柳長(zhǎng)明 崔國(guó)利 潘寧 趙廣陽(yáng) 程開(kāi)

摘 要 目的：探討循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）在胃腸間質(zhì)瘤診治中的應(yīng)用。方法：選取80例胃腸間質(zhì)瘤患者，所有患者均接受外周ctDNA檢測(cè)，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）和高通量測(cè)序法分析胃腸間質(zhì)瘤基因病變類型與性別、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤直徑、Fletcher分級(jí)和核分裂象之間的關(guān)系。結(jié)果：ctDNA與性別無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05），ctDNA與腫瘤原發(fā)部位、腫瘤直徑、Fletcher分級(jí)和核分裂象有顯著相關(guān)性（P<0.05）；ctDNA陽(yáng)性患者無(wú)進(jìn)展生存期低于陰性患者（P<0.05）。結(jié)論：ctDNA可能為胃腸間質(zhì)瘤患者預(yù)后不良因素，可作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，臨床意義顯著。

關(guān)鍵詞 循環(huán)腫瘤DNA 胃腸間質(zhì)瘤 診治

中圖分類號(hào)：R735 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1006-1533（2020）15-0058-03

Application of ctDNA in the diagnosis and treatment of gastrointestinal stromal tumors*

LIU Changming1**， CUI Guoli2， PAN Ning3， ZHAO Guangyang4， CHENG Kai5（1. Department of General Surgery， Shenzhen Samii Medical Center， Guangdong Shenzhen 518118， China； 2. Department of Clinical Laboratory； 3. B Ultrasound Room； 4. the Third Department of Cardiovascular Internal Medicine； 5. the Second Department of Gastroenterology， the First Hospital affiliated to Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154007， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the application of circulating tumor DNA （ctDNA） in the diagnosis and treatment of gastrointestinal stromal tumors （GIST）. Methods： Eighty patients with GIST were selected and underwent peripheral blood ctDNA detection. The relationship between the type of GIST gene lesions and sex， oncology primary site， oncology diameter， Fletcher grade， and mitotic figures were analyzed by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and high-throughput sequencing. Results： There was no significant correlation between ctDNA and gender （P>0.05）， but there was significant correlation between ctDNA and oncology primary site， oncology diameter， Fletcher grade and mitotic figures （P<0.05）. Progression-free survival was lower in ctDNA-positive patients than in ctDNA-negative patients （P<0.05）. Conclusion： CtDNA may be a poor prognostic factor for patients with gastrointestinal stromal tumors and can be used as a dynamic monitoring index and has significant clinical significance.

KEY WORDS circulating tumor DNA； gastrointestinal stromal tumor； diagnosis and treatment

胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors， GIST）是臨床常見(jiàn)的一種腫瘤，發(fā)生于消化道的任何部位，胃腸間質(zhì)瘤治療首選方法是手術(shù)，但術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是影響患者無(wú)進(jìn)展生存期的重要因素，通常在術(shù)后予以伊馬替尼、舒尼替尼等輔助治療[1]?，F(xiàn)階段監(jiān)測(cè)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的方法有螺旋CT、超聲內(nèi)鏡等，但時(shí)效性差，發(fā)現(xiàn)病灶早期轉(zhuǎn)移效果不佳，患者易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）可在早期腫瘤進(jìn)展異常變化，用于監(jiān)測(cè)胃腸間質(zhì)瘤早期診治效果明顯，其具體是指腫瘤細(xì)胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細(xì)胞凋亡后釋放進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)監(jiān)測(cè)血液中ctDNA發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移成為可能[2]。ctDNA從腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞病變中得到，是一種具有典型特征的腫瘤生物標(biāo)記物。為進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)價(jià)ctDNA在胃腸間質(zhì)瘤診治中的應(yīng)用，本次研究選取我院80例胃腸間質(zhì)瘤患者，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月—2020年1月深圳市薩米醫(yī)療中心普外科收治的80例胃腸間質(zhì)瘤患者，所有病例均接受胃鏡或腸鏡檢查，經(jīng)病理學(xué)證實(shí)確診。男46例，女34例；年齡28～79歲，平均年齡（55.72±4.63）歲；腫瘤部位：胃41例、小腸29例、十二指腸5例、結(jié)直腸3例、腸系膜2例；Fletcher分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：低危18例、中危27例、高危35例。所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

所有患者均接受外周血ctDNA檢測(cè)，通過(guò)高通量（next generation sequencing， NGS）方法進(jìn)行定量分析。ctDNA檢測(cè)方法如下：采取外周血，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR， qRT-PCR）法提取單個(gè)核細(xì)胞RNA。引物序列：正義鏈5-AGCCACCTCTrCGACAAC-3，反義鏈5-GACAGCCTCCTcTTCCTCT-3，以b-Actin作為內(nèi)參照。擴(kuò)增以95 ℃預(yù)變性10 min，后94 ℃變性15 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。根據(jù)Ct值來(lái)判斷對(duì)定量DOGl的表達(dá)水平。

1.3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)

治療后由專人通過(guò)微信、電話等方式隨訪，觀察患者有無(wú)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或病灶轉(zhuǎn)移。低危、中危和高危患者每月定期采集外周血樣本。高?；颊呦鄬?duì)低危、中?；颊卟≡钷D(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)更高，因此每月接受CT檢查次數(shù)2次，低危、中?；颊?次。以DOGl表達(dá)量最高為3×10-5為參考標(biāo)準(zhǔn)，高于該數(shù)值者為ctDNA陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)本組研究進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ctDNA定性表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性

80例患者中，ctDNA陽(yáng)性占51.25%（41/80），陰性占48.75%（39/80）。與臨床病理資料相關(guān)性進(jìn)分析得出，ctDNA定性表達(dá)與性別無(wú)顯著相關(guān)性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；ctDNA定性表達(dá)與腫瘤原發(fā)部位、腫瘤直徑、Fletcher分級(jí)和核分裂像分類有顯著差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1）。

2.2 隨訪分析

對(duì)所有患者隨訪分析，截至2020年3月31日，無(wú)失訪病例，ctDNA陽(yáng)性患者無(wú)進(jìn)展生存期為9.6個(gè)月，顯著低于ctDNA陰性患者的13.2個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.649，P=0.016）。

3 討論

檢測(cè)外周血ctDNA作為一種液體激活形式，在未來(lái)醫(yī)學(xué)研究中有著良好的發(fā)展前景，尤其是在診斷早期惡性腫瘤患者，可以準(zhǔn)確評(píng)估患者術(shù)后預(yù)后質(zhì)量、病灶復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等。胃腸間質(zhì)瘤是間葉組織來(lái)源腫瘤，屬于消化道肉瘤，其特異性標(biāo)志物是KIT和DOGl，但正常造血祖細(xì)胞也可以表達(dá)KIT[3]，含量約為85%和10%左右，因此不適合作為循環(huán)腫瘤的靶基因。從臨床實(shí)踐角度，難以準(zhǔn)確獲取活檢穿刺標(biāo)本，通過(guò)臨床影像學(xué)檢查對(duì)病變程度不敏感，特異性和敏感度較低，且影像學(xué)檢查結(jié)果較血液學(xué)指標(biāo)變化具有滯后性，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)[4]。現(xiàn)階段監(jiān)測(cè)胃腸間質(zhì)瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的方法是定期CT檢查，但其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、放射性強(qiáng)[5]。本研究采用的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法可用于胃腸間質(zhì)瘤用于患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)，以期能從分子生物學(xué)水平檢測(cè)出具有臨床意義的循環(huán)腫瘤。因此在對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的早期診斷應(yīng)用中具有局限性。本次研究結(jié)果顯示，ctDNA與腫瘤原發(fā)部位、腫瘤直徑、Fletcher分級(jí)和核分裂像分類有著密切關(guān)系，在十二指腸中陽(yáng)性率高于胃、小腸和結(jié)直腸；隨腫瘤直徑增大，陽(yáng)性率表達(dá)升高；Fletcher分級(jí)高?；颊咧嘘?yáng)性率升高；核分裂像較高患者陽(yáng)性率高于較低患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此ctDNA檢測(cè)可用于胃腸間質(zhì)瘤診治中，具有動(dòng)態(tài)、無(wú)創(chuàng)、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)[6]，可為早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移提供參考依據(jù)。

綜上所述，ctDNA在胃腸間質(zhì)瘤診治中可作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)，臨床意義顯著。

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