張源　翟江麗　李繁麟　郭平　閆昕

摘 要 以梨汁為還原劑和保護劑，還原氯金酸一步法合成納米金（AuNPs），采用透射電子顯微鏡（TEM）、掃描電子顯微鏡（SEM）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和紫外-可見吸收光譜（UV-Vis）對其進行了表征。 與以檸檬酸鈉為還原劑制備的AuNPs相比較，梨汁制備的AuNPs穩(wěn)定性更好。以梨汁綠色合成的AuNPs作為晶種和催化劑，維生素C（Vc）還原AgNO3產(chǎn)生的銀沉積在AuNPs表面，形成Ag/AuNPs，導致溶液顏色變化及在432 nm處吸光度變化，基于此實現(xiàn)Vc的定性與定量分析?？疾炝薃gNO3濃度、pH值和反應時間等因素對Vc檢測的影響。在最優(yōu)實驗條件下，當Vc濃度為0.8 mg/L時，裸眼觀察到溶液顏色明顯發(fā)生變化，隨著Vc濃度的增大，溶液顏色由紫紅色變?yōu)辄S褐色;溶液在432 nm處吸光度（A432）與Vc濃度在0.4～40 mg/L和40～80 mg/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關系，檢出限為0.17 mg/L（S/N=3），RSD為1.6% （n=8， CVc=8 mg/L），方法的選擇性和特異性良好。將此方法用于Vc片中Vc含量的分析，回收率在89.5%～110.0%之間。

關鍵詞 梨汁; 納米金; 維生素C; 比色分析

1 引 言

維生素C（Vc）即抗壞血酸，是人體必需的營養(yǎng)物質，在維持機體正常代謝方面具有重要作用[1]。缺乏Vc會引起缺鐵性貧血、動脈硬化、壞血病等; 而Vc攝入過量，尤其在兒童生長時期，易產(chǎn)生結石、骨骼疾病等，因此檢測Vc含量至關重要[2]。目前，檢測Vc的方法主要有原子吸收法[3]、電化學分析法[4～6]、色譜法[7]和熒光分析法[8]等。這些檢測方法準確度高，靈敏度好，但仍存在一些不足，如需要昂貴的儀器、抗干擾差、前處理操作繁瑣等。因此，開發(fā)成本低廉、抗干擾能力強、簡單、快速檢測Vc的方法十分重要。

近年來，基于納米材料的比色分析法[9～11]成為研究熱點。通過觀察溶液顏色變化實現(xiàn)分析物的定性及半定量分析，結合紫外-可見吸收光譜的檢測實現(xiàn)分析物的定量分析，方法快速，成本低廉且實用性強。金納米粒子（AuNPs）因具有大的摩爾吸光系數(shù)、獨特的光學性質而被用于金屬離子[12～14]、蛋白質[15～17]和核酸[18～20]等的比色分析。

制備性能良好的AuNPs用于比色分析尤為重要。目前， AuNPs的合成主要采用化學還原法，以檸檬酸鈉[21]、NaBH[22]和Vc[23]等為還原劑，但是這些試劑的使用可能對環(huán)境及人體產(chǎn)生潛在的危害，且制備的AuNPs耐鹽能力有限，用于比色分析抗干擾能力較差，限制了在實際分析中的應用，需要進一步修飾從而改善其穩(wěn)定性。字琴江等[24]以谷胱甘肽（GSH）為配體，以NaBH為還原劑，室溫反應4 h，制備了GSH-AuNPs，并將其用于Vc的可視化檢測，檢出限低至0.75 μmol/L，抗干擾能力強。但是AuNPs需要進行修飾以增強其穩(wěn)定性，制備過程耗時較長，制備后需超濾除去過量的GSH。天然植物中含有豐富的蛋白質、脂肪、有機酸等，可作為合成AuNPs的還原劑和保護劑，如茶葉[25]、香蕉皮[26]、甜葉菊[27]、荷葉[28]等，合成方法安全無毒，制備的AuNPs穩(wěn)定性更好，抗干擾能力更強。目前，關于綠色合成的AuNPs用于Vc比色分析的研究還未見報道。

梨汁中富含蛋白質和多酚類化合物等成分，可作為還原劑和保護劑合成AuNPs。本研究以梨汁為原料合成AuNPs，方法簡單快速，成本低，綠色環(huán)保。以此AuNPs為催化劑和晶種，利用Vc還原AgNO3生成的Ag單質，并沉積在AuNPs上，形成Ag/AuNPs。隨著Vc含量的增加，沉積在AuNPs表面Ag越來越多，溶液顏色發(fā)生變化，結合紫外-可見吸收光譜儀檢測，可實現(xiàn)Vc的定性與定量分析。實驗原理見圖1。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2600紫外-可見光譜儀、CT15RT冷凍離心機（上海天美科學儀器有限公司）; JYL-CO51料理機（山東九陽股份有限公司）;? S-4800型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）; TENSOR-37傅里葉紅外光譜儀（德國布魯克科學儀器公司）; ZS90型動態(tài)光散射粒度分析儀（英國馬爾文儀器公司）; JEM-2010FEF-JEOL型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

三水合四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、AgNO3（上海國藥試劑公司）; 蔗糖、葡萄糖、賴氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸（上海阿拉丁生化股份有限公司）; 其余試劑均為分析純; 實驗用水均為超純水?；使诶尜徸援?shù)厥袌觥?/p>

2.2 梨汁綠色合成AuNPs

皇冠梨去皮切塊，經(jīng)料理機榨汁處理2 min，將汁液進行減壓抽濾，濾液以9000 r/min離心5 min，過0.45 μm濾膜。梨汁易被空氣氧化[29]，因此于-20℃保存，用前解凍。取100 μL梨汁和25 μL 0.01% HAuCl4溶液混合，加水至2.5 mL，70℃下加熱30 min，即制得AuNPs。

2.3 檸檬酸鈉為還原劑合成AuNPs

參考文獻[30]方法，以檸檬酸鈉為還原劑合成AuNPs。50 mL 0.01% （w/V）HAuCl4加熱至沸騰后，快速加入1.5 mL 1% （w/V）檸檬酸鈉，攪拌加熱10 min，冷卻至室溫，即制得AuNPs，其最大吸收波長為532 nm。

2.4 AuNPs比色檢測Vc

于10 mL比色管中依次加入300 μL AuNPs、1450 μL水、500 μL 0.1 mol/L甘氨酸-NaOH緩沖溶液（pH=8.8）、500 μL 0.01 mol/L AgNO3和500 μL 40 mg/L Vc溶液，室溫反應30 min，測定紫外-可見吸收光譜。

2.5 AuNPs比色檢測Vc的特異性

為了考察AuNPs比色檢測Vc方法的特異性，分別用400 mg/L的甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、硫酸鎂、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、碳酸鉀、天冬氨酸、蔗糖、混合溶液1（含上述10種干擾物質）、混合溶液2（含上述10種干擾物質和Vc）代替Vc，按照2.4節(jié)的方法進行檢測，測定紫外-可見吸收光譜，其中Vc濃度為40 mg/L。

2.6 實際樣品分析

于當?shù)厮幍曩徺I兩種不同廠家生產(chǎn)的Vc藥片（劑量均為100 mg/片），將藥片研磨，配制成Vc理論濃度為5 mg/L的樣品溶液，按照2.4節(jié)所述方法進行檢測，并進行加標實驗，計算加標回收率。

3 結果與討論

3.1 AuNPs的合成

梨汁為淡黃色（圖2A插圖），以其制備的AuNPs溶液為紫紅色，由紫外-可見吸收光譜圖可知，梨汁吸收峰位于220 nm和277 nm （多酚類化合物）[31]，制備的AuNPs的紫外-可見吸收光譜中，220 nm和277 nm 處吸收峰均消失，536 nm處出現(xiàn)吸收峰，為AuNPs獨有的表面等離子體共振（SPR）特征。由紅外（IR）譜圖（圖2B）可見，在梨汁樣品中，3371 cm1是多酚類化合物的O-H伸縮振動和蛋白質的NH伸縮振動; 2935 cm1是飽和CH伸縮振動; 2100 cm1是蛋白質中CN的伸縮振動; 1629 cm1是多酚類化合物CC和CO伸縮振動; 1403 cm1是飽和CH變形振動; 1250 cm1是多酚類化合物、酰胺CO伸縮振動; 1079 cm1是OH面內(nèi)變形振動; 870和779 cm1是芳環(huán)上CH面外彎曲振動; 621 cm1是OH面外彎曲振動，表明制備的梨汁中含有蛋白質和多酚類化合物。制備的AuNPs中，3371 cm1移至3412 cm1，且吸收峰減弱，1629和1079 cm1處吸收峰變?nèi)酰?100、1250和621 cm1處吸收峰消失。對比梨汁制備AuNPs反應前后IR譜圖可知，梨汁中起還原作用的主要是多酚類化合物，這與UV-Vis檢測結果一致。Sanchez等[32]測得6種不同品種的梨肉中多酚類化合物的含量在28～81 μg/g范圍內(nèi)。文獻[33]表明，沒食子酸為天然多酚類化合物，可還原HAuCl4制備AuNPs，但需加熱至50℃反應6 h，而梨汁可在室溫下快速制備AuNPs，表明在梨汁制備過程中除多酚類化合物起還原作用外，蛋白質也發(fā)揮了還原作用。AuNPs的IR譜圖中， 3412、3135、1629、1400和1109 cm1處的吸收峰分別對應OH伸縮振動、飽和CH伸縮振動、CO和CC伸縮振動、飽和CH變形振動和COC反對稱伸縮振動，表明納米粒子表面有保護基團，有利于AuNPs的分散性和穩(wěn)定性。

由SEM圖（圖2C）可見，制備的AuNPs為球形，分散良好; TEM表征結果（圖2D）表明，AuNPs平均

3.2 AuNPs合成條件的優(yōu)化

梨汁合成AuNPs受多種因素影響，如梨汁用量、NaOH用量、反應溫度和反應時間等。對AuNPs的合成條件進行了考察。如圖3A所示，隨梨汁用量增加，536 nm處的吸收值（A536）先增大后減小，當梨汁用量為80 μL時，A536達最大，表明此條件下AuNPs產(chǎn)量最大。堿性條件對晶核的形成具有重要影響[34，35]，因此，考察了NaOH用量對合成AuNPs的影響，由圖3B可知，不加NaOH即可合成AuNPs，隨著NaOH用量增加，AuNPs由紫紅色變?yōu)榉奂t色，考慮到操作方便，后續(xù)實驗選擇不加堿。從圖3C可知，50℃時開始有AuNPs生成，100℃時A536最大，故后續(xù)實驗溫度選擇100℃。隨著反應時間的延長，A536逐漸增加（圖，25 min時達最大，選擇合成反應時間為30 min。

3.3 梨汁合成的AuNPs的穩(wěn)定性

考察了溫度、離子強度和pH值對AuNPs穩(wěn)定性的影響，與檸檬酸鈉合成的AuNPs相比，在所制得的AuNPs的濃度和粒徑保持一致的條件下，梨汁合成的AuNPs穩(wěn)定性有所提高。圖4A比較了兩種AuNPs的熱穩(wěn)定性，在20、37、50、70和100℃下，AuNPs的A536均保持不變，說明兩種方法制備的AuNPs具有良好的穩(wěn)定性。如圖4B所示，當NaCl濃度低于0.3 mol/L時，梨汁制備的AuNPs的A536基本不變，而檸檬酸鈉合成的AuNPs的A536明顯下降，說明AuNPs發(fā)生了團聚。圖4C比較了在pH 3～12范圍內(nèi)AuNPs的穩(wěn)定性，梨汁制備的AuNPs的A536沒有發(fā)生變化，在pH<5和pH>10時，檸檬酸鈉合成的AuNPs的A536明顯下降，表明AuNPs發(fā)生了團聚。因此梨汁合成的AuNPs穩(wěn)定性更佳，這可能與梨汁中多成分充當保護劑有關。

3.4 Vc的檢測

AuNPs 比色檢測Vc的原理是Vc還原AgNO3產(chǎn)生Ag， 并沉積在AuNPs表面，形成Ag/AuNPs，隨著Vc濃度增大，沉積在AuNPs表面的銀增多，裸露的AuNPs減少，金信號越來越弱，銀信號越來越強，根據(jù)溶液顏色變化以及A432，實現(xiàn)Vc的定性和定量分析。采用UV-Vis、SEM、TEM和DLS表征驗證，如圖5A所示，與對照組相比（純水取代Vc），加入Vc后溶液顏色發(fā)生變化，最大吸收波長由536 nm藍移至432 nm; 隨著Vc的濃度由10 mg/L增大至40 mg/L，溶液顏色加深，最大吸收波長發(fā)生紅移，而且吸光度增大。SEM結果（圖5B）表明， Ag/AuNPs粒徑比AuNPs粒徑明顯增大; TEM結果（圖5C）表明，Ag/AuNPs平均粒徑約為56.9 nm; DLS結果表明，與制備的AuNPs相比，Ag/AuNPs粒子的水合粒徑變大，粒徑分布范圍變寬。這些結果均表明， AuNPs比色檢測Vc方法是可行的。

3.5 檢測條件的優(yōu)化

考察了AgNO3濃度、pH值和反應時間等因素對Vc檢測的影響，結果如圖6所示。AgNO3作為反應物，其濃度增加會使反應速度加快。AgNO3終濃度在0.30～2.15 mmol/L范圍內(nèi)（圖6A），隨濃度增加，A432逐漸增大，當超過1.54 mmol/L時，A432稍有下降。選擇AgNO3終濃度為1.54 mmol/L。溶液pH值的影響見圖6B，當pH=8.8時，A432最大。當反應6 min時，A432最大，此后趨于平衡（圖6C）。因此后續(xù)實驗選擇AgNO3濃度為1.54 mmol/L，甘氨酸-NaOH緩沖溶液pH=8.8，反應時間為10 min。

3.6 方法的特異性

選取干擾物質甘氨酸、谷氨酸、賴氨酸、硫酸鎂、檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、碳酸鉀、天冬氨酸、蔗糖、混合溶液1（含10種干擾物質）、混合溶液2（含10種干擾物質和Vc）進行實驗，其中干擾物質濃度均為Vc濃度的10倍，結果如圖7所示，只有加入Vc和混合溶液2時，溶液顏色發(fā)生變化，并能產(chǎn)生明顯的A432信號。因此，本方法檢測Vc具有較好的特異性。

3.7 方法的分析性能

在最優(yōu)的實驗條件下，考察了方法的分析性能。由圖8A插圖可知，Vc濃度為0.8 mg/L時，裸眼觀察溶液顏色發(fā)生明顯變化，隨Vc濃度增大，溶液顏色由紫紅色變?yōu)辄S褐色，根據(jù)顏色變化可實現(xiàn)Vc可視化半定量檢測。

由圖8A可知，隨著Vc濃度增大，A432增大。如圖8B所示，Vc濃度在0.4～40 mg/L和40～80 mg/L范圍內(nèi)，A432和Vc濃度呈良好的線性關系，線性方程分別為y=0.0124x+0.0695（R2=0.9918）和y=0.0285x-0.5544（R2=0.9939）。方法的相對標準偏差RSD為1.6% （n=8，CVc=8 mg/L），檢出限（LOD）為0.17 mg/L。與其它方法相比（表1），本方法線性范圍寬，檢出限低; 與NaBH4還原制備GSH-AuNPs比色檢測Vc方法相比，檢出限相當，但本方法制備AuNPs的時間短，無需修飾，綠色環(huán)保。

3.8 實際樣品中Vc的分析

采用本方法測定了Vc藥片中Vc的含量，加標回收率（表2）在89.5%～110.0%之間，表明本方法可用于實際樣品分析。

4 結 論

本研究以梨汁為還原劑和保護劑合成了AuNPs，方法快速簡便，綠色環(huán)保，與傳統(tǒng)方法制備的AuNPs相比，本方法制備的AuNPs具有更好的穩(wěn)定性。將制備的AuNPs用于Vc的檢測，裸眼比色實現(xiàn)了Vc的定性分析，結合紫外-可見吸收光譜檢測實現(xiàn)了Vc的定量分析。本方法特異性和選擇性良好，可用于藥品中Vc的檢測，具有較好的應用前景。

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Green Synthesis of Gold Nanoparticles and Their

Application in Colorimetric Detection of Vitamin C

ZHANG Yuan*， ZHAI Jiang-Li， LI Fan-Lin， GUO Ping， YAN Xin

（Tangshan Normal University， Tangshan Key Laboratory of Green Specialty Chemicals， Tangshan 063000， China）

Abstract Gold nanoparticles （AuNPs） were prepared by reducing HAuCl4 with pear juice as reducing and protecting agent， which was rapid and environmentally friendly. AuNPs were characterized by scanning electron microscopy （SEM）， Fourier Transform Infra-Red （FT-IR） and ultraviolet-visible （UV-Vis） spectroscopy. Compared with AuNPs prepared using citrate sodium as reducing agent， AuNPs synthesized by pear juice were more stable. AuNPs were used for colorimetric detection of vitamin C. When this as-prepared AuNPs mixed with AgNO3 and vitamin C， AgNO3 was reduced to Ag by vitamin C and deposited on the surface of AuNPs to form Ag/AuNPs， which was accompanied by a color change， as well as the increase of the Ag/AuNPs peak absorbance at 432 nm monitored by UV-Vis detection. Vitamin C could be analyzed qualitatively by the naked eyes according to the color change and quantitatively by UV-Vis detection. The main factors influencing detection of vitamin C were investigated in detail， including the volume of AgNO3， the pH value and the incubate time. When the concentration of vitamin C was 0.8 mg/L， the solution could be observed from red to brown with naked eyes. The linear range of vitamin C was from 0.4 mg/L to 40 mg/L and from 40 mg/L to 80 mg/L， the relative standard deviation （R was 1.6% （n=8， CVc=8 mg/L） and the limit of detection （LOD） was 0.17 mg/L. This method had good selectivity and specificity and was applied to detect vitamin C in vitamin C tablets with recoveries ranging from 89.5% to 110.0%.

Keywords Pear juice; Gold nanoparticles; Vitamin C; Colorimetric detection

（Received 21 January 2020; accepted 29 April 2020）

This work was supported by the Science Foundation of Tangshan Normal University （Nos. 2017A02， 2017C05）.

2020-01-21收稿; 2020-04-29接受

本文系唐山師范學院科學研究基金項目（Nos. 2017A02， 2017C05）資助

* E-mail： 26769209@163.com