呂 瀟，陳思宏，梁 芳，黃艷紅，尹善儀，汪 靜，譚德慧

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222)

舒肝顆粒(廣西方)收載于廣西藥品標(biāo)準(zhǔn)(一九八四年版)，原名為舒肝沖劑，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為桂Q/WS-1-380-84，由茵陳、蒲公英、白茅根等9味藥材組成，具有疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾之功效，用于治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎[1]，對(duì)慢性肝炎、遷延性肝炎亦有一定療效。方中茵陳、蒲公英、白茅根均具有保肝作用[2-5]，所含的有效成分綠原酸是方中酚酸類化合物的代表成分，對(duì)肝損害起保護(hù)作用[6]，還具有抗菌、抗癌、保護(hù)心血管系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞保護(hù)和保肝等藥理作用[7-8]，故本研究以綠原酸含量與浸膏得率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選舒肝顆粒(廣西方)的水提工藝，為后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)的制劑生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Agilent1200色譜工作站，美國(guó)安捷倫科技有限公司；XS105DU電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；比朗超聲波清洗機(jī)，上海比朗儀器有限公司。

1.2 對(duì)照品與試劑

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201817，供含量測(cè)定用，含量以96.8%計(jì))購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為Fisher公司的色譜純，液相用水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥 材

夏枯草(批號(hào)：18102001)、茵陳(批號(hào)：18022701)、蒲公英(批號(hào)：18082202)、甘草(批號(hào)：18102801)、蒼術(shù)(批號(hào)：18092504)、北柴胡(批號(hào)：18102202)、虎杖(批號(hào)：18051501)均購(gòu)自廣西寶正藥業(yè)有限公司，馬蘭草、白茅根購(gòu)自廣西玉林藥市，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏副教授鑒定，馬蘭草為菊科植物馬蘭頭Kalimeris indica(L.)的干燥全草，白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrical Beauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(10∶90)，檢測(cè)波長(zhǎng)為327 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液與對(duì)照品溶液HPLC色譜圖中相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間一致，各相鄰峰間分離度均大于1.5，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不低于5000。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 供試品溶液的制備

按照處方量的1/10比例稱取藥材45 g，加入18倍量水，浸泡40 min后，煎煮兩次，每次1.3 h，濾過，合并濾液，濾液濃縮至250 mL。精密量取濃縮液25 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對(duì)照品5.10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.1.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。以對(duì)照品濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸回歸方程為：Y=16.857X-3.44，(r=0.9999)。結(jié)果表明綠原酸在10.2～61.2 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.1.4”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液5#，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果綠原酸峰面積平均值為868.1，RSD=0.16%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下的供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積，結(jié)果峰面積平均值為813.8，RSD=0.73%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液中綠原酸含量平均值為0.5357 mg/g，RSD=1.42%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品溶液6份，分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(1.4540 mg/mL)0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算平均回收率和RSD，結(jié)果均符合要求，詳見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 浸泡時(shí)間考察

按照處方量的1/10比例稱取藥材45 g，加入18倍量水，分別浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，濾出水分，稱定藥材吸水后重量，計(jì)算藥材吸水率。計(jì)算公式為：

藥材吸水率=(藥材吸水后重量-取樣量)/取樣量×100%

結(jié)果顯示，藥材在40 min前吸水率呈上升趨勢(shì)，40 min后吸水率改變不大，說明藥材在浸泡40 min后吸水基本達(dá)到飽和，故浸泡時(shí)間定為40 min。

2.3 浸膏得率的測(cè)定

精密量取水提濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，計(jì)算浸膏得率。計(jì)算公式為：

浸膏得率=干膏重量×10/藥材重量×100%

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水提工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件，選擇Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以加水倍數(shù)(A，倍)、提取時(shí)間(B，h)、提取次數(shù)(C，次)為考察因素，以綜合評(píng)分(R)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面法試驗(yàn)，Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 模型擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，以綜合評(píng)分(R)為響應(yīng)值對(duì)加水量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得回歸方程為：

Y=-1078.58275+114.53800A+88.10150B+90.80425C+1.15500AB-1.45500AC-4.18500BC-3.17081A2-37.38300B2-14.08075C2。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知， B、A2、B2、C2均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)=40.29，模型項(xiàng)P<0.0001，模型高度顯著，失擬項(xiàng)F=4.78，P=0.0823，表明模型失擬項(xiàng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型擬合度高，實(shí)驗(yàn)誤差小。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9811，證明該模型擬合度很好，可用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定。

2.4.3 響應(yīng)面分析

圖2 各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖

根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，結(jié)果見圖2。通過響應(yīng)面曲線的變化情況及等高線的稀疏程度可直觀反映各因素對(duì)總含量的影響，響應(yīng)曲面較陡說明因素間的交互作用顯著，等高線的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。由圖2所知，各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響交互項(xiàng)強(qiáng)弱順序?yàn)椋篈C>BC>AB。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert8.0.6軟件預(yù)測(cè)最佳水提工藝參數(shù)：加水量17.82倍，提取時(shí)間1.3 h，提取次數(shù)2.11次。考慮到實(shí)施工藝參數(shù)的實(shí)際可操作性，將最佳水提工藝條件修正為：加水量18倍，提取時(shí)間1.3 h，提取次數(shù)2次。為檢驗(yàn)修正后工藝參數(shù)的合理性，在此條件下平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表4，測(cè)得綜合評(píng)分平均值為99.33%(RSD=0.48%，n=3)，與模型預(yù)測(cè)值96.46%的相對(duì)平均偏差為1.47%，表明該水提工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時(shí)也說明建立的回歸模型合理。

3 結(jié) 論

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法是在科學(xué)研究中經(jīng)常用到的一種實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化方法，適用于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題，它彌補(bǔ)了正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)等線性模型精密度低的不足，能更好的揭示自變量和非自變量之間的關(guān)系。響應(yīng)面法相對(duì)于正交試驗(yàn)法，可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，所得結(jié)果更加合理、可靠，還可以預(yù)測(cè)未知成分，適用于多種因素存在是產(chǎn)生共同影響的試驗(yàn)，從而選出最佳條件和方案[9]。本研究采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒(廣西方)的水提工藝，通過Design-Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到最佳水提工藝：加水量18倍，提取時(shí)間1.3 h，提取次數(shù)2次。經(jīng)驗(yàn)證，測(cè)得綜合評(píng)分平均值為99.33%(RSD=0.48%，n=3)，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)平均偏差為1.47%，表明該水提工藝條件穩(wěn)定、簡(jiǎn)便易行，結(jié)果可靠，可用于后續(xù)舒肝顆粒(廣西方)制劑生產(chǎn)的水提工藝提取。