劉生財,李漢生,楊曦晨,賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

龍眼(DimocarpuslonganLour.)又名桂圓，屬于無患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus)，富含類黃酮等次生代謝物質(zhì)，具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值[1-3]。類黃酮廣泛存在于植物體內(nèi)，如菊花[3]、大豆[4]、山楂葉[5]等，其合成受到多種因素的影響，如溫度、光照、傷害等，類黃酮的生物合成已經(jīng)成為植物次生代謝基因工程、代謝工程的主要目標。表兒茶素是類黃酮化合物中重要一種類型，具有較強的抗氧化能力，營養(yǎng)價值和藥用價值更高[6-7]。

光是植物的生長發(fā)育及次生代謝產(chǎn)物形成的重要影響因子[8-10]。在單色光處理中，藍光有利于銀杏葉片[9]、迷迭香[11]和龍眼胚性愈傷組織[12]中類黃酮含量的積累。紅光和藍光是植物吸收的主要光源，有利于促進次生代謝產(chǎn)物的合成與累積，紅藍復(fù)合光更有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，能夠改善茄皮品質(zhì)并促進類黃酮合成[13]，提高韭菜類黃酮含量[14]。

植物體內(nèi)類黃酮的生物合成是一系列酶促反應(yīng)過程。查爾酮合成酶(CHS)是類黃酮物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶，介導(dǎo)黃酮類化合物合成的第1步[15-16]。無色花色素還原酶基因(LAR)是類黃酮生物合成途徑中下游的一個重要基因，LAR蛋白能夠催化兒茶素、無色花青素和相關(guān)的黃烷-3-羥基阿福豆素與沒食子兒茶素等植物聚合型原花青素或者濃縮單寧合成起始物質(zhì)的合成。研究已證實，CHS和LAR基因表達都受到光調(diào)控[17-18]。

HY5是第1個被發(fā)現(xiàn)促進光形態(tài)建成的轉(zhuǎn)錄因子,它能編碼1個bZIP類型的轉(zhuǎn)錄因子[19]。AKIFUMI等[20]研究表明,葡萄HY5的表達受光誘導(dǎo)。冀曉昊等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HY5不僅參與葡萄果樹發(fā)育進程，還與花青苷的積累成正相關(guān)。HY5誘導(dǎo)擬南芥花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子MYB75/PAP1[22]和葡萄VvMYBA1[21]的表達，調(diào)控花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因表達，導(dǎo)致花青苷積累的差異。而且有研究發(fā)現(xiàn)，COP1可泛素化降解HY5進而影響CHS轉(zhuǎn)錄[23-24]。光質(zhì)調(diào)控龍眼胚性愈傷組織類黃酮的研究雖有報道[12]，但紅藍復(fù)合光對龍眼胚性愈傷組織的研究尚未見報道。因此，探討不同紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織生長狀態(tài)及類黃酮代謝產(chǎn)物含量的影響，分析轉(zhuǎn)錄因子DlHY5及其與類黃酮結(jié)構(gòu)基因DlCHS、DlLAR之間的聯(lián)系，為揭示紅藍復(fù)合光調(diào)控龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝的機制提供線索。

1 材料和方法

1.1 植物材料和光照處理

龍眼胚性愈傷組織為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所長期繼代保存的紅核子龍眼胚性愈傷組織LC2細胞系[25]。取大小相一致的龍眼胚性愈傷組織接種于MS+2,4-D 1.0 mg/L培養(yǎng)基中。然后將相同接種量的龍眼胚性愈傷組織置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)計9種紅藍復(fù)合光配比，分別為紅∶藍=1∶9、紅∶藍=2∶8、紅∶藍=3∶7、紅∶藍=4∶6、紅∶藍=5∶5、紅∶藍=6∶4、紅∶藍=7∶3、紅∶藍=8∶2、紅∶藍=9∶1。光照總強度為32 μmol/(m2·s)，光照時間為12 h/d，藍光中心波長為457 nm，紅光中心波長為660 nm。以黑暗條件作為對照。研究不同光照條件對龍眼胚性愈傷組織生長的影響。通過倒置電子顯微鏡(Leica)進行龍眼胚性愈傷組織細胞觀察。每個處理25瓶，處理周期為25 d。每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 胚性愈傷組織生長率測定

取出龍眼胚性愈傷組織測定鮮質(zhì)量，計算其生長率[26]，生長率=(終鮮質(zhì)量-接種鮮質(zhì)量)/接種鮮質(zhì)量×100%。

1.3 類黃酮含量測定

黃類酮提取方法參照李琨等[27]的方法并適當改良。將龍眼胚性愈傷組織進行凍干處理2 d，天平稱取0.2 g材料，首先加入60%乙醇溶液10 mL，通過超聲波清洗器(KQ-200SPDE)提取1 h(60 ℃，功率300 W)，冷卻靜置20 min，再通過離心機(TGL-15B)離心10 min(8 000×g，20 ℃)。然后吸取5 mL上清液于新試管中，并稀釋至10 mL。最后取龍眼胚性愈傷組織提取液5 mL，精確加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置 6 min，加入4 mL 20%氫氧化鈉溶液，加入10 mL 60%乙醇溶液定容至10 mL刻度線，搖動均勻并靜置15 min。通過紫外可見分光光度計(T6)檢測吸光度，波長設(shè)置為510 nm，根據(jù)所建立標準曲線計算龍眼胚性愈傷組織的類黃酮含量。

1.4 表兒茶素提取和UPLC分析

龍眼胚性愈傷組織表兒茶素的提取方法參照類黃酮提取方法。然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液蒸干，再用5 mL甲醇溶液溶解。最后，將提取液通過0.22 μm有機膜，待上機測定。色譜條件[28]：Waters ACQUITY HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm) 色譜柱;流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～12 min，5%～20%A;12～30 min，25%～55%A);流速:0.2 mL/min;檢測波長:280 nm;柱溫:30 ℃;進樣體積:1 μL。

1.5 紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織中DlLAR、DlCHS、DlHY5基因表達影響試驗

根據(jù)龍眼基因組數(shù)據(jù)庫及轉(zhuǎn)錄組信息，篩選DIHY5、DlCHS、DlLAR基因序列。取不同光照處理后的龍眼胚性愈傷組織總RNA，RNA質(zhì)量檢驗合格后采用PrimeScript? RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒進行cDNA逆轉(zhuǎn)。參照LIN等[29]方法，以龍眼EIF4a、EF-la和FSD作為內(nèi)參基因，采用羅氏LightCyclers 480和SYBR Prumix EXTaqTM Ⅱ進行不同光照處理下HY5、DlCHS、DlLAR基因qPCR分析。龍眼基因qPCR引物信息見表1。

表1 龍眼基因qPCR引物信息Tab.1 Primers for qPCR of longan

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS V19.0 軟件，單因素方差分析采用Duncan法，顯著性水平設(shè)為P<0.05。制圖采用GraphPad Prism 6.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織生長的影響

通過對龍眼胚性愈傷組織形態(tài)進行觀察，與黑暗相比，紅藍復(fù)合光配比為1∶9和2∶8時，龍眼胚性愈傷組織生長量較多，生長率分別為1 107.5%、1 130.0%；紅藍復(fù)合光配比為9∶1和8∶2時，龍眼胚性愈傷組織生長量較少，生長率分別為877.5%和912.5%(圖1)。

不同小寫字母表示各處理差異在0.05水平顯著，下同Different small letters indicate significant differences at 0.05 level，the same below圖1 紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織生長率的影響Fig.1 Effect of the ratio of red-blue composite light on growth rate of longan embryonic callus(ECs)

通過對愈傷組織形態(tài)觀察(圖2A—D)也可以看出，藍光比例高時有利于愈傷組織增殖，而且顏色有些褐色，當紅藍光配比為9∶1時，愈傷組織呈淡黃色。而對龍眼胚性愈傷組織顯微觀察時，并未發(fā)現(xiàn)紅藍復(fù)合光對其有明顯影響，但紅藍復(fù)合光配比為1∶9時，細胞中的內(nèi)含物質(zhì)更多，顏色更深(圖2E—H)。

A和E：黑暗；B和F：紅∶藍=1∶9；C和G：紅∶藍=5∶5；D和H：紅∶藍=9∶1

2.2 紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織類黃酮和表兒茶素含量的影響

由圖3可知，紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織類黃酮及表兒茶素含量有顯著影響。當紅藍復(fù)合光配比為1∶9時，類黃酮及表兒茶素含量均為最高，分別為12.49 mg/g和2 187.54 μg/g，顯著高于其他處理；隨著復(fù)合光中紅光比例的增加，龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和表兒茶素含量都呈下降趨勢。其中，在紅藍光配比為7∶3、8∶2和9∶1時，類黃酮含量較低，為8.38～8.73 mg/g，與黑暗處理(8.31 mg/g)差異不顯著；而在黑暗條件下表兒茶素含量最低。當紅藍光進行配比時，藍光對總黃酮和表兒茶素的積累效率顯著大于紅光，隨著紅藍復(fù)合光中紅光比例的增加，類黃酮和表兒茶素含量逐漸降低；隨著藍光比例的增加，類黃酮和表兒茶素總含量逐漸增加。表明紅藍光配比中藍光比例高時有利于類黃酮及表兒茶素累積。

圖3 紅藍復(fù)合光配比對龍眼胚性愈傷組織類黃酮和表兒茶素含量的影響Fig.3 Effect of the ratio of red-blue composite light on the contents of flavonoids and epicatechin of longan ECs

2.3 紅藍光復(fù)合配比對龍眼DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表達的影響

通過對龍眼胚性愈傷組織類黃酮合成關(guān)鍵基因DlCHS和DlLAR在紅藍光配比中的表達量分析，DlCHS和DlLAR相對表達量變化趨勢一致(圖4a—b)。在黑暗培養(yǎng)時，DlCHS和DlLAR的相對表達量都是最低。隨著紅藍復(fù)合光配比變化，DlCHS和DlLAR基因相對表達量也發(fā)生顯著變化。隨著紅光比例降低，DlCHS和DlLAR基因相對表達量呈先上升后下降趨勢，在紅藍光配比為3∶7時，DlCHS和DlLAR相對表達量最高。而且，還可以看出，有光存在時DlCHS和DlLAR基因相對表達量均顯著高于對照，說明紅藍光配比可以影響龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝產(chǎn)物合成。

同時，DlHY5的相對表達量在黑暗培養(yǎng)條件下最低(圖4c)。當復(fù)合光配比為紅∶藍=1∶9時，DlHY5的相對表達量達到最高值，其他復(fù)合光配比處理的相對表達量均低于紅∶藍=1∶9處理，但是也高于黑暗處理。可知紅藍復(fù)合光比黑暗條件更適合轉(zhuǎn)錄因子DlHY5的表達。同時，還發(fā)現(xiàn)DlHY5基因的表達量趨勢與類黃酮代謝產(chǎn)物含量趨勢基本一致。因此，推測紅藍復(fù)合光可能通過調(diào)控DlHY5基因表達量進而影響類黃酮代謝產(chǎn)物的合成。

圖4 紅藍復(fù)合光配比對DlCHS、DlLAR和DlHY5基因表達的影響Fig.4 Effect of the ratio of red-blue composite light on the expression levels of DlCHS，DlLAR and DlHY5 of longan ECs

3 結(jié)論與討論

3.1 紅藍復(fù)合光有利于龍眼胚性愈傷組織生長及類黃酮和表兒茶素積累

光質(zhì)是調(diào)節(jié)控制植物生長及代謝的基本因素之一，可以調(diào)控大多數(shù)生物合成過程，不僅影響植物的初生代謝和生長狀態(tài)，也會影響植物的次生代謝過程。紅藍復(fù)合光有利于次生代謝產(chǎn)物的累積，能夠改善茄皮品質(zhì)并促進類黃酮合成[13]，提高韭菜類黃酮含量[14]。不同藍光和紅光配比能顯著地影響櫻桃番茄果實的品質(zhì)，藍光比例增大可促進櫻桃番茄果實番茄紅素、游離氨基酸和類黃酮的形成，增加糖酸比；紅光比例增大有利于可滴定酸的形成[30]。本研究也得到相似結(jié)論，紅藍復(fù)合光有利于龍眼胚性愈傷組織中類黃酮及表兒茶素合成，且藍光比例越大越有利于次生代謝物質(zhì)的合成。

3.2 紅藍復(fù)合光對龍眼胚性愈傷組織類黃酮合成基因的影響

CHS是類黃酮物質(zhì)生物合成途徑的關(guān)鍵酶。它介導(dǎo)了黃酮類化合物合成的第1步，并且具有功能多樣性，參與不同發(fā)育階段、組織特異性和環(huán)境響應(yīng)等方面調(diào)控，對類黃酮的合成起到極為關(guān)鍵的作用，不但對調(diào)控植物體內(nèi)黃酮類化合物的生物合成具有重要意義，還對提高植物體內(nèi)類黃酮物質(zhì)的產(chǎn)量具有非常重要的意義。CHS基因的表達受到多種因素的影響，如環(huán)境脅迫、光照、傷害、誘導(dǎo)劑，甚至中間產(chǎn)物如肉桂酸，這些都能影響CHS的表達水平；CHS和苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的表達量降低，糖和表兒茶素含量下降[31]。對擬南芥、芥菜、歐芹等植物研究表明，CHS啟動子含有光響應(yīng)元件ACE(ACGT containing element)和MRE(MYB recognition element)，受紫外光和藍光誘導(dǎo)表達[32-33]。

CHS基因在柑橘類黃酮生物合成中具有非常關(guān)鍵的作用，CHS基因的表達水平與類黃酮含量之間表現(xiàn)出很明顯的正相關(guān)關(guān)系[34]，表明CHS基因的表達水平與類黃酮含量是十分密切的。LAR基因?qū)τ诒韮翰杷氐恼{(diào)控極為重要，在龍眼胚性愈傷組織中能對表兒茶素物質(zhì)進行催化、轉(zhuǎn)化，對表兒茶素含量起到極大的促進作用，對表兒茶素的合成至關(guān)重要。LAR蛋白能夠催化兒茶素、無色花青素和相關(guān)的黃烷-3-羥基阿福豆素與沒食子兒茶素這些植物聚合型原花青素或者濃縮單寧合成起始物質(zhì)的合成。本研究也發(fā)現(xiàn)，DlCHS基因和DlLAR基因受到紅藍復(fù)合光的影響，紅光在一定程度上會抑制相關(guān)基因的表達，隨著藍光在紅藍復(fù)合光中所占比例的增加，類黃酮和表兒茶素含量也提高，這說明藍光會對龍眼胚性愈傷組織中類黃酮和表兒茶素合成基因的表達起到促進作用，有利于類黃酮合成。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子HY5參與紅藍復(fù)合光對龍眼胚性愈傷組織類黃酮代謝的調(diào)控

不同波長的光被植物體內(nèi)不同光受體感知，并通過光信號途徑調(diào)控植物生長發(fā)育和次生物質(zhì)代謝。HY5能夠受到光質(zhì)誘導(dǎo)表達。李慧峰等[35]研究表明，蘋果HY5能夠被白光、藍光、紫外光誘導(dǎo)，而紅光對HY5表達沒有明顯誘導(dǎo)。冀曉昊等[21]研究還發(fā)現(xiàn)，HY5在葡萄果實發(fā)育過程中有2次表達高峰，分別在花青苷快速積累期與果實成熟后期，說明HY5的表達還與發(fā)育進程有關(guān)，且與花青苷的積累呈正相關(guān)。已有研究表明，HY5可以誘導(dǎo)擬南芥花青苷合成轉(zhuǎn)錄因子MYB75/PAP1的表達[22]。VvMYBA1是擬南芥MYB75/PAP1的同源基因，其表達規(guī)律與VvHY5基本一致，說明紅藍復(fù)合光可能是通過光信號轉(zhuǎn)錄因子VvHY5調(diào)控VvMYBA1的表達，進而調(diào)控花青苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達，導(dǎo)致花青苷積累的差異。而在本研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著紅光在紅藍復(fù)合光中比例的增加，DlHY5表達也受到抑制，這就表明紅藍復(fù)合光能夠誘導(dǎo)龍眼胚性愈傷組織中DLHY5基因表達，進而影響類黃酮代謝產(chǎn)物的合成。