覃璐琪，梁曉琳，潘海博，莫明規(guī)，饒川艷，聶夢(mèng)琳，梅麗華，李全陽(yáng)*

1(廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧,500004) 2(柳州市康小樂(lè)牛奶有限公司，廣西 柳州,545007)

益生菌是攝入一定量后，能對(duì)人體產(chǎn)生確切健康功效的一類(lèi)有益活性微生物的總稱[1]。益生菌能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體中的神經(jīng)傳遞介質(zhì)來(lái)預(yù)防老年癡呆癥等病理性衰老[2-3]，其特有的胞外蛋白酶、肽酶通過(guò)水解作用，將食物蛋白中具有降壓作用的肽片段釋放，達(dá)到降血壓效果[4-5]。同時(shí)，益生菌自身也可通過(guò)分泌具有抗菌、抗炎特性的次級(jí)代謝產(chǎn)物和激活免疫細(xì)胞等多種方式，促進(jìn)宿主腸道菌群健康、提高免疫力[6-7]。隨著對(duì)益生菌認(rèn)識(shí)的不斷深入，益生菌在多個(gè)領(lǐng)域尤其是在食品中被廣泛研究、應(yīng)用。目前，常見(jiàn)的益生菌載體主要有微膠囊[8]、豆乳[9]、發(fā)酵乳[10]以及果蔬汁飲料[11]等，而發(fā)酵乳作為益生菌良好的來(lái)源和絕佳的載體，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的口感受到眾多消費(fèi)者的青睞[12]。因此，近年來(lái)市場(chǎng)上的發(fā)酵乳產(chǎn)品種類(lèi)不斷增加，其中不乏含有添加多種益生菌的發(fā)酵乳制品[13-14]。有研究表明[15-16]，多種益生菌混合制備的發(fā)酵乳不僅發(fā)酵速度快、風(fēng)味佳，其抗氧化能力、抑菌能力更優(yōu)于單一益生菌發(fā)酵乳。而復(fù)合益生菌發(fā)酵乳效果雖好，但這些益生菌相近的生理生化特征使其在同一載體中很難區(qū)分[17]。為了克服這一缺陷，有研究在培養(yǎng)基中添加抗生素類(lèi)抑菌物質(zhì)對(duì)目的菌株進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)[18]。但同時(shí)有報(bào)道稱，添加的抑菌物質(zhì)同樣會(huì)抑制目的菌株正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏低[19]。我國(guó)目前并無(wú)明確的益生菌發(fā)酵乳生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)發(fā)酵乳中益生菌數(shù)量尚無(wú)明確規(guī)定。不夠完善的市場(chǎng)監(jiān)管體系和技術(shù)上的困難，造成了市場(chǎng)上該類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量參次不齊的現(xiàn)象。產(chǎn)品包裝雖然標(biāo)識(shí)含有高菌量益生菌，但有無(wú)添加、數(shù)量是否達(dá)標(biāo)，都是廠家自說(shuō)自話。為防止此類(lèi)現(xiàn)象的發(fā)生，建立一種科學(xué)合理地對(duì)混合菌株發(fā)酵乳中益生菌定性、定量的檢測(cè)方法具有重要意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用分子生物學(xué)手段快速鑒定物種的研究越來(lái)越多[20-22]。其中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qualitative real time polymerase chain reaction，QPCR)[23]因其高特異性、無(wú)污染性的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中，也逐漸應(yīng)用至益生菌檢測(cè)領(lǐng)域。因此，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)干酪乳桿菌LTL1361和羅伊氏乳桿菌LTR1318的種屬特異性引物，建立發(fā)酵乳中干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，以期能夠?yàn)橐嫔旌习l(fā)酵相關(guān)制品中菌株的定性、定量檢測(cè)提供新的計(jì)量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LTL1361、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)LTR1318分離純化自廣西巴馬瑤族自治縣一位身體健康、年齡超百歲的老人的糞便，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。保藏號(hào)：干酪乳桿菌LTL1361：CCTCC M 2019018，羅伊氏乳桿菌LTR1318：CCTCC M 2019017。大腸桿菌DH5α，本實(shí)驗(yàn)室保藏；載體pucm-T、T4 DNA Ligase、Taq酶、Wide Range DNA Marker，TaKaRa公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒、SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(LightCycler?96)，Roche公司；Infinite MP200連續(xù)波長(zhǎng)多功能微孔檢測(cè)器，瑞士TECAN；BIO-RAD伯樂(lè)凝膠成像儀、BIO-RAD電泳儀、梯度PCR儀，MJ Bio Rad。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌及樣品DNA的提取

干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318按照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》[24]培養(yǎng)后，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

益生菌發(fā)酵乳DNA的提取，參考吳燕濤等[25]方法并改進(jìn)：稱取100 mg發(fā)酵乳于2 mL離心管，加入750 μL去離子水、100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)18% 檸檬酸鈉和50 μL 1 mol/L NaOH，4 ℃ 2 000 r /min 離心5 min，棄上清液，保留沉淀。向沉淀中加入200 μL溶菌酶，37 ℃孵育1 h，再使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取益生菌DNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)

從Genbank中分別下載干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌不同菌株及其他乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)株的16S rDNA序列，然后利用DNA Star中MegAlign進(jìn)行序列比對(duì)，尋找種內(nèi)保守區(qū)域，利用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。并通過(guò)GenBank中Blast檢測(cè)引物特異性，獲得干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的種屬特異性引物。引物序列如下,干酪乳桿菌 F:5′-GATGATGTTGGGGATTTTGCG - 3′，R:5′-TATCATAAACCGGGAGATCCCA-3′;擴(kuò)增片段為149 bp。羅伊氏乳桿菌 F:5′-GCGTTGATGTTGTTGAAGGAATGAGCTTTG-3′，R:5′-CATCAGCAATGATTAAGAGAGCACGGCC-3′;擴(kuò)增片段為200 bp。引物均由北京擎科生物有限公司合成。

1.2.3 PCR反應(yīng)條件

普通PCR:反應(yīng)體系包括12.5 μL TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye，10 μmol/L上下游引物各1 μL，去離子水補(bǔ)齊至20 μL，每個(gè)體系中再添加2 μL DNA模板。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 12 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法：取5 μL PCR產(chǎn)物，使用質(zhì)量濃度10 g/L瓊脂糖凝膠和1×TE緩沖液中電泳30 min,電壓100 V,然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR:實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 引物特異性的驗(yàn)證

分別提取隨機(jī)抽查的市售樣品1、樣品2、樣品3及自制益生菌發(fā)酵乳(干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318及傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵)的DNA作為PCR反應(yīng)模板，利用1.2.2中設(shè)計(jì)合成的種屬特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，普通PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均按照1.2.3中所述條件進(jìn)行，同時(shí)將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量濃度10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318的16S rDNA基因克隆

采用細(xì)菌DNA提取試劑盒分別提取干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318的基因組DNA。并以基因組DNA作為 PCR反應(yīng)模板擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后與pucm-T連接并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)PCR鑒定并送去生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，檢測(cè)正確獲得的陽(yáng)性克隆子分別命名為puc-LTL1361、LTR1318。

1.2.6 外標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品puc-LTL1361、LTR1318 DNA，酶標(biāo)儀測(cè)定A值后，按照公式(1)計(jì)算出拷貝數(shù)并做10倍系列稀釋?zhuān)瑢⒉煌瑵舛葮?biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)：

(1)

式中：K，拷貝數(shù)，copies/mL；ρ，標(biāo)準(zhǔn)品濃度，g/mL；MW為相對(duì)分子質(zhì)量，dolton。

以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，為待測(cè)樣品提供定量檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)。并通過(guò)使用曲線的斜率以及應(yīng)用公式(2)來(lái)確定擴(kuò)增效率：

(2)

式中，E表示擴(kuò)增效率；slope表示斜率。

1.2.7 不同濃度益生菌的檢測(cè)

為驗(yàn)證建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法是否可以在實(shí)際樣品中進(jìn)行檢測(cè)以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)利用平板計(jì)數(shù)法和熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)不同濃度益生菌進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行比較。分別將干酪乳桿菌LTL1361和羅伊氏乳桿菌LTR1318培養(yǎng)至1010CFU/mL，再以10倍梯度法稀釋菌液濃度至1010～10 CFU/mL作為待檢樣品，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

使用GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌計(jì)數(shù)》[24]對(duì)乳桿菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，參考RAVULA等[26]的方法使用LC瓊脂培養(yǎng)基對(duì)干酪乳桿菌計(jì)數(shù)，羅伊氏乳桿菌計(jì)數(shù)為兩者相減后所得。

熒光定量PCR檢測(cè)：分別提取不同濃度菌液核酸，并以該核酸為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.8 實(shí)際市售樣品的檢測(cè)

按建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)隨機(jī)抽查的市售樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。同時(shí)對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)特異性及熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)與圖像處理方法

采用LightCycler?96 SW1.1軟件進(jìn)行熒光定量PCR圖譜解析；采用GraphPad Prism 8用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1-a可知,泳道1、2分別在149 bp大小處得到單一條帶，其大小與目的片段相同；由圖1-b可知,泳道1、2分別在200 bp大小處得到單一條帶，其大小與目的片段相同；同時(shí)將puc-LTL1361、puc-LTR1318測(cè)序結(jié)果與目的片段基因序列對(duì)比，得到結(jié)果完全一致。上述結(jié)果表明：陽(yáng)性克隆子puc-LTL1361及LTR1318構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M-marker DL500；a：1和2-puc-LTL1361；b：1和2-LTR1318；a-puc-LTL1361標(biāo)準(zhǔn)品鑒定;b-puc-LTR1318標(biāo)準(zhǔn)品鑒定圖1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR identification results of plasmid standard

2.2 引物特異性驗(yàn)證

如圖2所示，使用1.2.2中設(shè)計(jì)的干酪乳桿菌特異性引物對(duì)市售樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。結(jié)果表明，泳道2、泳道3在149 bp處未出現(xiàn)特征條帶，結(jié)果顯示為陰性，表明樣品1、樣品2不含干酪乳桿菌；泳道4、泳道5分別在149 bp處出現(xiàn)特征條帶，與泳道6陽(yáng)性對(duì)照一致，表明樣品3及泳道5自制益生菌發(fā)酵乳中含有干酪乳桿菌。根據(jù)樣品標(biāo)簽信息標(biāo)識(shí)：市售樣品1、樣品2中僅含嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌，樣品3含有干酪乳桿菌，自制益生菌發(fā)酵乳中含有干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌及傳統(tǒng)發(fā)酵劑。使用該引物擴(kuò)增，僅能特異性擴(kuò)增出含有干酪乳桿菌基因片段樣品，說(shuō)明引物特異性良好，能夠?qū)悠分械母衫胰闂U菌準(zhǔn)確定性檢測(cè)。

M-Marker DL500;1-陰性對(duì)照；2-樣品1; 3-樣品2; 4-樣品3;5-自制益生菌發(fā)酵乳；6-LTL1361圖2 樣品中干酪乳桿菌的定性檢測(cè)Fig.2 Qualitative detection of L. casei in samples

如圖3所示，使用1.2.2中設(shè)計(jì)的羅伊氏乳桿菌特異性引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。結(jié)果表明，泳道2、泳道3在200 bp處未出現(xiàn)特征條帶，結(jié)果顯示為陰性，表明樣品1、樣品2、樣品3中不含羅伊氏乳桿菌；泳道5在 200 bp大小處出現(xiàn)特征條帶，與泳道6陽(yáng)性對(duì)照一致，表明泳道5自制益生菌發(fā)酵乳中含有羅伊氏乳桿菌。根據(jù)樣品標(biāo)簽信息，使用該引物擴(kuò)增，僅能特異性擴(kuò)增出含有羅伊氏乳桿菌基因片段樣品，說(shuō)明引物特異性良好，能夠?qū)悠分械牧_伊氏乳桿菌準(zhǔn)確定性檢測(cè)。

M-Marker DL500;1-陰性對(duì)照；2-樣品1；3-樣品2；4-樣品3；5-自制益生菌發(fā)酵乳；6-LTR1318圖3 樣品中羅伊氏乳桿菌的定性檢測(cè)Fig.3 Qualitative detection of L. reuteri in samples

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，以熒光定量PCR反應(yīng)過(guò)程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.264x+38.604，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 9，擴(kuò)增效率102%；羅伊氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.363x+40.594，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 7，擴(kuò)增效率98%。上述結(jié)果表明,所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上，擴(kuò)增效率在90%～110%，均符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量要求，可對(duì)待檢測(cè)樣品初始濃度進(jìn)行精確定量。

2.4 不同濃度益生菌的檢測(cè)

利用熒光定量PCR檢測(cè)方法測(cè)定不同菌液Ct值并代入2.3所建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算得到PCR檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)使用平板培養(yǎng)法對(duì)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，所得結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果的比較Table 1 Comparison of fluorescence quantitative PCR test results and plate count results

由表1可知，當(dāng)菌液濃度為10～104CFU/mL時(shí)，熒光定量PCR均沒(méi)有明顯的擴(kuò)增信號(hào)，檢測(cè)結(jié)果記為陰性；當(dāng)菌液濃度為104～108CFU/mL時(shí)，可測(cè)得Ct值計(jì)算拷貝數(shù)。將熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，檢測(cè)結(jié)果并無(wú)顯著性差異(P>0.05)，其結(jié)果對(duì)數(shù)值均在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，與菌液實(shí)際濃度相符。以上結(jié)果表明，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法檢測(cè)限為104CFU/mL,能夠滿足國(guó)標(biāo)GB 19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》中對(duì)發(fā)酵乳乳酸菌含量檢測(cè)的要求，并且所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確反映益生菌含量。

2.5 市售樣品的定性、定量檢測(cè)

2.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果分析

根據(jù)新建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)市售樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果即可對(duì)樣品進(jìn)行定性檢測(cè)。同時(shí)得到對(duì)應(yīng)的樣品Ct值(y)，將其代入2.3中所建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，即可對(duì)樣品初始濃度(x)進(jìn)行定量。所得結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 市售樣品的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)結(jié)果Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR test results of commercial samples

市售樣品1、樣品2在擴(kuò)增時(shí)均沒(méi)有顯著熒光信號(hào)，無(wú)Ct值檢出，即無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線形成，表明樣品中均不含有干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌。樣品3中形成干酪乳桿菌陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，同時(shí)檢出Ct值為12.02±0.22，將其代入干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.264x+38.604計(jì)算，得到干酪乳桿菌含量為(1.39±0.2)×109copies/mL。其中，樣品3并無(wú)羅伊氏乳桿菌陽(yáng)性擴(kuò)增曲線形成，說(shuō)明樣品3并未添加羅伊氏乳桿菌。自制益生菌發(fā)酵乳中分別形成干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，同時(shí)檢出干酪乳桿菌Ct值為10.84±0.14，將其代入方程中計(jì)算得到干酪乳桿菌含量為(3.2±0.35)×109copies/mL。檢出羅伊氏乳桿菌Ct值為11.49±0.11，代入羅伊氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.363x+40.594中計(jì)算，可得羅伊氏乳桿菌含量為(4.5±0.36)×109copies/mL。檢測(cè)結(jié)果均與樣品標(biāo)簽中標(biāo)識(shí)菌株種類(lèi)及數(shù)量信息一致，同時(shí)與2.2中樣品定性檢測(cè)結(jié)果一致。由此可知，所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠?qū)σ嫔l(fā)酵乳中干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌同時(shí)定性、定量檢測(cè)。姜?jiǎng)P等[27-29]使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定酸奶中的乳酸菌，單個(gè)樣品耗時(shí)40 min。但流式細(xì)胞術(shù)卻無(wú)法對(duì)乳酸菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果可能包含了除乳酸菌以外的其他微生物。陳臣等[30]采用普通PCR方法結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析對(duì)發(fā)酵乳中植物乳桿菌進(jìn)行檢測(cè)，操作方法繁瑣且不能對(duì)益生菌定量。而本技術(shù)對(duì)目的菌株構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立了益生菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)選取目的菌株的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，使目的菌株能夠進(jìn)行特異性擴(kuò)增從而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合發(fā)酵乳中特定益生菌的定性檢測(cè)，同時(shí)檢出樣品Ct值并代入方程中計(jì)算即可對(duì)益生菌進(jìn)行定量檢測(cè)。所建方法不僅克服了流式細(xì)胞術(shù)和傳統(tǒng)平板法很難對(duì)發(fā)酵乳中同一菌屬乳酸菌特異性檢測(cè)的困難，還在普通PCR定性檢測(cè)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了對(duì)益生菌的定量檢測(cè)。

2.5.2 熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)的特異性分析

通過(guò)解讀擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線可對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，不同擴(kuò)增產(chǎn)物下的溶解曲線不同，可通過(guò)觀察溶解曲線排除引物二聚體等非特異性干擾[31]。由圖4可知,擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線皆呈單一峰型且空白對(duì)照無(wú)起峰現(xiàn)象，表明定量體系特異性良好，所用引物及PCR反應(yīng)條件都適合進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。

2.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間統(tǒng)計(jì)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)發(fā)酵乳中益生菌進(jìn)行檢測(cè)。為有效提取樣品DNA，對(duì)發(fā)酵乳中乳蛋白及脂肪進(jìn)行酶解處理，此過(guò)程需要時(shí)長(zhǎng)為1 h。將處理后樣品使用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取發(fā)酵乳中DNA作為PCR反應(yīng)模板，提取時(shí)間通常為1 h。將得到的DNA作為PCR反應(yīng)模板，按照1.2.3中確定的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系和反應(yīng)程序使用PCR儀擴(kuò)增檢測(cè),需要時(shí)間約為1.5 h。因此，本方法的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程所需時(shí)間一般約為3.5 h。而使用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法檢測(cè)乳酸菌所需時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2～3 d[32]，相比之下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)顯著提高了檢測(cè)效率。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線Fig.4 Real-time fluorescence quantitative PCR dissolutioncurve

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)間表Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCRdetection schedule

3 結(jié)論

本研究通過(guò)干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌種屬特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，建立了雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。其中，所建干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.264x+38.604，羅伊氏乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=-3.363x+40.594，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99以上。使用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法對(duì)其驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2種檢測(cè)方法對(duì)菌液計(jì)數(shù)結(jié)果并無(wú)顯著性差異。對(duì)市售樣品進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢測(cè)，通過(guò)觀察擴(kuò)增結(jié)果和檢測(cè)樣品Ct值即可對(duì)市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的有無(wú)和含量進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，經(jīng)過(guò)對(duì)比可知檢測(cè)結(jié)果與所知的益生菌種類(lèi)及數(shù)量信息相符。因此，本研究所建立的技術(shù)方法能夠比較快速、準(zhǔn)確地對(duì)益生菌發(fā)酵乳中的干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，對(duì)有關(guān)制品的質(zhì)量檢測(cè)和控制具有一定的指導(dǎo)作用。