馬瑞娟，唐珠珍，趙旭蕊，謝友坪*，陳劍鋒

1(海洋生物高值高質(zhì)化利用技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)(福州大學(xué))，福建 福州， 350108)2(福建省海產(chǎn)品廢棄物綜合利用工程技術(shù)研究中心(福州大學(xué))，福建 福州， 350108)3(福州市海產(chǎn)品高值化利用行業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心(福州大學(xué))，福建 福州， 350108)4(廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門， 361005)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素，存在于高等植物和其他光自養(yǎng)生物(如藻類)中[1]。由于具有抗氧化、抗炎和著色等特性，葉黃素被廣泛用作食品添加劑、飼料添加劑或功能性營(yíng)養(yǎng)品等，其市場(chǎng)價(jià)值約為3億美元[2]。市售的葉黃素主要來(lái)源于萬(wàn)壽菊，但是以萬(wàn)壽菊生產(chǎn)葉黃素存在生長(zhǎng)速度慢、勞動(dòng)力成本高和占用大量耕地資源等問(wèn)題[3]。利用微藻生產(chǎn)葉黃素具有生長(zhǎng)速度快、葉黃素含量高、不占用耕地、可以全年收獲等優(yōu)點(diǎn)[3]。但其生產(chǎn)成本相對(duì)較高，如生產(chǎn)1 kg 柵藻(Scenedesmusalmeriensis)藻粉的成本約為69歐元[4]，導(dǎo)致商業(yè)化應(yīng)用受限。室外開放式培養(yǎng)系統(tǒng)(如開放池和跑道池)由于生產(chǎn)成本較低而被廣泛用于微藻基產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)，但是這種培養(yǎng)系統(tǒng)需要使用大量的水資源，據(jù)報(bào)道，生產(chǎn)1 kg藻粉和1 kg葉黃素分別需要消耗0.19～0.77 t和38～154 t水[3]。由于淡水資源相對(duì)匱乏，如能采用海水培養(yǎng)微藻，可在一定程度上改善微藻大規(guī)模生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)可行性[5]。

進(jìn)化育種技術(shù)常被用于選育有價(jià)值的微藻品系。在進(jìn)化育種中，通過(guò)設(shè)定選擇性條件進(jìn)行生物的長(zhǎng)期適應(yīng)培養(yǎng)，以通過(guò)自然突變來(lái)改善細(xì)胞表型[6]。KATO等[7]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的高鹽度適應(yīng)性馴化，衣藻的耐鹽株可在70 g/L鹽度條件正常生長(zhǎng)。目前，已報(bào)道生產(chǎn)葉黃素的藻種主要有Chlorellaprotothecoides、S.almeriensis、Muriellopsissp.、Chlorococcumcitriforme、Neospongiococcusgelatinosum等，這些藻株的葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為3～7 mg/g，葉黃素產(chǎn)率可達(dá)1～10 mg/(L·d)[8]。本課題組前期篩選獲得了1株小球藻(Chlorellasorokiniana) FZU60，其葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)率可分別高達(dá)9.57 mg/g和11.57 mg/(L·d)[9]。為提高該藻株的耐鹽性，本研究對(duì)其進(jìn)行了高鹽度適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，分析了馴化過(guò)程其細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞組成的變化，并進(jìn)一步對(duì)比了耐鹽株和原始株的葉黃素生產(chǎn)情況，旨在為利用海水進(jìn)行微藻葉黃素生產(chǎn)及降低生產(chǎn)成本提供合適的藻種來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻(Chlorellasorokiniana) FZU60，由福建省海產(chǎn)品廢棄物綜合利用工程技術(shù)研究中心保存。

三氟化硼/甲醇溶液為分析純，CNW公司；正己烷、甲醇均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨、37種脂肪酸甲酯混標(biāo)、二十碳酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，Sigma-Aldrich公司；丁基羥基甲苯、甲基叔丁基醚均為色譜純，Acros Organics公司；三乙胺為色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司；葉黃素、紫黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，Chromadex公司；丙酮、無(wú)水乙醚、無(wú)水Na2SO4、乙醇、苯酚、H2SO4、HCl、葡萄糖、木糖以及BG11培養(yǎng)基[10]成分均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海鹽為分析純，Sigma-Aldrich公司；PierceTMBCA蛋白定量分析試劑盒，Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-20bR高速冷凍離心機(jī)、LXJ-2B低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ST3100F pH計(jì)，OHAUS奧豪斯儀器常州有限公司；AB104N電子天平，Sartorius公司；RCT-B-S025加熱磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司；DW-HL340超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限公司；SP-756P紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；PGX-450D智能光照培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；移液槍，德國(guó)Eppendorf公司；FD-2真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Ci-S顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；GC-2014C氣相色譜儀、LC-16高效液相色譜儀，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小球藻高鹽度適應(yīng)性馴化

從生長(zhǎng)良好的小球藻平板中挑取藻泥，按質(zhì)量濃度35～50 mg/L的初始接種量轉(zhuǎn)接于40 g/L鹽度的BG11培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為7.5。控制培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃，光照強(qiáng)度150 μmol/(m2·s)，攪拌速率500 r/min，并以0.15 vvm的通氣速率連續(xù)供應(yīng)2.5%(體積分?jǐn)?shù))CO2。每隔5 d重新轉(zhuǎn)接1次，待藻細(xì)胞在40 g/L鹽度生長(zhǎng)穩(wěn)定后轉(zhuǎn)接于50 g/L鹽度的BG11培養(yǎng)基中，直至藻細(xì)胞在50 g/L鹽度生長(zhǎng)穩(wěn)定。每隔一定時(shí)間測(cè)定藻液的生物量、pH和NaNO3質(zhì)量濃度，并在顯微鏡下觀察藻細(xì)胞形態(tài)。在每次轉(zhuǎn)接前離心收集藻體，于-20 ℃保存，用于測(cè)定色素、蛋白、碳水化合物和油脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 耐鹽株和原始株在30 g/L鹽度下的培養(yǎng)表征

將原始藻株接種于不含海鹽的BG11培養(yǎng)基中，耐鹽藻株接種于50 g/L鹽度的BG11培養(yǎng)基中，二者均培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后按質(zhì)量濃度60～70 mg/L的初始接種量分別轉(zhuǎn)接至30 g/L鹽度的BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時(shí)控制培養(yǎng)條件為：溫度33 ℃，光照強(qiáng)度600 μmol/(m2·s)，攪拌速度500 r/min，并以0.15 vvm的通氣速率連續(xù)供應(yīng)2.5%CO2。每隔一定時(shí)間測(cè)定藻液的生物量、pH和硝酸鹽質(zhì)量濃度。待硝酸鹽消耗90%時(shí)，離心收集藻體，用于測(cè)定葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 藻體生物量的測(cè)定

采用分光光度計(jì)測(cè)定藻液在682 nm波長(zhǎng)下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算生物量質(zhì)量濃度。藻株FZU60在40 g/L鹽度下馴化培養(yǎng)1、3、6、9、12批次時(shí)其生物量質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.332 8x-0.001 3(R2=0.999 8)、y=0.312 8x-0.000 8(R2=0.999 9)、y=0.333 7x-0.000 6(R2=0.999 9)、y=0.330 1x-0.001 8(R2=0.999 8)、y=0.321x-0.000 9(R2=0.999 9)；在50 g/L鹽度下馴化培養(yǎng)1、2、6、9、13批次時(shí)其生物量質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.359 6x-0.000 3(R2=1)、y=0.376 5x+0.000 7(R2=0.999 8)、y=0.390 6x-0.000 8(R2=0.999 9)、y=0.360 8x-0.002 6(R2=0.999 7)、y=0.370 6x-0.002 5(R2=0.999 7)。其中，y為生物量質(zhì)量濃度(g/L)，x為OD682 nm值。根據(jù)XIE等[11]的方法計(jì)算生物量產(chǎn)率和比生長(zhǎng)速率。

1.3.4 NaNO3質(zhì)量濃度的測(cè)定

由于NO3-在220 nm波長(zhǎng)下具有最大的吸光值，根據(jù)XIE等[12]報(bào)道的紫外分光光度計(jì)法測(cè)定藻液的NaNO3質(zhì)量濃度。NaNO3質(zhì)量濃度(y,mg/L)與OD220 nm值(x)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：y=22.63x-0.035 9(R2=0.999 8)。

1.3.5 藻體色素含量的測(cè)定

采用丙酮提取法[13-14]測(cè)定小球藻的葉綠素含量。采用CHEN等[15]報(bào)道的方法萃取小球藻的類胡蘿卜素，然后采用TAYLOR等[16]報(bào)道的高效液相色譜法測(cè)定各類胡蘿卜素組分。

1.3.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用 PiercTEBCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.7 氨基酸組成測(cè)定和必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index,EAAI)的計(jì)算

氨基酸組成的測(cè)定參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》。按公式(1)計(jì)算EAAI[17]：

(1)

式中：aan，樣品中必需氨基酸質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的比例；AAn，F(xiàn)AO/WHO參考標(biāo)準(zhǔn)中必需氨基酸質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的比例[18]。

1.3.8 藻體碳水化合物含量的測(cè)定

采用H2SO4-苯酚法[13,19]測(cè)定小球藻FZU60細(xì)胞中的碳水化合物含量。碳水化合物含量(y,mg/L)與OD490 nm值(x)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：y=83.365x-0.340 1(R2=0.999)。

1.3.9 藻體油脂含量及其組成的測(cè)定

采用直接轉(zhuǎn)酯化方法[13]測(cè)定小球藻FZU60中的油脂含量及組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻的生長(zhǎng)情況變化

如圖1所示，在40 g/L鹽度下經(jīng)過(guò)連續(xù)12批次的轉(zhuǎn)接馴化培養(yǎng)，小球藻的生物量質(zhì)量濃度可從1.00 g/L提高至2.31 g/L。且繼續(xù)在50 g/L鹽度下經(jīng)過(guò)13批次的馴化培養(yǎng)，藻細(xì)胞的質(zhì)量濃度可穩(wěn)定在2.11 g/L(圖2)。該結(jié)果說(shuō)明在馴化過(guò)程中，藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)了高鹽度環(huán)境。鹽度主要以滲透脅迫、離子(鹽)脅迫或改變細(xì)胞離子比率3種方式影響浮游植物[20-21]。藻細(xì)胞可通過(guò)滲透作用將Na+隔離在液泡中，以保持在高鹽度下的膨脹壓力，從而適應(yīng)一定程度的鹽度脅迫[22]。

圖1 40 g/L鹽度下藻株FZU60適應(yīng)性馴化過(guò)程的生物量變化曲線Fig.1 Biomass concentration curve of strain FZU60 duringadaptive domestication under 40 g/L salinity

圖2 50 g/L鹽度下藻株FZU60適應(yīng)性馴化過(guò)程的生物量變化曲線Fig.2 Biomass concentration curve of strain FZU60during adaptive domestication under 50 g/L salinity

由圖3可知，與原始藻株相比，耐鹽株的細(xì)胞體積變大，藻體顏色加深。有研究發(fā)現(xiàn)，一些綠藻(如萊茵衣藻和雨生紅球藻)可通過(guò)形成聚集的肥大細(xì)胞以應(yīng)對(duì)外界的脅迫條件[23-24]。因此，小球藻FZU60可能通過(guò)增大細(xì)胞體積來(lái)應(yīng)對(duì)外界的高鹽環(huán)境。

a-原始株；b-耐鹽株圖3 FZU60原始藻株與耐鹽藻株的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Cellular morphology of wild and salt-tolerantstrains of FZU60

2.2 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻FZU60的類胡蘿卜素組成變化

如圖4所示，經(jīng)過(guò)40 g/L鹽度的馴化培養(yǎng)，藻細(xì)胞的總類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)從8.39 mg/g提高至12.08 mg/g；轉(zhuǎn)移至50 g/L鹽度條件馴化時(shí)，總類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì)。在鹽度適應(yīng)性馴化前期藻細(xì)胞的總類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，這可能是由于在高鹽條件下光合系統(tǒng)I的捕光復(fù)合物被活性氧破壞[25]。而隨著馴化次數(shù)的增加，藻細(xì)胞逐漸適應(yīng)高鹽環(huán)境，使得總類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸提高。小球藻FZU60的類胡蘿卜素組成主要包括葉黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、紫黃素、新黃素。在整個(gè)鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中，葉黃素可維持在總類胡蘿卜素的61%～67%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

4-1、4-3、4-6、4-9、4-12表示40 g/L鹽度條件下馴化1、3、6、9、12次；5-1、5-2、5-6、5-9、5-13表示50 g/L鹽度條件下馴化1、2、6、9、13次(下同)圖4 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中藻株FZU60的類胡蘿卜素含量及組成變化Fig.4 Ccarotenoid content and composition of strain FZU60during salinity adaptive domestication

2.3 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻FZU60的氨基酸組成變化

如圖5所示，經(jīng)過(guò)40 g/L鹽度的適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，藻細(xì)胞的必需氨基酸占總氨基酸的含量略微增加，從32.79%提高至36.54%；而轉(zhuǎn)移至50 g/L鹽度條件下時(shí)，其必需氨基酸占總氨基酸的含量在33.33%～34.71%波動(dòng)。

圖5 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中藻株FZU60的氨基酸組成和EAAI變化Fig.5 Amino acid composition and EAAI of strain FZU60during salinity adaptive domestication

此外，在40 g/L鹽度馴化條件下，EAAI值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從1.30提高至1.51，但轉(zhuǎn)移至50 g/L鹽度馴化后，EAAI則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，最終下降至1.34左右。這可能與馴化過(guò)程中藻細(xì)胞所需的蛋白質(zhì)種類密切相關(guān)。EAAI>1表示蛋白品質(zhì)優(yōu)良，可用于人類食品[17,26]。因此，在鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻FZU60的氨基酸組成可保持優(yōu)良品質(zhì)。

2.4 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻FZU60的脂肪酸組成變化

如圖6所示，藻細(xì)胞中肉豆蔻酸(C14∶0)的含量較低，僅占總脂肪酸的1%～2%，而棕櫚酸(C16∶0)和亞油酸(C18∶2)的含量最高，二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)可占總脂肪酸的53%～58%。在鹽度脅迫條件下脂肪酸含量及組成的變化可能是為了維持膜的流動(dòng)性以防止細(xì)胞被破壞[27]。在鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中，飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)比例總體呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，最終由39.69%提高至40.6%；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)比例呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，從20.69%提高至22.35%；多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)比例呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，從39.62%下降至37.05%。這與XU等[28]在鹽藻Dunallielasp.中的研究結(jié)果相一致。

圖6 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中藻株FZU60的脂肪酸組分變化Fig.6 Fatty acid composition of strain FZU60 duringsalinity adaptive domestication

2.5 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中小球藻FZU60的細(xì)胞組分變化

如圖7所示，小球藻FZU60的細(xì)胞組成主要包含蛋白質(zhì)、脂肪酸、碳水化合物和色素(葉綠素和類胡蘿卜素)，其中前3者占細(xì)胞組成的81%～92%。在鹽度馴化過(guò)程中，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)從37.60%提高至46.48%；油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)從9.80%提高至12.59%；碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)從34.05%降低至26.23%；色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不大。以上結(jié)果表明,高鹽度可促進(jìn)藻細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的積累，但不利于碳水化合物積累。類似地，有研究表明高鹽條件下藻細(xì)胞的碳水化合物合成會(huì)受到抑制[29]，而油脂合成的效率則會(huì)提高[22]。這可能是由于鹽度脅迫可激活相關(guān)酶的活性，以分解碳水化合物用于合成能量更高的油脂，從而使得細(xì)胞能夠承受滲透壓力的變化。例如，在鹽脅迫下嗜鹽微藻(Dunaliellasalina)胞內(nèi)淀粉(碳水化合物)會(huì)被代謝轉(zhuǎn)移至三酰甘油酯(油脂)的生物合成中[30]。

圖7 鹽度適應(yīng)性馴化過(guò)程中藻株FZU60的細(xì)胞組分變化Fig.7 Cell composition of strain FZU60 during salinityadaptive domestication

2.6 30 g/L鹽度下耐鹽株和原始株的細(xì)胞生長(zhǎng)及葉黃素積累情況

海水鹽度一般在30～35 g/L，若微藻能在30 g/L鹽度下生長(zhǎng)，則可以使用海水進(jìn)行培養(yǎng)，從而達(dá)到節(jié)約淡水資源并降低微藻培養(yǎng)成本的目的[31]。如圖8-a所示，在30 g/L鹽度條件下培養(yǎng)4 d的過(guò)程中，耐鹽株的生物量質(zhì)量濃度始終高于原始株，且耐鹽株的氮源消耗速度也更快(如圖8-b)。

a-細(xì)胞生長(zhǎng)；b-氮源消耗圖8 30 g/L鹽度下FZU60原始株和耐鹽株的細(xì)胞生長(zhǎng)及氮源消耗情況Fig.8 Cell growth and nitrogen source consumptionof wild and salt-tolerant strains of FZU60 at 30 g/L salinity

有研究報(bào)道，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源即將耗盡時(shí)(耗完90%氮源)，藻細(xì)胞的葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)最高，因此一般在此時(shí)間點(diǎn)收集藻細(xì)胞用于葉黃素提取[32]。如圖8-b所示，原始株和耐鹽株分別在培養(yǎng)2.31和2.02 d時(shí)耗完90%氮源，此時(shí)兩者的葉黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著性差異，分別為(7.26±0.13)和(7.31±0.23) mg/g(表1)。但由于耐鹽株的生物量產(chǎn)率明顯高于原始株，使得其葉黃素產(chǎn)率及產(chǎn)量均顯著高于原始株(表1)。因此綜上可知，在30 g/L鹽度下耐鹽株具有更高的葉黃素生產(chǎn)能力。

表1 30 g/L鹽度下FZU60原始株和耐鹽株的細(xì)胞生長(zhǎng)及葉黃素生產(chǎn)情況對(duì)比Table 1 Comparison of cell growth and lutein productionof wild and salt-tolerant strains of FZU60 at 30 g/L salinity

3 結(jié)論

本研究采用長(zhǎng)期的高鹽度適應(yīng)性馴化方法，獲得了可在50 g/L鹽度下正常生長(zhǎng)的耐鹽小球藻藻株。與原始藻株相比，耐鹽株的細(xì)胞體積增大，藻體顏色加深。經(jīng)過(guò)高鹽度適應(yīng)性馴化培養(yǎng)，耐鹽株的油脂和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所提高，色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)顯著變化，但碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低。在30 g/L鹽度下，耐鹽藻株具有更高的生物量產(chǎn)率和葉黃素產(chǎn)率，因此可用于海水培養(yǎng)生產(chǎn)葉黃素的實(shí)際應(yīng)用中。但值得注意的是，本研究采用海鹽來(lái)配制海水，若直接采用天然海水進(jìn)行培養(yǎng)，可能會(huì)由于不同海域的海水其鹽離子組成及配比存在差異，從而會(huì)對(duì)藻體生長(zhǎng)和葉黃素合成產(chǎn)生一定影響，因此在實(shí)際應(yīng)用中需注意海水的離子組成及配比。