劉佩珊,牟 燕,馬安德,周枝鳳

(南方醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生檢驗檢疫學系,廣東 廣州 510515)

脂肪酸是脂質的重要組成部分,是維持人體生長發(fā)育和健康所必需的物質。血漿中的游離脂肪酸(FFAs)組成是膳食脂肪酸的攝入及內(nèi)源性脂肪酸代謝的反映,FFAs種類多達40余種[1]。血漿中FFAs代謝失衡會引起心血管疾病、腫瘤、免疫和代謝性疾病等多種疾病[2]。妊娠期婦女血漿中FFAs代謝異常,不僅影響母體健康,還會影響胚胎發(fā)育,導致胎兒生長發(fā)育遲緩和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常[3]。因此,為更好地反映人體FFAs代謝狀況,建立一種高效、靈敏、較全面測定血漿中FFAs含量的分析方法尤為重要。

氣相色譜法(GC)和氣相色譜-質譜法(GC-MS)是目前測定FFAs最常用的方法[4],這兩種方法測定血漿中FFAs含量的樣品前處理通常包括兩個步驟：血漿中的FFAs經(jīng)有機溶劑提取后,在衍生化試劑的作用下與甲醇發(fā)生酯化反應,生成對應的脂肪酸甲酯(FAMEs)[5]。脂肪酸提取的常用溶液體系有氯仿-甲醇和甲基叔丁基醚-甲醇溶液。常用衍生化方法有酸催化和堿催化,其中酸催化常以硫酸、鹽酸、乙酰氯和三氟化硼為衍生化試劑[6],但鹽酸催化反應時間長,易引入副產(chǎn)物,不適合大樣本量檢測[7]；而三氟化硼毒性強、保質期短,易與氧氣反應[8]。堿催化法主要用于動物油脂的衍生化,不適用于游離脂肪酸的甲酯化[9]。為節(jié)省時間和減少試劑耗材的使用量,有報道提出了直接衍生化樣品的“一步”反應法,但其回收率低于“兩步”反應[10]。目前,大部分分析方法所檢測的FFAs種類較少,僅4～20余種[6-7,11-12]。本研究比較了不同脂肪酸提取方法及衍生化方法對血漿中FFAs測定的影響,優(yōu)化了衍生化反應條件,并結合氣相色譜-質譜將其用于孕婦血漿樣本中FFAs的檢測,可獲得較全面、準確可靠的FFAs信息。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

QP 2010 Plus氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(日本島津公司),配AOC-20i+s自動進樣器。包含31種脂肪酸甲酯在內(nèi)的37種脂肪酸甲酯混合標準溶液(1 mL,不同濃度溶于二氯甲烷,美國Supelco公司)；十九烷酸甲酯(C19>∶ 0,IS)、十三烷酸(C13>∶ 0)、二十三烷酸(C23>∶ 0)(100 mg,純度>99%,上海安譜實驗科技股份有限公司)；甲醇(色譜純,美國Merck公司)；正己烷、甲基叔丁基醚(MTBE)、乙酰氯和甲醇鈉(色譜純,德國CNW公司)；三氟化硼-甲醇溶液(14%三氟化硼溶于甲醇,上海麥克林生化科技有限公司)；鹽酸、硫酸、甲苯、氯仿、無水碳酸鉀和氯化鈉均為分析純(廣州化學試劑廠)；實驗用水由Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)制備。

1.2 標準溶液及質控樣品的配制

取37種脂肪酸甲酯混合標準溶液,用二氯甲烷>∶ 正己烷(體積比1>∶2)稀釋2、3、3.33、6.66、40、100、500、2 000倍,配制校準曲線用系列標準溶液。分別稱取適量C13>∶ 0和C23>∶ 0標準品,用正己烷>∶甲醇(體積比1 >∶4)溶解并稀釋制得1.6、100、640 μg/mL的質控標準溶液,用于計算回收率、精密度和準確度。稱取適量C19>∶ 0標準品,用二氯甲烷>∶ 正己烷(體積比1>∶2)溶解配成25 μg/mL的內(nèi)標(IS)標準溶液。血漿質控樣品：取50 μL血漿于離心管中,加入10 μL 100 μg/mL質控標準溶液,渦旋1 min,用于計算方法回收率、精密度和準確度。

1.3 FFAs提取

提取方法①[13]：向血漿質控樣品中加入750 μL氯仿>∶ 甲醇(體積比1>∶ 2)、250 μL氯仿和250 μL水,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min；轉移有機層至反應瓶,向水層中加入250 μL氯仿，重復提取一次，合并兩次提取液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物A。

提取方法②[14]：向血漿質控樣品中加入750 μL氯仿>∶ 甲醇(體積比2>∶1)和200 μL水,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min。轉移有機層至反應瓶,向水層中加入500 μL氯仿>∶ 甲醇>∶ 水(體積比86>∶14∶1)重復提取一次，合并兩次提取液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物B。

提取方法③[15]：向血漿質控樣品中加入300 μL甲醇、600 μL MTBE和300 μL 0.15 mmol/L醋酸銨,渦旋1.5 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min。轉移有機層至反應瓶,向水層中加入300 μL MTBE重復提取一次，合并兩次提取的有機層溶液,氮氣吹干,得干燥脂肪酸提取物C。

1.4 FFAs衍生化

乙酰氯法[6]：向提取物A中加入200 μL乙酰氯和2 mL甲醇>∶ 正己烷(體積比4>∶1)溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入5 mL 6%碳酸鉀溶液和2 mL正己烷,混勻后轉入離心管,渦旋1 min,于4 ℃下以13 000 r/min離心5 min,取有機層,氮氣吹干,加入20 μL IS溶液和80 μL正己烷復溶,待測。

硫酸法[16]：向提取物A中加入1 mL 2.5%硫酸-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入3 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

鹽酸法[7]：向提取物A中加入1 mL 3 mol/L鹽酸-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

三氟化硼法[6]：向提取物A中加入100 μL甲苯和500 μL 14%三氟化硼-甲醇溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入2 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

甲醇鈉法[6]：向提取物A中加入1.25 mL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液,密封混勻后于90 ℃反應1 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入1.25 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液,密封,混勻后于90 ℃反應0.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,再加入6 mL 0.9%氯化鈉溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

直接衍生化法[17]：向干凈反應瓶中加入200 μL乙酰氯、50 μL血漿質控樣品和2 mL甲醇>∶ 正己烷(體積比4>∶1)溶液,密封混勻后于90 ℃反應1.5 h。待反應瓶冷卻至室溫后,加入5 mL 6%碳酸鉀溶液和2 mL正己烷,其余步驟同乙酰氯法。

1.5 GC-MS分析條件

色譜條件：SP-2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm,美國Supelco公司)；升溫程序：起始溫度100 ℃,保持5 min,以4 ℃/min升至240 ℃,保持30 min。進樣口溫度：230 ℃；分流比10>∶1；載氣：氦氣(純度>99.999%)，流量：1.0 mL/min；進樣量：1.0 μL。

質譜條件：EI離子源；離子源溫度250 ℃；接口溫度為230 ℃。溶劑延遲4 min；全掃描(SCAN)模式；質譜掃描范圍：m/z33～450。

圖1 31種 FAMEs和IS標準品的總離子流色譜圖(TIC)Fig.1 Total ion chromatogram of 31 FAMEs and IS standardsthe peak number 1-31 were the same as those in Table 1

圖2 不同衍生化方法對不同F(xiàn)FAs類型含量的影響(n=3)Fig.2 Effects of derivatization methods on the levels of different types of FFAs(n=3)

2 結果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

采用分流和不分流進樣對31種FAMEs進行分析,結果顯示:不分流進樣時,溶劑峰嚴重拖尾,無法與C4>∶ 0峰分離,且碳數(shù)為12以下的目標物色譜峰嚴重展寬,影響定量。經(jīng)優(yōu)化,確定最佳分流比為10>∶1。在此分析條件下31種FAMEs和十九烷酸甲酯(IS)的色譜圖見圖1。由圖可見,31種FAMEs均能被有效分離和檢測,總分析時間為60 min。

2.2 FFAs提取方法的選擇

實驗采用乙酰氯衍生化法考察了3種經(jīng)典的脂肪酸提取方法對同一血漿樣品中FFAs種類、提取含量及回收率的影響。結果顯示,提取方法①和②均能提取出31種FFAs,而方法③提取了30種FFAs,無法有效提取C18>∶ 2n6t。進一步比較發(fā)現(xiàn),方法①提取的飽和脂肪酸(SFAs)、單不飽和脂肪酸(MUFAs)、多不飽和脂肪酸(PUFAs)和總FFAs(Total FFAs)含量和加標回收率均為最高。因此,本文以方法①提取富集血漿中的FFAs。

2.3 FFAs衍生化方法的選擇

在確定提取方法的條件下,實驗用氯仿>∶甲醇(體積比1>∶2)提取質控樣品中FFAs后,比較了“1.4”所述5種衍生化法對分析結果的影響(圖2)。結果顯示,5種衍生化方法均可獲得31種脂肪酸甲酯,且以乙酰氯法獲得FFAs組含量和加標回收率為最高。進一步比較了“兩步”反應和“一步”反應的衍生化效果,發(fā)現(xiàn)兩者均能獲得滿意的加標回收率(>90%),但“兩步”反應所得各FFAs組含量顯著高于“一步”反應。表明“兩步”反應雖然消耗更多的時間和試劑,但能更準確地定量血漿樣品中的FFAs組成,這與Amusquivar等[10]研究結果一致，因此本實驗采用“兩步”反應進行衍生化。

2.4 FFAs衍生化反應溫度與時間的優(yōu)化

為獲得最優(yōu)的衍生化溫度和時間,以C13>∶ 0和C23>∶ 0為研究目標,考察了不同反應溫度(40、60、80、90、100 ℃)和時間(0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 h)FFAs甲酯化的影響。結果顯示,C13>∶ 0和C23>∶ 0的衍生化效率隨著反應溫度的升高而逐漸增大,在90 ℃達到最大值,此后升高溫度衍生化效率反而降低；且C23>∶ 0的反應溫度～衍生化效率曲線比C13>∶ 0更陡峭,表明反應溫度對超長鏈FFAs衍生化效率的影響更大。隨著反應時間的延長,乙酰氯對C13>∶ 0和C23>∶ 0的衍生化效率逐漸增大,并在1.5 h達到最大值,繼續(xù)延長時間衍生化效率反而逐漸降低。因此,確定乙酰氯衍生化脂肪酸的最佳溫度和時間分別為90 ℃和1.5 h。這與Amusquivar等[10]用乙酰氯在80 ℃下衍生化2.5 h及Liu等[7]用鹽酸-甲醇法在45 ℃下衍生化14 h的方法相比,本研究反應時間更短,更利于大樣本量的檢測。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍、檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)在優(yōu)化條件下,對“1.2”配制的31種FAME混合標準溶液進行測定,以FAME和IS的峰面積之比為縱坐標(Y),對應質量濃度比(X)為橫坐標繪制標準曲線。結果顯示,31種FAMEs在其各自的濃度范圍內(nèi)線性良好,相關系數(shù)(r)不低于0.999 0。以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)分別計算得LOD和LOQ分別為0.010～0.050 μg/mL和0.034～0.167 μg/mL。LOD顯著低于林暉等[16]報道的方法,LOQ低于Giera[18]報道的方法，且所用樣本量(50 μL)比文獻報道[10,16-17](100～200 μL)更少。31種FAMEs的保留時間、線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r)、LOD和LOQ等結果見表1。

表1 31種FAMEs的保留時間、線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r)、LODs及LOQsTable 1 Retention times,linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of 31 FAMEs

(續(xù)表1)

2.5.2 回收率及相對標準偏差以C13>∶ 0和C23>∶ 0為研究目標物質,配制低、中、高(0.16、10、64 μg/mL)3個濃度水平的血漿質控樣品,每個濃度水平平行實驗6次,考察方法的回收率及相對標準偏差(RSD),并連續(xù)測定3 d,計算日內(nèi)及日間RSD。結果表明,C13>∶ 0和C23>∶ 0的回收率為86.3%～115%,RSD(n=6)不大于9.6%,日內(nèi)RSD(n=6)不大于6.3%,日間RSD(n=3)不大于7.8%,表明該方法準確可靠,精密度良好，均符合2018版FDA生物樣品分析方法驗證指南中對回收率、精密度和準確度的要求[19]。

2.6 實際樣品檢測

取49份健康孕婦血漿樣本在優(yōu)化條件下測定FFAs含量,結果顯示,與國內(nèi)外報道相比,本方法可從健康孕婦血漿中檢出更多種類的FFAs(21～31種),最多可檢出31種,其中C11>∶ 0、C17>∶ 1、C21>∶ 0、C22>∶ 0、C22>∶ 1n9和C22>∶ 2在已報道的健康孕婦血漿中未被檢出[20-21]。檢出31種FAMEs的樣品總離子流色譜圖見圖3。孕婦血漿中C16>∶ 0濃度占總濃度比例最大,其次為C18>∶ 2n6c、C18>∶ 1n9c和C18>∶ 0,其余的FFAs占總濃度比例均小于10%(見圖4)。此外,C16>∶ 0(棕櫚酸)和C18>∶ 0(硬脂酸)為動物油中最常見的飽和脂肪酸,C18>∶ 1n9c(油酸)和C18>∶ 2n6c(亞油酸)為植物油中最常見的不飽和脂肪酸,這4種脂肪酸在被檢血漿的FFAs中的構成比例較大,與人體膳食脂肪酸攝入的主要來源是動植物油有關,與Oliveira等[20]報道的結果相近。C18>∶ 3n3(α-亞麻酸)、C20>∶ 5(EPA)、C20>∶ 4n6(花生四烯酸)和C22>∶ 6(DHA)4種具有重要生理功能的多不飽和脂肪酸的含量與國內(nèi)報道的正常孕產(chǎn)婦臍血中多不飽和脂肪酸含量接近[21]。

圖3 孕婦血漿中31種脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖(TIC)Fig.3 Total ion chromatogram of 31 fatty acid methyl ester in pregnant woman's plasmathe number 1-31 were the same as those in Table 1

3 結 論

本文通過比較不同提取方法和衍生化方法對血漿中FFAs定性定量的影響,確定了以氯仿>∶ 甲醇(體積比1>∶2)提取血漿中的FFAs,乙酰氯法衍生化,建立了血漿中FFAs含量的氣相色譜-質譜測定方法。方法可用于血漿中31種FFAs的準確定性和定量,具有靈敏、穩(wěn)定、可靠、所需樣本量少以及可獲得血漿中更多FFAs信息等優(yōu)點。將該方法應用于測定孕婦血漿中的FFAs組成和含量,從而獲得較全面、準確可靠的FFAs代謝譜信息。研究結果既可反映孕婦膳食結構,又能反映其代謝情況,可為下一步制訂和調整孕期膳食營養(yǎng)提供科學依據(jù)。