田康明，趙繼華，牛丹丹*，Nokuthula Peace MCHUNU，王彩喆，王正祥,

1(天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，天津， 300457) 2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津， 300457) 3(Biotechnology Platform,Agricultural Research Council,Pretoria 0001,South Africa)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23)，是一類催化乳糖水解形成葡萄糖和半乳糖或通過其轉(zhuǎn)苷作用形成半乳糖苷低聚糖的酶分子，因其作用的天然底物為乳糖，故常被稱為乳糖酶(lactase)。已有研究表明，絕大多數(shù)已經(jīng)鑒定的乳糖酶表現(xiàn)為水解活性，即水解乳糖等天然底物為單糖[1-2]；通過改變反應(yīng)環(huán)境條件，部分酶分子可以呈現(xiàn)轉(zhuǎn)半乳糖基活性，在酶作用于乳糖分子形成酶-底物復(fù)合物后，釋放乳糖分子中的葡萄糖并將半乳糖分子以乳糖中的半乳糖基為接受體，形成半乳糖聚合物，即低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，GOS)[3-5]。

現(xiàn)有研究結(jié)果表明，GOS可有效刺激腸道有益微生物增殖，有助于維持腸道微生態(tài)健康，故為現(xiàn)今益生元的重要組成。采用水解活性低而轉(zhuǎn)苷活性高的乳糖酶，以乳糖為原料，通過酶法催化將乳糖中的半乳糖基通過酶的糖基轉(zhuǎn)移作用生成半乳二糖、半乳三糖、半乳四糖等低聚糖，是現(xiàn)階段工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方式[6-9]。因此，具有高半乳糖基轉(zhuǎn)移活性的乳糖酶，是促進(jìn)GOS生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新的關(guān)鍵所在。

由于缺乏高轉(zhuǎn)苷活性的乳糖酶酶制劑，我國(guó)GOS制造水平提高幅度有限，GOS產(chǎn)品缺乏市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。我們?cè)谇捌谘芯恐?，通過對(duì)微生物資源庫(kù)的篩選，獲得了具有較好轉(zhuǎn)半乳糖基活性的乳糖酶產(chǎn)生菌BacilluscirculansB2301，其生成的乳糖酶具有催化乳糖底物形成較高比例的低聚半乳糖的能力[10]。為此，本研究通過基因克隆技術(shù)獲得了其編碼基因及其重組酶，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了解析，為后續(xù)針對(duì)此酶的高效表達(dá)、制備與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

環(huán)狀芽胞桿菌(Bacilluscirculans)B2301為本實(shí)驗(yàn)室前期分離、鑒定與保藏[10]，用于本研究的基因供體；pET28a質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保藏，用于β-半乳糖苷酶編碼基因的克隆；大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)為本實(shí)驗(yàn)室保藏，用于基因克隆宿主；表達(dá)載體pND113[11]和枯草桿菌(Bacillussubtilis)WB600為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建或保藏，用于基因的分泌表達(dá)。Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母膏5 g/L，pH 7.0)用于上述菌株的培養(yǎng)，必要時(shí)在培養(yǎng)基中補(bǔ)加20 mg/L卡那霉素。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1B.circulans基因組DNA的提取

B.circulansB2301基因組DNA的提取，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[12]。將B.circulansB2301在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收獲100 mg(濕質(zhì)量)菌體；用0.5 mL裂解液(0.1 mg/mL溶菌酶、5 mg/mL SDS、0.1 mg/mL蛋白酶K)懸浮并在45℃下孵育4～8 h；用等體積苯酚-氯仿抽提3～5次，上清液用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇沉淀，離心收獲基因組DNA，溶于5 mmol/L EDTA緩沖液(pH 8.0)中，備用。

1.2.2 乳糖酶編碼基因的克隆

DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒DNA的提取，采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法[12]。乳糖酶編碼基因的克隆，采用鳥槍克隆術(shù)[13]。將上述獲得的基因組DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3 AI部分酶切后，通過蔗糖密度梯度離心法收集8～10 kb大小的DNA片段；通過體外連接克隆入pET28a載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，收獲轉(zhuǎn)化子并分裝保藏；將轉(zhuǎn)化子混合保藏物適當(dāng)稀釋后，涂布于補(bǔ)加0.1 mg/mL X-gal(上海生工)的LB培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑取呈現(xiàn)藍(lán)色的菌落并進(jìn)一步劃線、分離、純化與保藏；提取其中的質(zhì)粒DNA，通過Sanger法進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

1.2.3 乳糖酶編碼基因的截短與表達(dá)

1.2.4 乳糖酶的制備與純化

表達(dá)乳糖酶的重組枯草桿菌在含50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、220 r/min搖瓶發(fā)酵72 h，離心收集上清液獲得粗酶液，進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)AKTA Pure M(GE，瑞典)進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)濃度按照Bradford方法測(cè)定，以牛血清白蛋白為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)參照[14]。

1.2.5 乳糖酶酶活力測(cè)定

按照GB/T 33409—2016《β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)方法分光光度法》[15]并參考文獻(xiàn)[16-17]方法進(jìn)行改進(jìn)。反應(yīng)在pH 5.0和40 ℃下進(jìn)行，以2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG，Sigma)或乳糖為底物。采用ONPG為底物時(shí)，在波長(zhǎng)420 nm下測(cè)定2-硝基苯的釋放量；以乳糖為底物時(shí)，以生物傳感儀測(cè)定葡萄糖的釋放量。乳糖酶的酶活力定義為：在pH 5.0和40 ℃下，每1 min分解ONPG生成1 μmol 2-硝基苯或分解乳糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

最適作用溫度：將酶液用緩沖液(醋酸鈉緩沖液，pH 4.0～6.0；磷酸緩沖液，pH 6.5～7.5；Tris-HCl，pH 8.0～9.0)適當(dāng)稀釋，在pH 7.0條件下，分別于不同溫度(30～80 ℃)下反應(yīng)，以酶活力最高時(shí)的溫度計(jì)為其最適作用溫度。

熱穩(wěn)定性：將酶液分別在不同溫度(30～80 ℃)下保溫1 h，取樣置冰浴中30 min后，測(cè)定剩余酶活力，以4 ℃條件下保存的待測(cè)酶酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)殘余酶活力。

最適作用pH：最適pH確定在pH 3.0～9.0的緩沖液(醋酸鈉緩沖液，pH 3.0～6.0；磷酸緩沖液，pH 6.5～7.5；Tris-HCl緩沖液，pH 8.0～9.0)中進(jìn)行，以酶活力最高時(shí)的pH計(jì)為其最適作用pH。

pH穩(wěn)定性：將酶液適當(dāng)稀釋后分別于pH 3.0～9.0的緩沖液中，在50 ℃條件下保溫1 h，在上述酶活力測(cè)定條件下測(cè)定樣本的剩余酶活力，以未保溫處理的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)殘余酶活力。

金屬離子與化學(xué)品對(duì)酶活力的影響：在已確定的最優(yōu)酶反應(yīng)條件下，分別向反應(yīng)體系中加入不同金屬離子或化學(xué)物質(zhì)，至終濃度為5 mmol/L，測(cè)定酶活力，以未加金屬離子或化學(xué)物質(zhì)的原酶液酶活力為100%，考察金屬離子及化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶活力的影響。

1.2.7 酶促動(dòng)力學(xué)分析

乳糖酶酶促合成GOS的動(dòng)力學(xué)分析，采用文獻(xiàn)[18]方法。在不同乳糖質(zhì)量濃度(300或400 g/L)和不同溫度(50和55 ℃)下，于20 mL反應(yīng)體系中進(jìn)行，乳糖酶添加量為15 U/g，反應(yīng)時(shí)間1 h。采用OriginPro 8 軟件包進(jìn)行Lineweaver-Burk非線性回歸計(jì)算出酶的Km和Vmax。反應(yīng)體系中各組分分析，采用HPLC法[10,19]。

1.2.8 底物特異性

分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及淀粉為底物，反應(yīng)體系中含有200 g/L不同的底物，在pH 6.0和60 ℃條件下反應(yīng)12 h，沸水浴10 min滅酶活力，用HPLC法分析產(chǎn)物[10,19]。

1.2.9 生物信息學(xué)分析

用DNASTAR分析DNA、氨基酸序列，氨基酸序列同源性用DNASTAR和ClustalW(https://www.genome.jp/tools-binDNASTAR/clustalw)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳥槍克隆法獲得編碼乳糖酶的編碼基因

B.circulansB2301合成的乳糖酶，具有很高的半乳糖基轉(zhuǎn)移活性[10]。為了克隆其乳糖酶編碼基因，在查閱B.circulansNBRC 13626基因組序列后，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物并以B.circulansB2301基因組DNA為模板，進(jìn)行乳糖酶編碼基因擴(kuò)增，但未成功；再通過制備發(fā)酵液對(duì)其乳糖酶進(jìn)行純化，也未獲得理想的蛋白條帶，通過蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)未能獲得其特征性寡肽序列。鑒于此，本研究采用鳥槍克隆法對(duì)其乳糖酶編碼基因進(jìn)行克隆。

提取B.circulansB2301基因組DNA，用Sau3 AI進(jìn)行部分酶切并克隆入pET28a的BamH I酶切位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，收集轉(zhuǎn)化子稀釋105倍，混合后分裝保藏。將文庫(kù)適當(dāng)稀釋后涂布含有X-gal的LB培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)24 h后獲得了能夠分解X-gal使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色的陽(yáng)性克隆GOS-236。提取純化其中的質(zhì)粒pET-gos236，通過雙脫氧核苷鏈終止法對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定與分析，確定此克隆中含有一個(gè)完整開放閱讀框架，命名為bglBc，大小為5 133 bp，編碼1 710個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為189.4 kDa。BglBc氨基酸序列與來源于B.circulansATCC 31382的β-半乳糖苷酶(BAJ61032)[20]相似程度最高，序列一致性為93.6%，與Bacillusmesonaeβ-半乳糖苷酶(A0A3Q9QYB9)在序列上也有較高的一致性(87.4%)；與Paraliobacillussp.(A0A0U1KN21)、Paenibacillusantarcticus(A0A168PKG3)、Paenibacillusnanensis(A0A3A1V1H0)和Paenibacilluspini(W7YDH9)的序列一致性分別為63.7%、62.0%、60.4%和60.3%，與其他來源的β-半乳糖苷酶相似度較低(圖1)。此外，此基因所編碼的氨基酸序列中不含典型信號(hào)肽序列，與已報(bào)道的B.circulansATCC 31382的β-半乳糖苷酶有所不同，后者被認(rèn)為具有一個(gè)由35個(gè)氨基酸殘基組成的Sec信號(hào)肽[21]。

圖1 BglBc與其他β-半乳糖苷酶的相關(guān)關(guān)系Fig.1 Relationship between BglBc and other β-galactosidases

與B.circulansATCC 31382的β-半乳糖苷酶的催化活性位點(diǎn)(Glu447、Tyr511和Glu532)相同，BglBC中的Glu420、Tyr483和Glu503殘基組成其催化活性中心，其中2個(gè)谷氨酸殘基(Glu420和Glu503)組成其酸/堿和親核催化作用[21]。進(jìn)一步對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，BglBc中含有9個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中近N端的4個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成與β-半乳糖苷酶LacZ功能域結(jié)構(gòu)一致[20-21]。

2.2 截短BglBc具有催化乳糖合成GOS的活性

前人對(duì)B.circulansATCC 31382 β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)功能相關(guān)關(guān)系解析研究中發(fā)現(xiàn)，其近N端811個(gè)氨基酸殘基組成的LacZ功能域，具有完整的β-半乳糖苷酶活性[20-22]。鑒于本研究克隆獲得的BglBc具有與菌株ATCC 31382 β-半乳糖苷酶相似結(jié)構(gòu)，本研究對(duì)其近N端782個(gè)氨基酸殘基組成的功能域(BglD)在枯草桿菌WB600中成功分泌表達(dá)，表達(dá)酶活力達(dá)2.9 U/mL。進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵上清酶液進(jìn)行分離純化，獲得在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上呈現(xiàn)單一條帶的純酶樣品(圖2)。

M-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品；1-純化后的BglD圖2 純化乳糖酶BglD的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE profile of the purified BglD

進(jìn)一步確定了重組BglD的GOS合成能力，該酶催化乳糖轉(zhuǎn)化為GOS的最高轉(zhuǎn)化率達(dá)52.5%(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，與從B.circulansB2301制備的野生型乳糖酶催化合成GOS的性能相同[10]?？梢?，從B.circulansB2301成功克隆出的乳糖酶編碼基因bglBc的截短序列bglD仍然保留了原酶分子催化合成GOS的活性。后續(xù)對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.3 重組BglD的酶學(xué)性質(zhì)分析

進(jìn)一步對(duì)純化的BglD酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果匯總于圖3和表1。

a-最適作用溫度;b-熱穩(wěn)定性;c-最適作用pH;d-pH穩(wěn)定性圖3 乳糖酶的最適作用溫度和pH及其穩(wěn)定性 Fig.3 Optimal temperature and pH of BglD and its thermo- and pH stability

表1 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions and chemicals on theenzymatic activity

以合成底物ONPG為底物時(shí)，乳糖酶BglD的最適作用溫度為50 ℃、最適作用pH為6.0～6.5；以天然底物乳糖為底物時(shí)，其最適作用溫度為60 ℃、最適作用pH為6.0～6.5(圖3-a、3-c)。此酶在50 ℃以下和pH 5.5～7.0之間具有較好的穩(wěn)定性(圖3-b、3-d)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，作用于天然底物乳糖，BglD的最適作用溫度更高，但最適作用pH沒有顯著差異，不同底物對(duì)其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也沒有顯著影響(圖3)；BglD的最適作用溫度略低于B.circulansATCC 31382的乳糖酶BglD-D[22]。

進(jìn)一步以乳糖為底物，考察其在GOS的酶促合成中的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明，該酶在55 ℃下的Vmax為2.47 g/(L·h)，Km為14.37 g/L。與已報(bào)道的KluyveromycesmarxianusIMB3和Rhizomucorsp.乳糖酶對(duì)乳糖的Km值分別為7.2[23]和9.0 g/L[24]相比，BglD對(duì)天然底物乳糖的親和力相對(duì)較低。

金屬離子與化合物對(duì)酶活力的影響，如表1所示。由表1可知，Zn2+、Fe2+、Cu2+、EDTA、SDS對(duì)重組酶表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，未發(fā)現(xiàn)對(duì)重組酶有促進(jìn)作用的離子。

2.4 重組乳糖酶酶活對(duì)乳糖具有專一性

分別以乳糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及淀粉為底物，反應(yīng)體系中含有質(zhì)量濃度為200 g/L的不同底物，在pH 6.0、60 ℃條件下反應(yīng)12 h，沸水浴10 min滅酶活力，然后進(jìn)行高效液相色譜儀分析，結(jié)果匯總于表2。重組乳糖酶BglD對(duì)乳糖表現(xiàn)出轉(zhuǎn)苷活性，對(duì)ONPG只有水解活性而沒有轉(zhuǎn)苷活性，對(duì)其他測(cè)試底物則未表現(xiàn)出任何活性。

表2 BglD的底物特異性Table 2 Substrate specificity of BglD

3 結(jié)論

通過基因克隆技術(shù)，成功克隆出B.circulansB2301乳糖酶編碼基因，其編碼的截短序列同樣具有較好的低聚半乳糖合成生化性能。