張倩玉， 許 斌， 金 偉， 周守兵， 李文娟， 張秋君， 胡丹丹， 李文玉， 劉 虎

(1. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 西區(qū)腫瘤科(安徽省腫瘤醫(yī)院)， 合肥 230000； 2. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤一科， 武漢 430060)

惡性腫瘤是我國發(fā)病率及死亡率最高的疾病之一，放射治療作為一種常見的治療方式常被用于癌癥的局部治療。約有50%～60%的癌癥患者接收放射治療[1]。然而，會有95%的放療患者會在放療期間或放療結(jié)束之后出現(xiàn)急性放射性皮炎[2]。急性放射性皮炎是一種常見的放療并發(fā)癥，定義為一種由β,γ或X射線所造成的一系列皮膚副反應(yīng)，通常發(fā)生于放療后90 d之內(nèi)[3]，臨床表現(xiàn)為不適感、灼燒感、瘙癢、疼痛等[4]，嚴(yán)重者會影響抗腫瘤治療的順利進(jìn)行。因此，越來越多的研究著眼于探討其發(fā)病機(jī)制及防治措施。目前尚無標(biāo)準(zhǔn)方法治療或預(yù)防急性放射性皮炎的發(fā)生。

柚皮素(4′,5,7-三羥基二氫黃酮)是一種富含于柑橘、葡萄和番茄等水果中的黃酮類化合物[5-6]，其已被證實(shí)具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[7-8]，但柚皮素對于癌癥局部治療所用放射性所導(dǎo)致的急性放射性皮炎有無作用暫無文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究探討了柚皮素通過不同給藥方式對于接受放射線的SD大鼠是否具有保護(hù)作用。同時(shí)觀察了柚皮素對于在臨床中接受頭頸部放療的患者急性放射性皮炎的發(fā)生發(fā)展所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 清潔級健康SD大鼠共40只，雄性，質(zhì)量240～260 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

1.1.2 患者一般資料 觀察因頭頸部惡性腫瘤行頸部放療或同步放化療，劑量≥30 Gy，患者11名，9名男性，2名女性，年齡26～73歲之間，其中7人診斷為鼻咽癌，3人診斷為喉癌，1人為鼻腔未分化癌?；颊唠p側(cè)頸部劑量一致，ECOG評分0～1分。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

隨機(jī)平均分為5組，每組8只，分別為預(yù)防性使用外用柚皮素(照射前5 d開始涂抹，每天2次)、治療性使用外用柚皮素(自發(fā)生肉眼可見的放射性皮炎后開始涂抹柚皮素乳膏，每天2次)、照射后口服柚皮素組(自放療完成后第一天開始灌胃，每天1次，200 mg/kg)、模型組(自發(fā)生肉眼可見的放射性皮炎后開始使用溶劑乳膏，每天1次)、空白對照組，除對照組不接受放射外，其余各組大鼠均接受臀背部皮膚照射。照射前將所有動物使用電動推刀局部去毛。射線照射時(shí)采用異氟烷吸入方式麻醉。

1.2.2 動物照射方法

射線類型：6 MV電子線，45 Gy，照射野為3×3 cm，劑量率300 MU/min，使用1.5 cm補(bǔ)償膜覆蓋于動物皮膚表面，單次照射源皮距為100 cm，每次照射1只。

對照組：局部去毛，麻醉，不照射。

1.2.3 患者試驗(yàn)方法

所有患者注意宣教自放療開始保持局部皮膚清潔、干燥，避免摩擦及用力清潔等操作，自開始出現(xiàn)I°放射性皮損后以頸部正中線為界限，隨機(jī)選取一側(cè)涂抹柚皮素乳膏，涂抹在放射野處(試驗(yàn)區(qū)的半側(cè)頸部皮膚，外擴(kuò)1 cm左右)，取適量均勻涂抹，直至基本吸收，一日2次。另一側(cè)予以日常基本護(hù)理。每日觀察并記錄患者雙側(cè)放射性皮炎程度。無論雙側(cè)任何一側(cè)出現(xiàn)4級的皮膚損傷或毒副反應(yīng)，則中止試驗(yàn)。如果雙側(cè)皮膚損傷均維持在小于/等于3級，則一直涂抹受試保護(hù)劑至放療結(jié)束。

1.2.4 觀察指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)

1)動物觀察指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)。動物接受照射后每天觀察照射區(qū)域的皮炎情況并進(jìn)行評分，采用Douglas and Fowler評分方法[9](如表1)。觀察并記錄大鼠體重變化情況并記錄死亡情況。

表1 Douglas and Fowler放射性皮炎評分[9]

2)患者觀察指標(biāo)與評分標(biāo)準(zhǔn)。使用急性放射性反應(yīng)RTOG (Radiation therapy oncology group)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0級：基本無變化；I級：水泡、輕度紅斑/脫發(fā)/干性脫屑/流汗減少；II級：明顯紅斑，塊狀濕性脫屑/中度水腫；III級：皮膚皺褶部位以外的融合的濕性脫屑，凹陷性水腫；IV級：潰瘍、出血、壞死。觀察出現(xiàn)各級皮膚損傷的時(shí)間(RTOG分級標(biāo)準(zhǔn))以及與未涂抹受試保護(hù)劑的對照側(cè)相比，受試保護(hù)劑是否對單側(cè)頸部皮膚的放射性損傷降級。

1.2.5 動物取材

照射后20 d，使用1 mm毛細(xì)管行大鼠活體眼眶取血，20 min離心(2000 r/min)，取上層清液即為血清，標(biāo)記后于-80 ℃冰箱保存。照射后28 d用2%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，用手術(shù)剪剪取照射部位的皮膚組織，大小約1.0 cm×1.0 cm，剪取全層，其中一部分組織用4%多聚甲醛固定，固定時(shí)間超過24 h。一部分組織立刻放入液氮中，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2.6 病理學(xué)檢測

使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，石蠟包埋，進(jìn)行切片，行蘇木素伊紅(HE)染色，免疫組化(IHC)染色檢測CD68，觀察CD68在皮膚組織的表達(dá)分布情況。

1.2.7 血清學(xué)檢測

使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測方法檢測血清中IL-6及MCP-1的含量。

1.2.8 組織學(xué)檢測

使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測組織中Arg-1含量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，用重復(fù)測量的方差分析統(tǒng)計(jì)皮炎評分與體重變化情況，使用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)CD68+、IL-6、MCP-1及Arg-1表達(dá)情況，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物一般情況

各組動物在觀察期間均未出現(xiàn)死亡。動物放療期間體重情況如圖1。對比空白組，各組(預(yù)防組、口服給藥組、治療組和照射模型組)動物體重?zé)o顯著性差異，P值分別為0.750、0.451、0.092和0.192。

圖1 放療期間動物體重變化

2.2 動物放射性皮炎特征

2.2.1 外觀特征

接受電子線照射后的4組大鼠于接受放療后第9或第10天時(shí)出現(xiàn)肉眼可見的急性放射性皮炎表現(xiàn)：紅斑、脫毛，進(jìn)而出現(xiàn)薄紙樣改變、痂皮樣改變，于第15至第18天達(dá)高峰；后皮炎表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn)，痂皮脫落。各組大鼠臀背部皮膚放射性皮炎表現(xiàn)如圖2，其皮炎評分結(jié)果如圖3。對比模型組，預(yù)防組、口服給藥組和治療組動物皮炎較前顯著好轉(zhuǎn)，P值分別為0.003、0.030和0.037。

2.2.2 鏡下特征

HE染色可見對照組的表皮、真皮結(jié)構(gòu)正常，真皮內(nèi)存在豐富的毛囊結(jié)構(gòu)，可見正常皮膚褶皺結(jié)構(gòu)；模型組的部分動物表皮層各層結(jié)構(gòu)分界未見，結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)壞死，部分表皮層結(jié)構(gòu)消失。真皮層內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，表皮層與真皮層結(jié)構(gòu)分離，未見毛囊及皮脂腺，未見皮膚褶皺；使用柚皮素的3組表皮層可見，真皮層與其分界清晰，部分出現(xiàn)分離，毛囊及皮脂腺未見，皮膚褶皺未見；表皮層各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，真皮層內(nèi)可見明顯炎性細(xì)胞浸潤。圖4為光鏡下HE染色結(jié)果(100×)。

圖2 各組動物放療后不同時(shí)間點(diǎn)急性放射性皮炎的表現(xiàn)

圖3各組動物放射性皮炎評分

IHC檢測局部組織內(nèi)CD68陽性表達(dá)情況：400倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)CD68+細(xì)胞數(shù)，取均值，空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組CD68+細(xì)胞數(shù)分別為：0.75、12.91、7.70、3.13和8.30(圖5)。模型組CD68+細(xì)胞數(shù)較空白組顯著增加(P=0.004)，使用柚皮素的3組，CD68+細(xì)胞數(shù)較模型組下降，其中口服給藥組具有顯著性差異(P=0.005)。光鏡下觀察用IHC方法檢測皮膚組織中CD68+細(xì)胞表達(dá)(圖6，400×)。

“#”：對比空白組，P=0.004;“*”：對比模型組，P=0.005

圖6 放療后第28天各組照射區(qū)域皮膚CD68免疫組化染色結(jié)果(400×)

2.2.3 ELISA檢測放療后第20天動物血清內(nèi)IL-6含量

為研究大鼠血清內(nèi)炎癥情況，使用ELISA檢測大鼠放療后第20天血清內(nèi)IL-6的表達(dá)情況，空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組IL-6平均值分別為23.33、260.21、36.25、22.37和65.35 pg/mL。對比空白組，放射線可以顯著增加大鼠體內(nèi)IL-6的表達(dá)(P<0.01)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P<0.01)(圖7)。

2.2.4 ELISA檢測放療后第20天動物血清內(nèi)MCP-1含量

MCP-1即單核細(xì)胞趨化蛋白-1，其對單核細(xì)胞具有趨化活性，可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。因第一部分結(jié)果顯示，放療可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞在真皮層的聚集，因此我們進(jìn)一步使用ELISA檢測MCP-1在循環(huán)中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：空白組、模型組、預(yù)防組、口服給藥組及治療組MCP-1平均值為335.73、497.94、389.67、380.11和367.07 pg/mL。對比空白組，放射線可以顯著增加大鼠體內(nèi)MCP-1的表達(dá)(P=0.004)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P= 0.04、0.036、0.021，圖8)。

“#”:對比空白組，P<0.01;“*”:對比模型組，P<0.01

圖8 各組大鼠放療后第20天血清中MCP-1表達(dá)量

2.2.5 qPCR檢測放療后第28天動物局部組織Arg1量

Arg1是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子，可抑制炎癥反應(yīng)。為研究放療所致的巨噬細(xì)胞浸潤及柚皮素降低巨噬細(xì)胞浸潤是否是通過該途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，我們于放療后28 d取大鼠放療區(qū)域局部組織，進(jìn)行qPCR檢測，結(jié)果顯示，5組結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖9)。

2.3 患者放射性皮炎表現(xiàn)

11名患者均未出現(xiàn)III級以上放射性皮炎。試驗(yàn)側(cè)及對照側(cè)在觀察結(jié)束時(shí)均為II級放射性皮炎表現(xiàn)。即使用柚皮素乳膏一側(cè)放射性皮炎程度較對照側(cè)皮炎程度均無加重。其中1名患者因雙側(cè)頸部皮膚疼痛感明顯，自行加用其他藥物治療，其余10名患者均每日涂抹柚皮素直至放療結(jié)束。所有患者均未出現(xiàn)無法耐受的副反應(yīng)。2人用藥側(cè)好于對照側(cè)，表現(xiàn)為用藥側(cè)頸部皮膚出現(xiàn)II°皮損時(shí)間晚于對照側(cè)10 d左右，其余8人雙側(cè)頸部皮炎情況未見區(qū)別。

圖9 各組大鼠放療后第28天組織中Arg1 mRNA量(P>0.05)

3 討論與結(jié)論

已有的實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，對于急性放射性皮炎，蘆薈[10]、激素[11]、三乙醇胺[12]、水化膜[13]等可能具有一定的防治效果，但是其有效性具有一定的局限，且缺少大樣本的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)。對于急性放射性皮炎的治療尚無標(biāo)準(zhǔn)治療方式，因此研究人員期望發(fā)現(xiàn)更多更有效的藥物成分，以更好地防治急性放射性皮炎，而柚皮素作為一種富含于水果中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等作用。已有的動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，包含柚皮素在內(nèi)的黃酮類混合物在小鼠體內(nèi)可起到一定的保護(hù)作用[14]，可以減少放射線照射對于動物的致死作用，其對于紫外線誘導(dǎo)的放射線皮膚損傷同樣具有保護(hù)作用[15]。而對于柚皮素的基礎(chǔ)研究證實(shí)，其可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥狀態(tài)來影響心血管疾病的發(fā)生，肺纖維化及腫瘤的轉(zhuǎn)移等疾病過程[16-17]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柚皮素可以降低動物急性放射性皮炎的表現(xiàn)，其中預(yù)防治療組的效果最佳，在機(jī)制研究方面，CD68為單核巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，在使用柚皮素之后，無論何種給藥方式，均可以降低其表達(dá)。MCP-1即單核細(xì)胞趨化蛋白，可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過檢測動物血清中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，放射線可以增加其表達(dá)，而柚皮素可降低其增加程度，進(jìn)一步證實(shí)了單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)在急性放射性皮炎發(fā)生中的作用，以及柚皮素降低急性放射性皮炎程度這一過程中所扮演的角色。IL-6是一種由包括單核-巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌的具有復(fù)雜生理功能的細(xì)胞因子，已有的研究發(fā)現(xiàn)，放射線可導(dǎo)致炎性因子IL-6的大量釋放[18]。Okunieff等[19]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對放療所致的急慢性皮炎具有保護(hù)作用，其可以降低放射線所致的皮膚組織中IL-6 mRNA表達(dá)。因而，我們猜測柚皮素可以通過降低放療所致循環(huán)中IL-6水平的升高來降低放射性皮炎的表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對比空白組，放射線可以顯著增加大鼠體內(nèi)IL-6的表達(dá)(P<0.01)，3種使用柚皮素的方式均可以顯著降低放射所致的IL-6的升高(P<0.01)。因此我們認(rèn)為柚皮素可以通過降低單核細(xì)胞趨化蛋白對于單核巨噬細(xì)胞的趨化作用，降低單核巨噬細(xì)胞在放射性皮炎中所發(fā)揮的作用，進(jìn)而可以降低以IL-6為代表的炎性因子的釋放。巨噬細(xì)胞家族在功能方面具有異質(zhì)性[20]， M1和M2型巨噬細(xì)胞作為其功能狀態(tài)的兩種極端，在免疫應(yīng)答功能方面具有相反作用[21]。M1 型巨噬細(xì)胞是一種發(fā)揮正向免疫應(yīng)答作用的細(xì)胞，可以通過分泌促炎細(xì)胞因子及趨化因子，提呈抗原，發(fā)揮免疫監(jiān)視的功能；而 M2 型巨噬細(xì)胞功能相反，其僅有較弱抗原提呈能力，并可以通過分泌抑制性細(xì)胞因子 IL-10 和/或TGF-β等抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)[22]。Arg-1是M2型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志，我們假設(shè)柚皮素降低急性炎癥反應(yīng)是通過上調(diào)以Arg-1為表面標(biāo)志的M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)來下調(diào)免疫應(yīng)答，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組之間Arg-1無顯著性差異，因此柚皮素可能通過其他途徑降低其炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)需要補(bǔ)充檢測M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況來明確其是否可通過降低M1型巨噬細(xì)胞的表達(dá)來影響巨噬細(xì)胞的浸潤。

在臨床觀察中，我們初步證實(shí)柚皮素乳膏是安全的，其不會加重患者放射性皮炎程度，但有效性十分有限，需要進(jìn)一步探究。11名患者中2名患者能延緩出現(xiàn)II°放射性皮炎的時(shí)間，但無法停留在I°放射性皮炎?？紤]與局部皮膚吸收柚皮素成分有限相關(guān)，且每日涂抹2次，操作上可能加重皮損程度，因此柚皮素可否作為臨床上治療甚至預(yù)防放射性皮炎的藥物，需要進(jìn)一步的研究及發(fā)現(xiàn)，本臨床觀察納入患者數(shù)目有限，需要更大樣本數(shù)據(jù)來說明柚皮素的安全性及有效性。