郭艷峰 周 濤 戴巧英 潘樂坤 劉吉祥

(河北省邯鄲市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，邯鄲市 056002，電子郵箱：gyf8265@163.com)

周圍神經(jīng)損傷是由各種原因?qū)е碌闹車窠?jīng)支配區(qū)域發(fā)生的運(yùn)動、營養(yǎng)、感知障礙等，可對患者的身體健康造成嚴(yán)重的威脅[1-2]。周圍神經(jīng)損傷包括多種類型，如牽拉損傷、缺血性損傷、壓迫性損傷以及其他醫(yī)源性損傷等。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，隨著機(jī)動車輛逐漸普及，交通事故頻發(fā)，周圍神經(jīng)損傷發(fā)生率逐年上升[3]。尋找一種安全有效的治療措施對周圍神經(jīng)損傷患者的康復(fù)具有重要意義。中藥是一種多成分復(fù)合物，有助于神經(jīng)的修復(fù)和再生[4]。甘草甜素是甘草的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基、抗炎以及調(diào)節(jié)免疫等諸多藥理作用，其抗炎作用對缺血性損傷造成的中樞神經(jīng)損傷具有一定的改善作用[5-6]。目前國內(nèi)外有關(guān)甘草甜素對周圍神經(jīng)保護(hù)作用的研究較少。本研究通過建立周圍神經(jīng)損傷大鼠模型，探究甘草甜素對周圍神經(jīng)損傷模型大鼠神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物許可證號：SCXK桂2014-0001)，月齡3～5(3.9±0.6)個月，體重200～251(230.5±9.8)g。所有大鼠均飼養(yǎng)于干凈籠子，室溫(22.1±1.8)℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，飲純凈水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 甘草甜素購自西安拉維亞生物科技有限公司(批號：H20150801)溶液配置：將50 mg甘草甜素粉末溶于1 mL無水乙醇中，制備50 mg/mL的一級儲存液備用，取10 μL 一級儲存液與990 μL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)混合制備成500 μg/mL的二級儲存液備用。PBS、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)緩沖液、TBST液購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號：H20180201、H20180402、H20180901)。生長相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43,GAP-43)抗體和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)抗體購自上海江萊生物科技有限公司(批號：H20170801、H20180302)；噻唑藍(lán)購自南京探求生物技術(shù)有限公司(批號：TQSJ031)、二甲基亞砜購自上海艾銳化工有限公司(批號：H20180701)；IP細(xì)胞裂解液購自南京生航生物技術(shù)有限公司(批號：20150301)。

1.3 主要儀器 臺式離心機(jī)(Sigma公司，型號：1-13)；倒置熒光顯微鏡(Nikon公司，型號：108)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，型號：680)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海潤度生物科技有限公司，型號：Herocell 180)。

1.4 方法

1.4.1 分組、建模及干預(yù)：(1)分組。將大鼠按完全隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只。(2)正常對照組大鼠不做處理，其余4組大鼠建立周圍神經(jīng)損傷大鼠模型。采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取仰臥位固定，消毒后在大鼠右臀做一2 cm左右切口，將肌肉逐層分離，暴露大鼠坐骨神經(jīng)，并于大鼠坐骨結(jié)節(jié)下0.5 cm的位置將坐骨神經(jīng)干完全切斷，行解剖對位后使用無損傷縫線將兩斷端神經(jīng)吻合，并逐層縫合創(chuàng)口。(3)干預(yù)。建模后第3天開始，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠分別給予10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg甘草甜素溶液2 mL灌胃，1次/d，正常對照組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水進(jìn)行灌胃處理。各組大鼠均連續(xù)用藥干預(yù)15 d。

1.4.2 GAP-43和p75NTR蛋白表達(dá)水平的檢測：干預(yù)15 d后，稱重大鼠，采用40 mg/kg 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，斷頭法處死，于脊柱后方中間部位做一切口，將椎管完全咬開，完好無損的暴露脊髓，切取部分損傷側(cè)脊髓，立即置于液氮速凍待檢。使用PBS清洗標(biāo)本3次，棄掉緩沖液后加入IP細(xì)胞裂解液裂解0.5 h，獲取蛋白并測定其濃度。以20 μg/孔蛋白質(zhì)上樣，于SDS-PAGE緩沖液中電泳10 min，在10%的牛奶中進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1.5 h；37℃孵育一抗(均1 ∶500)過夜，次日使用TBST液清洗3次，10 min/次，常溫孵育二抗(1 ∶1 000)1 h，TBST液清洗3次，10 min/次，加入顯影劑顯色，使用凝膠成像分析系統(tǒng)對GAP-43、p75NTR條帶灰度值進(jìn)行分析，以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參蛋白，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值=目的蛋白相對表達(dá)量。

1.4.3 細(xì)胞增殖能力檢測：以40 μg/mL脂多糖誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖，以5 μg/mL刀豆球蛋白A誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。于無菌操作臺上取各組大鼠脾組織，于液氮中速凍后，用甲醛浸泡固定，然后進(jìn)行組織切片，置入含有RPMI 1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中使用機(jī)械-酶消化法制成單細(xì)胞懸液，并使用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/mL。37℃、5% CO2環(huán)境下分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，將培養(yǎng)后的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于96孔的培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液90 μL，各組細(xì)胞均加入10 μL的培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個復(fù)孔，將細(xì)胞置于37℃ 、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL噻唑藍(lán)繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩10 s，采用酶標(biāo)儀測定于570 nm波長處讀取細(xì)胞OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率，增殖率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-對照組OD值)/對照組OD值×100%。

1.4.4 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡檢測：取大鼠損傷脊髓，提取神經(jīng)元細(xì)胞，將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)至6孔板，在37℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，0.25%胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心5 min，收取細(xì)胞，PBS重復(fù)洗滌2次，2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入1 mL 碘化丙啶染液，常溫避光放置1 h后，于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.5 比目魚肌肌肉指數(shù)及有髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量的測定：完全暴露各組大鼠損傷側(cè)后肢三頭肌，向上分離并于跟腱止點(diǎn)位置將三頭肌切斷，沿比目魚肌向下分離三頭肌，同時(shí)切取比目魚肌，切除結(jié)締組織后去除表面血液，稱取重量，計(jì)算比目魚肌肌肉指數(shù)，比目魚肌肌肉指數(shù)=比目魚肌重量/大鼠麻醉處死時(shí)體重×100%。取大鼠神經(jīng)遠(yuǎn)端0.6～0.7 cm坐骨神經(jīng)干組織，液氮冷凍后用甲醛浸泡固定，制作組織切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，400倍視野下照相，使用Image-ProPlus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)單位面積內(nèi)的髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠脊髓組織GAP-43、p75NTR蛋白相對表達(dá)水平比較 模型組，低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠GAP-43蛋白相對表達(dá)水平依次升高，p75NTR蛋白相對表達(dá)水平依次降低(均P<0.05)。見表1及圖1。

表1 4組大鼠脊髓組織GAP-43、p75NTR蛋白相對表達(dá)水平比較(x±s)

圖1 5組大鼠GAP-43、p75NTR蛋白表達(dá)水平

2.2 各組大鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖情況比較 各個時(shí)間點(diǎn)，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖率均依次降低(均P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖情況比較(x±s，%)

2.3 各組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較 各個時(shí)間點(diǎn)，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率依次降低(均P<0.05)，見表3。

表3 4組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況比較(x±s，%)

2.4 各組大鼠比目魚肌肌肉指數(shù)及有髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量比較 模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、對照組大鼠比目魚肌肌肉指數(shù)及有髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量均依次增加(均P<0.05)，見表4。

表4 4組大鼠比目魚肌肌肉指數(shù)及有髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量比較(x±s)

3 討 論

手術(shù)治療和藥物治療是目前臨床治療周圍神經(jīng)損傷常用的方法，其中藥物治療在周圍神經(jīng)重建中發(fā)揮著重要的作用[7]。但目前臨床上治療周圍神經(jīng)損傷的常用藥物都有一定的不良反應(yīng)，尋找一種對機(jī)體毒副作用較小的新藥物具有重要意義。甘草甜素具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等藥理作用，同時(shí)對神經(jīng)損傷具有一定的保護(hù)、修復(fù)作用[8-9]。本研究顯示，各劑量甘草甜素干預(yù)組大鼠比目魚肌肌肉指數(shù)及有髓神經(jīng)纖維直徑、數(shù)量高于或多于模型組，提示甘草甜素能夠減輕神經(jīng)支配肌肉的萎縮，增加有髓神經(jīng)纖維數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)再生，從而減輕神經(jīng)繼發(fā)性損傷。

GAP-43是一種神經(jīng)組織特異性蛋白，主要位于生長錐突觸中[10-11]，分布于機(jī)體腦組織、海馬區(qū)、脊髓以及自主神經(jīng)系統(tǒng)[12]。有研究顯示，GAP-43表達(dá)的變化與神經(jīng)元的生長發(fā)育密切相關(guān)，神經(jīng)元組織生長發(fā)育過程伴隨著GAP-43表達(dá)的升高，發(fā)育停止后GAP-43的表達(dá)會隨之下降[13]。還有研究表明，GAP-43在軸突再生、突觸重建、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等生物過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用，GAP-43高表達(dá)與軸突再生以及突觸重建密切相關(guān)[14]。p75NTR屬于腫瘤壞死因子受體家族，是一種跨膜糖蛋白[15]，其能夠與神經(jīng)蛋白結(jié)合，在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。臨床研究表明，p75NTR的表達(dá)與癲癇、阿爾茲海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[18]，適當(dāng)調(diào)控p75NTR的表達(dá)能夠改善神經(jīng)細(xì)胞的存活情況，從而改善病情或緩解疾病的進(jìn)展[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，各劑量甘草甜素干預(yù)組大鼠脊髓GAP-43蛋白表達(dá)升高，p75NTR蛋白表達(dá)下降，且神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率下降，提示甘草甜素能夠調(diào)控脊髓GAP-43、p75NTR的表達(dá)而緩解神經(jīng)元組織繼發(fā)損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生，并且具有一定的濃度依賴性。

有研究顯示，周圍神經(jīng)損傷后機(jī)體會出現(xiàn)一定的免疫反應(yīng)，影響神經(jīng)修復(fù)、再生以及功能恢復(fù)。還有研究顯示，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)對神經(jīng)組織的修復(fù)和再生具有一定的促進(jìn)作用[21]。T、B淋巴細(xì)胞是評價(jià)機(jī)體免疫功能的較為常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，甘草甜素干預(yù)后，大鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞增殖率降低，提示甘草甜素能夠抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，減輕周圍神經(jīng)損傷大鼠免疫反應(yīng)，并且具有一定的濃度依賴性。

綜上所述，甘草甜素可減輕周圍神經(jīng)損傷模型大鼠比目魚肌萎縮程度，促進(jìn)神經(jīng)再生，這可能與其抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，以及調(diào)控GAP-43、p75NTR蛋白表達(dá)有關(guān)。