何念武，曹思娟，張咪

1(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛， 726000)2(陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院(商洛學(xué)院)，陜西 商洛， 726000)

萬(wàn)壽菊(TageteserectaL.)為菊科萬(wàn)壽菊屬一年生草本植物萬(wàn)壽菊的花，于每年夏秋季節(jié)采收，其花和葉干燥后均可入藥，具有清熱化痰、補(bǔ)血通經(jīng)、去淤生新之功效[1-3]。萬(wàn)壽菊原產(chǎn)自墨西哥，因其生存能力和適應(yīng)性極強(qiáng)，在我國(guó)南北方常被用作觀賞植物進(jìn)行栽培，資源極為豐富[4-5]。研究表明，萬(wàn)壽菊主要含有噻吩類(lèi)[6]、精油類(lèi)[2]、葉黃素類(lèi)[7-9]、黃酮類(lèi)及其苷類(lèi)[10]、生物堿類(lèi)和萜類(lèi)等成分[3,11-12]，尤其是噻吩類(lèi)成分作為菊科植物的特征性次代謝生產(chǎn)物，具有廣泛的殺蟲(chóng)活性[6]；葉黃素類(lèi)成分在老年性黃斑退化病和白內(nèi)障疾病防治、緩解視疲勞等方面具有重要作用[13]，亦有抗氧化、抗腫瘤和預(yù)防心血管疾病等功效，在食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[14-16]。當(dāng)前，學(xué)界對(duì)萬(wàn)壽菊的研究主要集中在葉黃素分離提取和藥理活性，而對(duì)萬(wàn)壽菊多糖的研究鮮有報(bào)道?；诖?，本研究以萬(wàn)壽菊為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提乙醇沉淀法提取萬(wàn)壽菊多糖(TageteserectaL. polysaccharides，TEPs)工藝，繼而采用DEAE-52纖維素和Sephadex G-100柱層析法進(jìn)行分離純化，在此基礎(chǔ)上探究萬(wàn)壽菊多糖體外抗氧化和抑瘤規(guī)律，以期為萬(wàn)壽菊的深加工和綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬(wàn)壽菊于2018年8～9月采集自陜西省洛南縣饅頭山地區(qū)，經(jīng)商洛學(xué)院制藥工程教研室鑒定為菊科萬(wàn)壽菊屬植物萬(wàn)壽菊的花，晾曬干后備用。

DEAE-52纖維素、Sephadex G-100、葡聚糖T系列、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP)，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦味基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino bis 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate acid,ABTS)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；其他分析試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀(含示差折光檢測(cè)器)，島津公司；Form311 CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；RT6000酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；TGL-16M超低溫高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；BSC-1000IIA2生物安全柜，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.3 TEPs分離制備方法

1.3.1 TEPs提取及工藝優(yōu)化

1.3.1.1 TEPs提取

稱(chēng)取萬(wàn)壽菊粉末50 g，置于提取容器中，加入20倍體積的蒸餾水，在80 ℃水浴下恒溫浸提2 h，過(guò)濾，將濾渣按照第1次提取方法重復(fù)提取2次[17]。將3次濾液合并，減壓濃縮至100～200 mL。向濃縮液中加4倍體積無(wú)水乙醇，于4 ℃靜置過(guò)夜后以4 000 r/min離心10 min，棄上清液(回收乙醇)，沉淀溶解于少量蒸餾水中，透析3 d(每4 h換一次透析溶液)，去除小分子雜質(zhì)，冷凍干燥后即得萬(wàn)壽菊多糖粗提物，采用苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量[17-18]，多糖提取率按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.3.1.2 TEPs提取工藝優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)方法：分別稱(chēng)取萬(wàn)壽菊粉末10 g置于5個(gè)圓底燒瓶中，按1∶20體積比加蒸餾水，于80 ℃恒溫水浴浸提3次，合并提取液，濃縮干燥，計(jì)算多糖提取率，以此考察提取時(shí)間為1、1.5、2、2.5和3 h對(duì)多糖提取率的影響；固定料液比為1∶20(g∶mL,下同)，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)3次，考察提取溫度為60，70，80，90，100 ℃時(shí)對(duì)多糖提取率的影響；在80 ℃恒溫水浴分別浸提3次，每次浸提2 h，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對(duì)多糖提取率的影響；最后，固定提取溫度80 ℃、時(shí)間2 h、料液比為1∶20，考察提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響[18]。

響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)：以萬(wàn)壽菊多糖提取率(Y)為響應(yīng)值，基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選主要影響因素，采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[19-20]。

1.3.2 DEAE-52纖維素和Sephadex G-100柱色譜法分離純化TEPs

稱(chēng)取100 mg TEPs，溶于適量去離子水中，進(jìn)行上樣，而后打開(kāi)DEAE-52纖維素層析柱(2.8 cm×60 cm)[17,21-23]下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入交換劑中，待樣品快要進(jìn)完時(shí)，加入少量緩沖液沖洗柱壁，待吸附12 h后分別用去離子水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，流速為1 mL/min，5 mL/管，用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)[17]，以492 nm吸光值對(duì)洗脫管數(shù)作圖，根據(jù)洗脫曲線分段合并，減壓、濃縮、透析后分別上樣于Sephadex G-100層析柱(1.6 cm×90 cm)[17,21-23]，去離子水洗脫，流速0.35 mL/min，4 mL/管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)[17]，繪制TEPs純化洗脫曲線。合并洗脫峰值處相應(yīng)洗脫液，真空冷凍干燥后即得TEPs不同組分樣品。

1.3.3 TEPs重均分子量測(cè)定及單糖組成分析

參照文獻(xiàn)[17,24]中高效體積排阻色譜法(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)測(cè)定多糖重均分子量和高效液相色譜法分析其單糖組成。

1.4 TEPs體外抗氧化活性規(guī)律分析

TEPs對(duì)DPPH自由基、羥自由基(·OH)、ABTS自由基和超氧陰離子自由基(O2-·)清除實(shí)驗(yàn)均參照本課題組已有方法進(jìn)行[17,24-25]

1.5 TEPs體外抑瘤活性測(cè)定

以MTT法[25-27]檢測(cè)TEPs對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(5×104～1×105個(gè)/mL)細(xì)胞1 mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待完全貼壁生長(zhǎng)后棄上清液；每孔加新鮮培養(yǎng)液900 μL和100 μL質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200 μg/mL的待測(cè)TEPs溶液，以環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以生理鹽水補(bǔ)足，繼續(xù)培養(yǎng)44 h，加入5 mg/mL的MTT溶液100 μL，4 h后用十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)三聯(lián)液終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)分析儀于570 nm處檢測(cè)OD值，每處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)，按公式(3)計(jì)算抑制率：

抑制率/%=

(2)

以TEPs質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率為縱坐標(biāo)繪制曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

單因素實(shí)驗(yàn)、抗氧化和抑瘤實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析采用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)至少平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEPs提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從圖1-a可知，萬(wàn)壽菊多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先增后減的規(guī)律，在提取2 h時(shí)達(dá)到峰值，此后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)提取率有所下降。因而，在本實(shí)驗(yàn)條件下，萬(wàn)壽菊多糖最佳提取時(shí)間為2 h。由圖1-b可知，隨著提取溫度不斷升高，TEPs提取率先快速增長(zhǎng)而后緩慢下降，在80 ℃時(shí)達(dá)到極值。因此，選擇80 ℃作為T(mén)EPs最佳提取溫度。由圖1-c可知，TEPs提取率隨著提取溶劑倍數(shù)的不斷增加而呈上升趨勢(shì)，在提取溶劑(mL)用量為原材料(g)20倍以下(即料液比1∶20)的條件下，提取率增長(zhǎng)幅度較快；提取溶劑用量大于20倍時(shí)，多糖提取率亦有所增加但增幅非常小，從經(jīng)濟(jì)高效的角度考慮選擇料液比為1∶20為最佳。從圖1-d可以看出，隨著提取次數(shù)的增加，TEPs提取率先增后減，在提取3次的時(shí)候達(dá)到峰值。因此，從節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本等方面綜合考慮選擇提取3次為最佳條件，并結(jié)合張雪春等[28]的處理方法，后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)不再考察提取次數(shù)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化TEPs提取工藝結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從經(jīng)濟(jì)和節(jié)省時(shí)間的角度考量固定提取次數(shù)為3次，選取提取時(shí)間、提取溫度和料液比作為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因素水平表及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和表2所示。

a-提取時(shí)間；b-提取溫度；c-料液比；d-提取次數(shù)圖1 不同因素對(duì)萬(wàn)壽菊多糖提取率的影響Fig.1 Effects of different factors on the extraction yield of TEPs

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and level of Box-Behnken test

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

2.2.2 多元回歸方程的構(gòu)建與分析

采用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表3)，進(jìn)行多元回歸擬合可得TEPs多糖提取率與提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)的二次回歸方程為：Y=3.70+0.16A+0.1B+0.056C+0.08AB+0.038AC+0.039BC-0.16A2-0.2B2-0.25C2

如圖2所示，TEPs提取率隨著3個(gè)因素的變化而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，等高線的形狀可以反映出2個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱，其中近橢圓形狀表示交互作用顯著，近圓形則表示不顯著[29]。由圖中可以看出提取溫度和提取時(shí)間、料液比交互作用顯著，提取時(shí)間和料液比交互作用不顯著，這與表3中顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

a-提取溫度與提取時(shí)間；b-提取溫度與料液比；c-提取時(shí)間與料液比圖2 提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)TEPs提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface diagrams of the effect of extraction temperature， time， solid-to-solvent ratio on TEPs extraction yield

2.2.3 TEPs提取工藝優(yōu)化與驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)上述回歸方程求偏導(dǎo)得最佳提取條件為：提取溫度80.47 ℃、提取時(shí)間2.02 h、料液比1∶20.95(g∶mL)，利用回歸方程計(jì)算的預(yù)測(cè)值是3.732%，而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各因素0水平時(shí),5次試驗(yàn)平均得率為(3.700±0.038)%，該模型優(yōu)化工藝預(yù)測(cè)提取率提高了8.65%。綜合考慮實(shí)際可操作性，將上述條件修正為：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶21(g∶mL)。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，TEPs平均提取率為(3.707±0.072)%，低于模型預(yù)測(cè)值0.67%，符合客觀實(shí)際。

2.3 TEPs分離純化結(jié)果

TEPs經(jīng)過(guò)DEAE-52纖維素柱層析后，洗脫曲線如圖3所示。經(jīng)去離子水和0.1～0.5 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，得到大小不等5個(gè)洗脫峰，其中峰1和峰5幾乎可忽略不計(jì)，峰3的多糖含量過(guò)低，沒(méi)有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值，只有峰2和峰4含量最高，進(jìn)一步將其濃縮、透析后經(jīng)Sephadex G-100柱層析純化，得圖4所示洗脫峰，由峰2和峰4各得到單一對(duì)稱(chēng)洗脫峰，將洗脫液收集、濃縮、冷凍干燥備用，分別命名為T(mén)EPs-1和TEPs-2，經(jīng)測(cè)定二者總糖含量分別為79.27%和87.71%。

圖3 TEPs的DEAE-52洗脫曲線Fig.3 The elution curve of TEPs on DEAE-52

a-TEPs-1; b-TEPs-2圖4 TEPs的Sephadex G-100洗脫曲線Fig.4 The elution curve of TEPs on Sephadex G-100

2.4 TEPs各組分重均分子量和單糖組成分析

2.4.1 TEPs-1和TEPs-2重均分子量

經(jīng)HPSEC對(duì)TEPs 2個(gè)組分進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，TEPs-1和TEPs-2的色譜峰均為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明該組分為均一多糖。根據(jù)葡聚糖系列得回歸方程為lgMw=7.512 8-0.497 3Rt，R2=0.987 7。根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算得TEPs-1和TEPs-2重均分子量分別為4.69和5.73 kDa。

a-TEPs-1; b-TEPs-2圖5 TEPs-1和TEPs-2的HPSEC色譜圖Fig.5 HPSEC chromatograms of TEPs-1 and TEPs-2

2.4.2 TEPs-1和TEPs-2單糖組成分析

TEPs酸水解衍生物中單糖組成分析如圖6和表4所示。由圖6可以看出，TEPs-1和TEPs-2均由7種單糖組成，各組分單糖含量不盡相同且不含糖醛酸，說(shuō)明TEPs是中性雜多糖[17,24]。而從表4中可以看出，TEPs 2個(gè)組分中甘露糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高，而鼠李糖、木糖和巖藻糖的含量非常少。

1-甘露糖；2-核糖；3-鼠李糖；4-葡萄糖醛酸；5-半乳糖醛酸；6-葡萄糖；7-木糖；8-半乳糖；9-阿拉伯糖；10-巖藻糖;a-10種標(biāo)準(zhǔn)單糖；b-TEPs-1；c-TEPs-2圖6 TEPs-1、TEPs-2和混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of mixture of monosaccharide standards

表4 TEPs酸水解衍生物中單糖組成 單位：%

2.5 TEPs體外抗氧化活性分析

2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

TEPs經(jīng)純化后得到均一多糖TEPs-1和TEPs-2具有良好的抗氧化活性。由圖7-a可以看出，在TEPs質(zhì)量濃度為1.0～3.5 mg/mL范圍內(nèi)，2種多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)近似的線性遞增關(guān)系，TEPs-2增加幅度明顯高于TEPs-1，但都低于VC。

當(dāng)質(zhì)量濃度為3.5 mg/mL時(shí)，TEPs-1、TEPs-2和VC對(duì)DPPH自由基的清除率分別為45.01%、88.33%和100%。此外，從表5中可以看出TEPs-1和TEPs-2對(duì)DPPH的IC50值分別為4.27和2.24 mg/mL。

2.5.2 對(duì)·OH的清除作用

由圖7-b可以看出，TEPs質(zhì)量濃度從1.0 mg/mL增加至3.5 mg/mL時(shí)，TEPs兩種組分對(duì)·OH的清除能力隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度大于2.5 mg/mL時(shí)，TEPs-2對(duì)·OH的清除率增幅較快，VC對(duì)自由基的清除率幾乎為100%，而TEPs-1則弱于TEPs-2。另外，從表5中可以看出TEPs-1和TEPs-2對(duì)·OH的IC50值分別為5.28和2.48 mg/mL。

2.5.3 對(duì)O2-·的清除作用

由圖7-c可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，濃度越大，對(duì)自由基清除能力越強(qiáng)，待測(cè)樣品和VC清除O2-·的能力大小順序依次為VC>TEPs-2>TEPs-1，TEPs-1和TEPs-2清除O2-·的IC50分別為4.38和2.62 mg/mL(表5)。

2.5.4 對(duì)ABTS自由基的清除作用

從圖7-d和表5中可以看出，在1.0～3.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品具有明顯的清除ABTS自由基的能力，TEPs 2種組分中TEPs-2清除能力更強(qiáng)，IC50為2.21 mg/mL，TEPs-1清除能力較弱，其IC50為3.94 mg/mL。由圖7-d可知，2種組分對(duì)ABTS自由基的清除能力均小于同濃度的VC，當(dāng)濃度達(dá)到3.5 mg/mL時(shí)，TEPs-2清除能力接近于VC。有研究表明，多糖的抗氧化活性可能與其分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)有關(guān)[30]，TEPs經(jīng)分離純化得到了2種均一多糖，都有一定的抗氧化能力，但均未對(duì)其精細(xì)化結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，故而更深層次的抗氧化機(jī)制有待于下一步深入研究。

a-DPPH自由基；b-·OH；c-O2-·；d-ABTS自由基圖7 TEPs-1和TEPs-2體外抗氧化活性Fig.7 In vitro antioxidant activities of TEPs-1 and TEPs-2

表5 TEPs對(duì)不同自由基體系清除能力的IC50值Table 5 IC50 values of TEPs for scavenging capacityof different free radical systems

2.6 TEPs體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況分析

TEPs不同組分和CTX對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用如圖8所示，TEPs兩個(gè)組分對(duì)MCF-7細(xì)胞均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)TEPs質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，TEPs-1對(duì)MCF-7的生長(zhǎng)抑制率為40.82%，TEPs-2為73.45%，CTX為88.98%，說(shuō)明TEPs-2對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制率高于TEPs-1。經(jīng)Excel軟件計(jì)算可得，TEPs-1、TEPs-2和CTX的IC50值為319.76、134.04和67.77 μg/mL，三者之間存在顯著差異(P<0.05)。

圖8 TEPs對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率Fig.8 Inhibition rate of TEPs on MCF-7 cells

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化萬(wàn)壽菊多糖水提醇沉工藝為：提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶21(g∶mL)，在此條件下多糖提取率為3.7%。繼而采用DEAE-52和Sephadex G-100對(duì)TEPs進(jìn)行純化得到TEPs-1和TEPs-2兩個(gè)均一組分，其總糖含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為79.27%和87.71%，重均分子質(zhì)量分別為4.69 kDa和5.73 kDa。TEPs兩種組分中甘露糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖4種單糖含量較高，且均由7種單糖組成。

在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，TEPs清除DPPH自由基、·OH、O2-·和ABTS自由基均呈現(xiàn)良好的濃度依賴(lài)關(guān)系，質(zhì)量濃度越大清除率越高。TEPs-1清除DPPH自由基、·OH、O2-·和ABTS自由基的IC50依次為4.26、5.28、4.38、3.94 mg/mL；TEPs-2的IC50依次為2.24、2.48、2.62、2.21 mg/mL。

TEPs 兩個(gè)組分對(duì)MCF-7細(xì)胞均有一定生長(zhǎng)抑制作用，且呈明顯的濃度依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)TEPs濃度為200 μg/mL時(shí)，TEPs-1和TEPs-2的生長(zhǎng)抑制率分別為40.82%和73.45%。此外，TEPs-1和TEPs-2對(duì)MCF-7細(xì)胞的IC50分別為319.76和134.04 μg/mL。