菇谷蛋白氨基酸組成成分見表3。

表3 杏鮑菇谷蛋白氨基酸組成成分Table 3 Amino acid composition list of Pleurotus eryngii glutenin

由表3可知，杏鮑菇谷蛋白中含人體所需的必需氨基酸有纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸，總含量為40.77%，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。杏鮑菇谷蛋白中酸性氨基酸的含量占總氨基酸含量的21.07%，分別為：天門冬氨酸、谷氨酸。堿性氨基酸含量占總氨基酸含量的13.75%，分別為：精氨酸、賴氨酸、組氨酸。在中性溶液中，酸性氨基酸帶負(fù)電，呈酸性，堿性氨基酸帶正電，呈堿性。由此可知，谷蛋白中性溶液呈酸性。支鏈氨基酸是理想的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑，它通過特殊的方式促進(jìn)代謝，其中谷蛋白支鏈氨基酸占總氨基酸組分的23.44%，是較好的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑。芳香族氨基酸能促進(jìn)多肽鏈中蛋白質(zhì)分子間的相互作用[13]，杏鮑菇清蛋白所測(cè)得的芳香氨基酸占總氨基酸組分的18.56%。

2.2 杏鮑菇谷蛋白功能特性研究

2.2.1 離子強(qiáng)度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響

離子強(qiáng)度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響見圖5。

圖5 離子強(qiáng)度對(duì)谷蛋白功能性質(zhì)的影響Fig.5 Effects of ionic strength on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由圖5中可見，隨著離子強(qiáng)度的增大，持水性呈下降趨勢(shì)；持油性、起泡性、起泡穩(wěn)定性及乳化性呈先降低后增加的趨勢(shì)，在離子強(qiáng)度為0.8 g/100 mL時(shí)持油性最差，在離子濃度為0.4 g/100 mL時(shí)起泡性、起泡穩(wěn)定性及乳化性最差；溶解性及乳化穩(wěn)定性呈先上升后下降的趨勢(shì)，離子強(qiáng)度為0.6 g/100 mL時(shí)溶解性和乳化穩(wěn)定性最好。

2.2.2 溫度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響

溫度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響見圖6。

圖6 溫度對(duì)谷蛋白功能性質(zhì)的影響Fig.6 Effects of temperture on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由圖6中可知，在測(cè)定溫度的范圍內(nèi)，除持油性外，溶解性、持水性、起泡性、起泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均先增大后減小，在40℃時(shí)起泡性和乳化穩(wěn)定性最好，在50℃時(shí)溶解度、持水性及乳化性最好，持油性呈先減小后增大的趨勢(shì)，在60℃時(shí)最差。

2.2.3 pH值對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響

pH值對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響見圖7。

圖7 pH值對(duì)谷蛋白功能性質(zhì)的影響Fig.7 Effects of pH on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

圖7可見，pH值在4.5時(shí)，杏鮑菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性均為最小值。在等電點(diǎn)兩側(cè)呈上升趨勢(shì)，可溶性蛋白才會(huì)有泡沫的形成。當(dāng)pH值大于或小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶液中的帶電離子電荷量不同，增加了其在水中的溶解度，同時(shí)提高了起泡性。當(dāng)pH值為4.5時(shí)，蛋白液中帶電荷離子相等，使得乳化能力處于最低水平。當(dāng)溶液的pH值不在等電點(diǎn)時(shí)，使得蛋白質(zhì)更容易溶于溶劑，增加了溶解度，這時(shí)更有利于蛋白質(zhì)分子參與乳化作用[14]。乳化作用的增強(qiáng)使得油與水之間更易形成帶有電荷的薄膜，這樣可以抑制蛋白質(zhì)形成顆?；驂K狀物質(zhì)，乳化性隨之提高[15]。泡沫穩(wěn)定性在等電點(diǎn)附近時(shí)升高，可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)缺乏靜電排斥作用，從而使得泡沫穩(wěn)定性得以升高[16-18]。

2.2.4 蔗糖濃度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響

蔗糖濃度對(duì)杏鮑菇谷蛋白功能性質(zhì)的影響見圖8。

圖8 蔗糖對(duì)谷蛋白功能性質(zhì)的影響Fig.8 Effects of sugar on the functional properties of Pleurotus eryngii glutenin

由圖8可見，隨著蔗糖濃度的增大，杏鮑菇谷蛋白的溶解性、持水性、持油性、起泡性和乳化性呈先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)蔗糖濃度為0.4%、0.6%、0.2%、0.6%、0.6%時(shí)分別達(dá)到最大值，起泡穩(wěn)定性和乳化穩(wěn)定性的變化趨勢(shì)則與之相反；在蔗糖濃度為0.6%時(shí)，穩(wěn)定性都最差。這可能是由于蔗糖濃度的增大導(dǎo)致溶液體系的粘稠度增加，此時(shí)減小了蛋白質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)，不易于蛋白質(zhì)在界面的展開[19]，因此在高速攪拌時(shí)減小了蛋白質(zhì)產(chǎn)生泡沫的能力，使蛋白質(zhì)的起泡性下降。

3 結(jié)論

杏鮑菇粉中的谷蛋白的等電點(diǎn)為4.3，其亞基分子量分布在小分子范圍內(nèi)，易于被人體吸收，在蛋白質(zhì)中巰基與二硫鍵可以通過氧化還原進(jìn)行互相轉(zhuǎn)化，總巰基、游離巰基、二硫鍵含量分別為67.06、28.90、14.35 μmol/g，二級(jí)結(jié)構(gòu)占比為 α-螺旋 31.41%、β-折疊55.15%、β-轉(zhuǎn)角13.45%，變性溫度為73.59℃，含有人體所必需的氨基酸，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。離子強(qiáng)度、溫度、pH值和蔗糖濃度對(duì)杏鮑菇谷蛋白的功能特性均有一定的影響。本研究結(jié)果可以為杏鮑菇谷蛋白在食品加工中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。