王勝男，趙賀開，邵國強，王冰冶，曲丹妮，劉思怡，何余堂，劉賀

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州，121013)

大豆種皮是大豆產(chǎn)品加工過程中主要的副產(chǎn)物，約占大豆質(zhì)量的6%～8%[1]，具有廉價、果膠和纖維素含量高等特點，常被作為提取多糖及過氧化酶等物質(zhì)的原料[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆種皮多糖(soy hull polysaccharide,SHP)具有良好的功能特性和生物活性[3],其功能特性及生物活性依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu)，利用改性修飾的方法可以提高其功能特性，拓寬應(yīng)用領(lǐng)域[3-4]。果膠類多糖的修飾主要包括物理法、化學(xué)法、酶解法等。BIZMAEK等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，乙基化的纖維素納米顆粒能夠在幾秒內(nèi)吸附至油水界面并顯著降低表面張力，能有效穩(wěn)定水包油型皮克林乳液。王勝男等[7]發(fā)現(xiàn)，微波輔助草酸銨法提取的SHP比熱水提取法具有較好的乳化性能。酶解法具有特異性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于多糖修飾。KIM等[8]用α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶酶解紅參粗多糖，發(fā)現(xiàn)酶解后多糖對腸道免疫系統(tǒng)和巨噬細(xì)胞活性有明顯增強作用。SHP主要由半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和部分蛋白質(zhì)構(gòu)成[9]，利用酶解法對多糖鏈段進行斷裂或修飾蛋白部分可改變多糖結(jié)構(gòu)及功能特性。因此，本文利用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和木瓜蛋白酶對SHP進行酶解處理，通過基本成分、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared,FT-IR)分析，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)對酶解后多糖進行表征，通過粒徑、Zeta電位、乳化活性、乳化穩(wěn)定性及多重光散射分析不同酶酶解前后多糖結(jié)構(gòu)及對乳化性能，為酶解法改性多糖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皮,遼寧錦州大豆皮經(jīng)銷公司；β-半乳糖苷酶(10 000 U/g),上海普育科貿(mào)有限公司;β-葡聚糖酶(10 000 U/g),山東安克生物工程有限公司;木瓜蛋白酶(10 000 U/g),上海麥克林生化科技有限公司；草酸銨、無水乙醇、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS),均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型高速萬能粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；馬弗爐，上海特成機械設(shè)備有限公司；8L-320S型電子天平、UV-2550型紫外分光光度儀，日本島津公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞萊生化儀器廠；BT-9300ST型激光粒度分布儀，丹東市百特儀器有限公司；Nano-ZS90型激光粒度儀，英國馬爾文公司；XE-70原子力顯微鏡，韓國Park Systems公司；L535R型臺式低速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；90 Plus型Zeta電位儀，美國布魯克海文儀器公司；DHR-1型流變儀，美國TA公司；Scitar 2000型傅里葉紅外儀，美國安捷倫科技有限公司；JB-2A恒溫磁力攪拌器，上海雷磁儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 SHP的提取

大豆種皮過篩，將其中豆瓣碎渣除去后，粉碎過60目篩。取大豆種皮200 g于燒杯中，按料液比1∶10(g∶mL)加入1%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液，室溫下攪拌30 min，靜置后用200目雙層紗布過濾，將濾渣放置于65 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干。準(zhǔn)確稱取烘干后的大豆種皮殘渣100 g，按料液比1∶20(g∶mL)加入質(zhì)量濃度6 g/L的草酸銨，再加入95～100 ℃的蒸餾水，在微波85 ℃條件下處理20 min，冷卻靜置后，200目雙層紗布過濾后在3 500 r/min的條件下離心15 min[10]。取上清液蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，用0.01 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.0，緩慢加入雙倍體積的無水乙醇，用玻璃棒進行攪拌，直至多糖完全析出，放置40 min后過濾，將濾渣于65 ℃恒溫干燥箱中烘干，即可得到SHP。

1.3.2 酶解SHP的制備

稱取15.00 g SHP，加入0.10 g β-半乳糖苷酶，調(diào)節(jié)pH至6.7，在水浴鍋中恒溫39 ℃,酶解2 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到β-半乳糖苷酶酶解的多糖(SHP modified by β-galactosidase,GAL)[11]。

稱取15.00 g SHP，加入0.10 g β-葡聚糖酶，調(diào)節(jié)pH至7.5，在水浴鍋中恒溫45 ℃,酶解1.5 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到β-葡聚糖酶酶解的多糖(SHP modified by β-glucanase,GLU)。

稱取10.00 g SHP，根據(jù)木瓜蛋白酶的酶活力，加入0.115 g木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.0，在水浴鍋中恒溫50 ℃,酶解1 h。酶解后95 ℃加熱10 min滅酶活力，再將其倒入干凈托盤中，放置于65 ℃烘箱中烘干，得到木瓜蛋白酶酶解的多糖(SHP modified by papain,PAP)[12]。

1.3.3 基本成分測定

總糖含量：采用苯酚-H2SO4法測定[13]；

蛋白質(zhì)含量：采用酶標(biāo)儀法利用BCA試劑盒測定；

水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》進行測定；

灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》利用分析天平進行測定；

糖醛酸含量：采用H2SO4-咔唑比色法進行測定[14]。

1.3.4 FT-IR測定

采用壓片法，將樣品與KBr按質(zhì)量比為1∶100混合充分研磨，利用模具與壓片機將粉末制成壓片。在樣品測定之前先進行背景掃描去除干擾因素，在400～4 000 cm-1進行紅外光譜掃描。

1.3.5 AFM測定

將SHP、GAL、GLU、PAP分別配制成質(zhì)量濃度5 mg/mL，取5 μL樣品溶液置于新剝離云母片表面，自然干燥后利用AFM測量。

1.3.6 乳液的制備

將大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)配制成4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水溶液，取80 mL與20 mL大豆油混合，在8 000 r/min的高速分散均質(zhì)機下剪切2 min，得到初級乳狀液。再將SHP、GAL、GLU、PAP分別配制成0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水溶液100 mL，并進行磁力攪拌使其充分溶解后，與初級乳狀液混合，利用高速分散均質(zhì)機在8 000 r/min下剪切2 min進行粗均質(zhì)，再使用高壓均質(zhì)機在50 MPa下均質(zhì)3 min，最終使乳狀液包含2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SPI、10%(體積分?jǐn)?shù))油和0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酶解大豆種皮多糖。再加入0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))疊氮化鈉抑制微生物的生長，并將制得的乳狀液在4 ℃下避光保存。以未添加多糖，添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大豆分離蛋白乳狀液(SPI emulsion,SPIE)為對照組，其余4組添加不同多糖配制的乳狀液簡寫為β-半乳糖苷酶酶解多糖乳液(GAL emulsion，GALE)、β-葡聚糖酶酶解多糖乳液(GLU emulsion，GLUE)、木瓜蛋白酶(PAP emulsion，PAPE)和大豆種皮多糖乳液(SHP emulsion，SHPE)。

1.3.7 乳化活性和乳化穩(wěn)定性的測定

乳化性的測定參考MOLINA等[15]的方法，將大豆多糖-大豆分離蛋白復(fù)合乳液用質(zhì)量濃度1 g/L SDS溶液稀釋1 000倍。在波長500 nm條件下，用紫外分光光度計測定吸光值A(chǔ)0，計算乳化活性指數(shù)(emulsifying activity index,EAI)。靜置30 min后測定吸光值A(chǔ)30，計算乳化穩(wěn)定性(emulsiflying stability index,ESI)。

1.3.8 乳液粒徑分布與Zeta電位的測定

利用BT-9300ST激光粒度分布儀測定乳狀液的粒度分布情況，測定前需攪拌溶液，使其溶液內(nèi)分子分布均勻，并記錄中位徑(D50)、表面積分?jǐn)?shù)平均粒徑(D3,2)及體積分?jǐn)?shù)平均粒徑(D4,3)[16]。利用NANO ZS90激光粒度分布儀在室溫下測定乳狀液Zeta電位。

1.3.9 流變性質(zhì)的測定

采用DHR-1流變儀測定，取1.5 mL乳狀液加在測試臺上，狹縫距離設(shè)置為0.5 mm，剪切速率0～100 s-1，檢測樣品流變特性。

1.3.10 多重光散射的測定

將20 mL樣品裝進樣品瓶，確保沒有氣泡，多重光散射儀掃描，1 min掃描1次，掃描30 min。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，檢驗標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解大豆種皮多糖組成成分及結(jié)構(gòu)

酶解后大豆種皮多糖組成成分見表1。β-半乳糖苷酶水解β-半乳糖苷鍵，β-葡聚糖酶水解β-1,3和β-1,4糖苷鍵，而木瓜蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)。4種多糖的總糖含量差異不顯著(P>0.05)，GAL總糖含量最高為(46.96±8.36)%。3種酶解多糖的糖醛酸含量差異顯著(P<0.05)，GAL與GLU糖醛酸含量顯著增加(P<0.05)，原因可能為2種酶將SHP分解為小分子低聚糖；而PAP糖醛酸含量顯著降低(P<0.05)，可能是木瓜蛋白酶將多糖中蛋白質(zhì)分解為小分子多肽，引起多肽和糖醛酸間相互作用。酶解后的多糖水分含量較SHP高，可能是多糖經(jīng)酶解后吸濕性發(fā)生改變。

表1 基本組成成分 單位：%

圖1 四種大豆種皮多糖的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 FT-IR of four soy hull polysaccharides

2.2 AFM分析

SHP、GAL、GLU和PAP的AFM圖見圖2。由圖2可知，4種多糖在云母片上形成不均勻的薄膜，由塊狀多糖聚集體與顆粒組成。GAL(圖2-a)與GLU(圖2-b)的聚集體尺寸比SHP小，小顆粒明顯增多，原因可能是GAL與GLU含有較多的糖醛酸，糖醛酸中羧基或羧基陰離子上強電負(fù)性氧原子與糖鏈中氫原子形成氫鍵所致[20]。由圖2-a可知，GAL擁有較多的糖鏈分支結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致多糖聚集體較其他多糖多，可能造成多糖支鏈靈活性降低進而影響多糖乳化性能。PAP(圖2-c)聚集體較大，原因可能是較大的電負(fù)性與帶負(fù)電荷云母之間產(chǎn)生較大排斥力所致。

a-GAL;b-GLU;c-PAP;d-SHP圖2 四種大豆種皮多糖的原子力顯微鏡圖Fig.2 Atomic force microscope of four soy hull polysaccharides

2.3 乳液粒徑分布與Zeta電位

5種乳液的平均粒徑及粒徑分布如表2和圖3所示。由表2可知，與SHPE、SPIE相比，GALE與GLUE平均粒徑均顯著減小(P<0.05)，PAPE則無顯著差別(P>0.05)，說明GAL和GLU所形成的蛋白乳狀液較穩(wěn)定。結(jié)合圖3可知，GALE、PAPE、SHPE和SPIE均呈現(xiàn)單峰，為單分散體系，而GLUE呈現(xiàn)雙峰分布，為多分散體系。GALE和GLUE液滴均朝粒徑變小方向移動，峰值高且分布集中，乳化液穩(wěn)定性較好，而PAPE、SHPE、SPIE粒徑分布基本一致，峰值低且粒徑分布范圍較寬，粒徑較大液滴占主要部分，可見GALE和GLUE乳化能力較強。

由表2可知，5種乳液均帶負(fù)電荷，GALE與GLUE電位絕對值較小，分別為(-2.40±0.44)和(-2.88±0.60)mV，液滴之間的斥力較小，乳狀液的穩(wěn)定性較差，PAPE電位變化明顯[(-29.1±2.59)mV]且電位絕對值最大(P<0.05)，液滴之間的斥力較大不易聚集，乳狀液穩(wěn)定性好。這種現(xiàn)象可能由于木瓜蛋白酶對SHP中蛋白質(zhì)酶解作用，多糖中帶負(fù)電荷基團的暴露和帶正電荷蛋白質(zhì)的酶解從而引起PAPE電位顯著變化。SHP在油水界面與SPI發(fā)生微弱相互作用導(dǎo)致GALE、GLUE、SHPE電位絕對值較SPIE有所降低。

表2 乳狀液粒徑、Zeta電位、乳化活性及乳化穩(wěn)定性Table 2 Particle size,Zeta potential,emulsifying active and emulsifying stability value of emulsion

圖3 乳狀液粒徑分布圖Fig.3 Normal distribution of emulsion particle size

2.4 乳液乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性和乳化穩(wěn)定性是直接反映乳狀液特性的重要指標(biāo)。5種乳液的EAI和ESI如表2所示。SPIE乳化穩(wěn)定性最差,其ESI值為2 186.34 min，添加4種多糖后GALE的EAI及ESI值變化最小，分別為31.27 m2/g 和2 482.05 min，而GLUE乳化活性及乳化穩(wěn)定性最好，分別為39.72 m2/g和4 198.11 min。原因可能是GAL的總糖和蛋白質(zhì)含量最高，液滴表面蛋白質(zhì)多糖復(fù)合保護層較其他3種乳狀液厚，隨時間延長不易破損，所以提高了乳化活性與乳化穩(wěn)定性。SHP中半乳糖含量占27.26%并含有聚半乳糖，經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解后斷裂了β-半乳糖苷鍵形成了較多的低聚糖，導(dǎo)致GALE乳化活性及乳化穩(wěn)定性均較低。

2.5 乳液流變性性質(zhì)

圖4-a和圖4-b分別表示剪切速率對剪切應(yīng)力和黏度的影響。由圖4-a可知，隨剪切速率的增加乳狀液剪切應(yīng)力依次增大，其中PAPE的剪切應(yīng)力最大，其次是SHPE、GALE、GLUE和SPIE。5種乳液剪切速率0.1～100 s-1間均呈現(xiàn)剪切變稀現(xiàn)象，PAPE變化顯著說明多糖促進乳液抗絮凝作用較好。由圖4-b可知，GALE，GLUE和SPIE黏度變化較小，結(jié)合2.3與2.4分析可知，GALE粒徑小、分布窄造成黏度變化緩慢，而GLUE與SPIE由于乳化穩(wěn)定性較好，單個液滴不易分散成小液滴導(dǎo)致黏度下降遲緩。

a-剪切應(yīng)力;b-黏度圖4 乳液的流變學(xué)性質(zhì)Fig.4 Rheology property of emulsions

2.6 多重光散射

乳狀液在放置過程中，液滴在重力和布朗運動作用下相互碰撞，導(dǎo)致出現(xiàn)分層、絮凝、聚集等失穩(wěn)現(xiàn)象。多重光散射技術(shù)可以對流體穩(wěn)定性做出快速、有效的評價[21]。圖5為5種乳液在14 d Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)(turbiscan stability index,TSI)的變化趨勢圖，TSI 穩(wěn)定系數(shù)越小、斜率越小，表明乳液越穩(wěn)定。如圖5所示，初始乳液在掃描時間30 min內(nèi)TSI值均在0.5左右，說明初始乳狀液穩(wěn)定性能較好。隨貯藏時間的延長，儲存7 d后 SPIE的TSI值增大，而多糖乳狀液的TSI值變化不大，但SHPE乳液穩(wěn)定性較GLUE與GALE差。儲存14 d后SPIE出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未測定TSI值。添加酶改性多糖乳狀液中PAPE的TSI值在30 min內(nèi)增至0.72，GALE、GLUE和SHPE的TSI值略有升高但最終保持在0.5左右，SHPE在0～10 min上升趨勢較GLUE和GALE快，穩(wěn)定性略差。

a-初始樣品；b-7 d樣品；c-14 d樣品圖5 貯藏時間對TSI的影響Fig.5 The influence of storage time on TSI

3 結(jié)論

本研究采用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、木瓜蛋白酶處理SHP，發(fā)現(xiàn)酶改性后多糖的組成、結(jié)構(gòu)、分子鏈形貌差異顯著，其中PAP的結(jié)構(gòu)變化較大。研究發(fā)現(xiàn)，酶改性多糖的乳化能力均提高。同時，添加不同酶改性可以提高乳液的穩(wěn)定性，其中GALE與GLUE粒徑較小且分布均勻，同時黏度與剪切應(yīng)力隨剪切速率增大變化較小，TSI值隨貯藏時間的延長變化不大，證明經(jīng)β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶處理的SHP可有效增強乳液穩(wěn)定性。因此，可利用β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶改性提高SHP的乳化能力。